用于制备旨在预防球虫病的疫苗组合物的佐剂

摘要

本发明涉及疫苗佐剂，其基于100%其质量包含10%至95%的矿物油，所述矿物油包含：0.05质量%至10质量%的具有少于16个碳原子的烃链；0.05质量%至5质量%的具有多于28个碳原子的烃链。此外，所述佐剂具有2.5至3之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率，所述佐剂旨在用于生产预防球虫病的疫苗组合物。

说明书

本发明涉及用于制备旨在预防家禽中球虫病的疫苗组合物的新佐剂、 包含所述佐剂的疫苗组合物，以及特定矿物油用于生产所述佐剂的用途。

球虫病是家禽中常见的寄生虫疾病。

家禽是驯养的鸟类，通常属于鹑鸡类或蹼足类鸟类，由于其肉或蛋， 在传统农场中或者由工厂饲养场饲养。

表述家禽应理解意为：鸡、火鸡、鹅、鸭、珍珠鸡、鸽、鹌鹑、雉鸡、 鸵鸟。

病原（或者疾病的载体）是称为球虫（coccidium）的胞内原生动物寄 生虫，其主要属于艾美虫属（Eimeria）。

每一鸟类物种都存在几种类型的球虫：

鸡球虫：堆形艾美虫（E.acervulina）、尼氏艾美虫（E.necatrix）、 巨型艾美虫（E.maxima）、波氏艾美虫（E.brunetti）、禽艾美虫（E.tenella）、 和缓艾美虫(E.mitis)、塞前艾美虫（E.praecox）。

火鸡球虫：火鸡艾美虫（E.meleagrimitis）、腺样艾美虫（E. adenoeides）、散布艾美虫（E.dispersa）、孔雀艾美虫（E.gallopavonis）。

鹅球虫：树艾美虫（E.truncata）（其还可以影响麝香鸭和天鹅）、 鹅艾美虫（E.anseris）。

鸭球虫：恶性蒂泽虫（Tyzzeria perniciosa）、E.mulardi。该疾病特 别影响番鸭。

珍珠鸡球虫：E.numidia、E.grenieri（最常见但致病性较低）。

鸽球虫：唇艾美虫（E.labbeana）。

基于以下解决方法预防球虫病：

a)化学预防方法：

该方法使用抗生素类化学化合物并具有以下缺点：

-在用这些抗生素处理的动物中产生变态反应的风险，特别地因为 “残留物”或者这些抗生素中不期望的副产物的存在；

-在经处理的物种中对抗生素产生抗性的风险；

-受限制性规则的控制；

-损害了市售家禽肉类的外观，具有不再具有品质标签所宣称的在 “天然条件”下饲养的益处的风险。

b)涉及“活”疫苗的接种方法

通过在实验室中繁殖病原体直到其自然地或者通过突变人工地丢失 其致病特征，来制备获自减毒的活病原体的疫苗。

因此，获得的株系不能完全产生其以前引起的疾病。

然而，这些株系保留了其抗原，以及其诱导免疫应答的能力。

施用给动物后，接种疫苗的这种模式使得其可以定居在消化道并避免 具有致病因子的株系的植入。

接种疫苗的这种模式具有以下缺点：

-可能回复毒力；

-需要实施可能的病原细菌的大规模培养；

-通过该方法接种疫苗的动物可能排泄，因此构成了环境中可能的 致病源并因此可能播散这些病原体。

因此，后一缺点构成了为什么在户外饲养家禽的情况下，其对于针对 球虫病的免疫接种并不是优选的原因之一，所述球虫病为寄生虫病并因此 容易通过播散传播。

抗球虫疫苗是兽药。因此，可以对它们进行应用于兽药的立法，兽药 本身取决于对药物的立法。

在法国授权了三种抗球虫疫苗：它们是由“早期”株系组成的活疫苗， 其通过针对在田间发现的物种的免疫原性和保护性进行减毒。

这三种疫苗仅可用于鸡类物种（原鸡（Gallus gallus）），因为它们仅 含有能寄生该鸟类物种的物种，与球虫的不同物种不存在交叉免疫。

c)用非活体的或“灭活的”抗原免疫接种的常规方法

现存疫苗的效力并不令人满意，因为在寄生虫疾病，例如尤其是球虫 病的特定情况下，免疫应答的细胞组分的水平并没有高到足以诱导有效的 保护。

已经描述了许多编码艾美虫属抗原的cDNA，并且其中一些正在进行 免疫试验。抗性的产生还取决于遗传背景和施用的模式（以及取决于佐 剂）。一些抗原已经显示出部分保护作用。研究涉及为球虫的几种物种所 共有的抗原：例如与单克隆抗体反应的GX3262抗原，其识别鸡球虫的几 种物种所共有的子孢子抗原，诱导部分保护作用。

因此，存在改进这些灭活的疫苗组合物的需求。

灭活疫苗或含有经纯化的抗原的疫苗的研发越来越重要，因为其可以 在接种疫苗之前和之后，尽可能地在接种疫苗的受试者中避免不期望的副 作用。然而，以其免疫原性为代价，实现了抗原质量的改进。为此，将它 们与佐剂组合，使其可以在接种疫苗的受试者中增加免疫应答。

这些佐剂在本质上是不同的。它们可以例如由脂质体、包含至少一种 油相和至少一种水相的乳剂组成、由称为弗氏佐剂类型组成、更常见地由 水不溶性无机盐组成。在用作为疫苗组合物的佐剂的无机盐中，应当提及 的是例如氢氧化铝、硝酸铈、硫酸锌、胶态氢氧化铁或氯化钙。氢氧化铝 是最常用的佐剂。特别地，在Rajesh K.Gupta等人“Adjuvants，balance  between toxicity and adjuvanticity”，Vaccine，第11卷，第3期，1993年， 第993-306页的文章中描述了用作为疫苗组合物的佐剂的这些无机盐。

上述佐剂具有效力低下的缺点。此外，已知氢氧化铝仅可以有效地诱 导体液免疫，并不会诱导细胞免疫。此外，它们可能对受处理的受试者诱 导一定毒性。更具体而言，当将这些疫苗组合物注射到待接种疫苗的受试 者中时，在注射部位可能观察到病变和其他局部反应例如肉芽肿的形成。

由二价或三价金属盐组成的或者由拟交感神经化合物组成的其他佐 剂分别描述于在公开号WO96/32964、WO98/17311和WO98/15288下公 开的国际专利申请中。

乳剂是由两种不混溶流体的系统组成的稳定混合物，其中一种被分成 另一种中的小滴。因此，乳剂包含油、水相和表面活性剂，所述表面活性 剂具有将两相中的其中一相分散在另一相中，并且获得在宏观上均匀且稳 定的混合物的作用。在疫苗制剂中，通常将它们用作为免疫佐剂。将矿物 油用作为疫苗佐剂已经已知多年（Freund 1956，Herbert 1967）。用作为 疫苗佐剂的矿物油是液态烃，其通过蒸馏石油并通过随后的处理步骤，例 如脱硫、脱沥青、提取芳族化合物、提取蜡和其他最终处理步骤获得。油 的质量对免疫应答的影响的研究才刚刚开始，并且还不完善。事实上，所 使用的原油的地理来源以及用于其制备的方法（化学方法和设备）极大地 影响了矿物油的组合物。对多种级分实施的研究旨在评价其对工作人员、 使用者的毒性，而并不是评价其在动物或人类健康中的用途。基于宏观特 征（粘度、熔点），用现存的工业级矿物油或者纯的实验室级化学产品实 施这些矿物油的组成的优化，所述现存的工业级矿物油或者纯的实验室级 化学产品与可接受的原材料的等级的定义或表征并不对应。因此，即使对 由参数定义的工业级矿物油实施了大量的研究，但所述参数并不反映其所 导致的生物学性质，以及在用于疫苗期间，取决于矿物油的批次的来源， 造成行为的改变。尽管这些批次与宏观分析要求和说明一致，并具有相同 的商标名，但具有足够不同的组成，以致不给予疫苗相同的特性。此外， 获自矿物油的乳剂的粘度，在没有盖伦优化的情况下，会导致结果解释的 偏倚。

评价了直链和环化链之间分布的影响，以便评估通过注射使用矿物油 期间可能的毒性，推测环化形式的致畸作用。然后，将毒性的标准定义为 来自不饱和形式的毒性，所述不饱和形式在当前方法中已经通过大量的氢 化作用完全除去。

还没有实施研究以旨在评价线性或环化型的构成比率对免疫应答的 质量的影响。

矿物油作为佐剂已经使用了几十年，并用于旨在增加疫苗的免疫应答 效力的佐剂的制备。事实上，在矿物油包水（W/O）型的乳剂中预先乳化 抗原，并然后通过胃肠外途径施用，引发更强烈且持久的免疫应答（并因 此提供针对病原体的保护）。

用于制备佐剂的矿物油的性质对免疫应答的强度，以及与疫苗的注射 有关的继发反应（局部和全身反应）具有强烈的影响。

存在两种类型的免疫应答：

-体液免疫应答：

其是这样的反应，当具有特定受体的B淋巴细胞受抗原刺激时，其分 化成开始分泌抗体的浆细胞的克隆。它们对于在血液和淋巴中循环的病原 体是有效的。此外，B淋巴细胞的选择性活化给予了机体具有延长寿命的 记忆细胞，所述记忆细胞介入二次免疫应答，和

-细胞免疫应答

体液免疫反应帮助防御网络识别和破坏游离的病原体，但细胞介导的 反应与已经进入细胞的病原体战斗。细胞介导的免疫的主要行动者是T淋 巴细胞。

T淋巴细胞仅与暴露在机体细胞表面的抗原决定簇反应。T淋巴细胞 通过其受体（嵌在其质膜中的表面蛋白质中）识别这些决定簇。T淋巴细 胞的受体识别与机体的MHC的一个糖蛋白结合的抗原。除了其在体液应 答中的作用外，辅助T淋巴细胞还可以活化其他类型的T淋巴细胞，以引 发针对抗原的细胞介导的反应。细胞毒性T淋巴细胞是唯一杀死其他细胞 （被胞内病原体感染的细胞）的细胞。

熟知的是增加免疫应答（一般通过测定1型或IGG1型免疫球蛋白来 测量）的体液组分的油性佐剂，而很难获得细胞型应答（通过IGG2间接 测量）。

已知给予最强的免疫应答的W/O乳剂还诱导细胞型组分，但以例如 比一些可溶性分子（皂苷或阳离子表面活性剂型）更低的比例诱导，认为 所述可溶性分子使应答朝向细胞机制。

使用一般市售矿物油的具有含水连续相的乳剂是细胞应答的非常差 的促进剂。

事实上，由疫苗产生的应答的类型受抗原的结构影响，另外，还受抗 原通过佐剂递呈给免疫系统的方式的影响。佐剂对免疫应答具有不同的作 用，因为它们可以在更长或者更短的时间期间诱导免疫应答，主要特征为 细胞型或体液型。

细胞介导的免疫是重要的，或者甚至在一些时候对于防护胞内细菌、 病毒和大多数寄生虫是基本的。其作为体液应答的补充，参与了大多数疫 苗保护机制。

例如，可以在给相关受试者接种疫苗后的不同时间，通过比较将包含 佐剂的疫苗肠胃外施用给所述受试者后测量的IGG1/IGG2比率，针对包 含佐剂的疫苗组合物，分类佐剂诱导细胞型免疫应答的能力。该比率越高， 佐剂就越将疫苗组合物的免疫应答朝向体液组分。IGG1/IGG2比率的值接 近1将被认为疫苗组合物在两种组分之间具有平衡的免疫应答的标志。 IGG1/IGG2比率的值低于1将是疫苗组合物的免疫应答主要为细胞型的 特征。

本发明的一个目的是为疫苗组合物的制备提供有用的佐剂，其旨在改 进免疫应答的细胞组分，同时维持高水平的体液组分。因此，存在获得具 有平衡的免疫应答或者甚至主要为细胞免疫应答的疫苗佐剂的需求。此 外，用本发明的主题佐剂制备的疫苗应当表现出好的安全性。

为此，本发明的主题是疫苗佐剂，其包含100%其质量的：

-10%至95%，和优选地20%至90%的矿物油，所述矿物油包含：

-0.05质量%至10质量%的具有少于16个碳原子的烃链；

-0.05质量%至5质量%的具有多于28个碳原子的烃链；

-和2.5至3之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量 与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率。

用于产生旨在预防球虫病的疫苗组合物。

此外，本发明的实施方案包含一个或一个以上的以下特征：

如上所定义的佐剂，用于产生旨在用于动物，特别是家禽中球虫病的 预防的疫苗组合物。

如上所定义的佐剂，其特征在于所述P/N比率在2.5至3之间，优选 地在2.8至2.9之间。

如上所定义的佐剂，其特征在于其另外包含：

-5%至90%的至少一种表面活性剂。优选地5%至50%。

根据另一方面，本发明的主题是旨在预防球虫病的疫苗，其包含如上 所定义的佐剂和至少一种抗原。

此外，本发明的实施方案包含一种或一种以上的以下特征：

-如上所定义的疫苗，旨在用于动物，特别是家禽中球虫病的预防，

-如上所定义的疫苗，其特征在于球虫选自艾美虫属、等孢子虫属 （Isospora）、弓形体属（Toxoplasma）、贝斯虫属（Besnoitia）、新孢子 虫属（Neospora），优选地艾美虫属。

-如上所定义的疫苗，其特征在于其为油包水（W/O）型乳剂的形 式，和

-如上所定义的疫苗，其特征在于抗原是包含堆形艾美虫(Eimera  acervulina)序列3-1的重组蛋白质。

根据另一方面，本发明的主题是矿物油用于产生如上所定义的疫苗的 用途，其特征在于所述油包含100%其质量的：

-0.05至10%具有少于16个碳原子的烃链；

-0.05%至5%具有多于28个碳原子的烃链；并具有2.5至3之间， 优选地2.8至2.9之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量 与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率。

根据本发明的组合物还有利地含有一种或一种以上乳化表面活性剂。 后者表现出亲脂性或者亲水性特性，其特征在于1至19之间的HLB（亲 水性-亲脂性平衡）值。

该表面活性剂可以由以下组成

-烷基多糖苷或者式R_a-(O)-Zn的烷基多糖苷的混合物，其中R_a表 示包含4至24个碳原子的线性的或分支的饱和脂族基，Z是糖残基，优选 地葡萄糖残基，并且n在1至5之间，优选地在1.1至2之间，

-皂苷，

-山梨醇酐酯，例如失水山梨糖醇油酸酯、失水山梨糖醇硬脂酸酯、 失水山梨糖醇棕榈酸酯、失水山梨糖醇月桂酸酯；

-一缩甘露醇酯，例如一缩甘露醇油酸酯、一缩甘露醇硬脂酸酯、一 缩甘露醇软脂酸酯、一缩甘露醇月桂酸酯；

-含5mol至20mol之间环氧乙烷的聚氧乙烯化山梨醇酐酯，例如含 20mol环氧乙烷的乙氧基化失水山梨糖醇油酸酯；

-含5mol至20mol之间环氧乙烷的聚氧乙烯化一缩甘露醇酯，例如 含20mol环氧乙烷的乙氧基化一缩甘露醇油酸酯；

-卵磷脂；

-聚氧乙烯化烷醇，例如那些在名称BRIJ和更具体地BRIJ 21和 BRIJ 221下，由UNIQEMA公司销售的聚氧乙烯化烷醇；

-包含聚氧乙烯化和聚氧丙烯化嵌段的表面活性剂聚合物，例如那些 在名称PLURONICS下，由BASF公司销售的表面活性剂聚合物；

-聚乙二醇或聚乙二醇聚羟基硬脂酸酯，例如由公司UNIQEMA销 售的称为HYPERMER^TM B246、ARLACEL^TM P135的产品。

表述抗原应理解为具有免疫原性特性的任一分子，其能诱导特异性免 疫应答。这些抗原可以是灭活的病原体，例如灭活的细菌、提取自病原体 的分子、通过微生物的基因重组产生的分子。

矿物油获自石油来源的产物的蒸馏，然后大量氢化。它们由饱和烷烃 家族的化学分子组成。对于这种类型的分子，碳原子的数目一般多于9并 少于30，从而在25℃赋予液体外观。也使用表述液体石蜡。固体石蜡由n 大于30，直到多达50的烷烃家族的化学分子组成，并从而在25℃赋予固 体外观。液体石蜡，或者矿物油是透明无气味的液体，其动态粘度为2毫 帕.秒（mPa.s）至1毫帕.秒。矿物油的动态粘度直接与构成所述矿物油的 烷烃的碳链的平均长度相关。具有最长烃链的烷烃是造成最高动态粘度的 原因。涉及的分子可以为分枝的线性或烃线性链（在名称“石蜡（P）”或 环化的（环烷N）下分类）形式，但仍然是饱和的（没有双键，其在氢化 处理期间消除）。粘度、熔点和沸点直接与烃链所含有的碳的数目相关。 因此，石蜡油的特征在于其蒸馏范围、其动态粘度、其碳原子的平均数目， 以及在于其线性和分支分子之间的P/N比率和环化分子的数量（根据DIN 51378方法测定）。应当理解，可以通过混合两种不同的馏分，人为地修 饰动态粘度标准。

实施例

I)第一部分

以下实施例可以说明根据本发明的佐剂组合物的特性。

在该工作中，对多种较好表征的油的佐剂性质的研究使得可以鉴定新 的原始组合物，所述新的原始组合物的特征在于通过层析建立的组成的限 制。

在第一个实例中，用以油包水（W/O）乳剂形式提供的制剂在实验性 疫苗组合物上实施的研究使得可能对于在小鼠中良好耐受的制剂，为获得 其两种组分之间的平衡免疫应答以及具有主要为细胞组分的免疫应答建 立最佳条件。实验性试验的第二阶段在其他类型的制剂和不同的动物上实 施，其可以说明，为本发明主题的佐剂组合物可以定量和定性的提供最佳 免疫应答。

在以下实例中，通过以下特征选择矿物油：

●以百分比表述的短馏分（short fraction）（SF），相当于具有碳原 子C数<16的实体的比例。

●以百分比表述的重馏分（heavy fraction）（HF），相当于具有碳 原子C数>28的实体的比例。

●分子分布（MD）（表述为碳原子C的数目），计算为通过将同化 到18个碳原子的馏分C16到C20、同化到22个碳原子的20个碳原子到 24个碳原子的馏分和同化到26个碳原子的24个碳原子到C28馏分的表面 系数进行分配所得到的C16到C28之间曲线的重心。

●P/N比率（根据标准方法DIN 51378获得）。

测试的多种油列表于表1中。

  油编号   SF（<C16）   MD   HF（>C28）   P/N   1   13.7   20.6   3.3   1.78   2   4.9   21.5   7.1   1.86   3   4.2   20.5   1.5   1.86   4   4.4   21.6   4.7   1.86   5   47.7   18.4   0.5   1.86   6   0.3   22.2   9.6   2.03   7   30   18.3   0.6   2.19   8   16   21.8   10   2.13   9   2   19.3   2.2   2.85   10   48.2   18.4   0.6   1.86   11   8.6   20.7   2.4   1.94   12   20.8   21.9   8.7   1.86

表1：用于生物学试验而合成和表征的油的列表

对油包水W/O乳剂形式的研究

制剂以不完全弗氏佐剂（IFA）型模型制备，在疫苗乳剂中以50%使 用，所述乳剂由于其通式的简单性（二缩甘露醇单油酸酯15%+矿物油 85%）而允许合适的比较。

然后，在小鼠模型中对如此配制的疫苗（50%IFA+50%10μg/剂量卵 白蛋白的等渗溶液；1剂量=100μl的乳剂）的生物学特性比较安全性参数 （表2）和体液或细胞应答的效力。

通过在接种后观察注射部位7天，并以0至4的等级范围对局部反应 （LR）打分来评价安全性。值为0至2是可接受的（其是在没有脱发、没 有明显硬结或可见注射部位的情况下，最大的油性沉积），值大于2为不 期望的并且是不可接受的（其涉及坏死、脱发、可触及的硬结）。将结果 一起分组于表2中；将在W/O制剂的制备中测试的矿物油根据其SF分类。 明显显示，包含具有SF<13.7的矿物油的W/O制剂适合于制备用于注射 的疫苗组合物。

  油编号   SF(<C16)   MD   HF(>C28)   P/N   IR   1   13.7   20.6   3.3   1.78   2.5   2   4.9   21.5   7.1   1.86   0.5   3   4.2   20.5   1.5   1.86   0   4   4.4   21.6   4.7   1.86   0.5   5   47.7   18.4   0.5   1.86   4   6   0.3   22.2   9.6   2.03   0   7   30   18.3   0.6   2.19   3   8   16   21.8   10   2.13   2.5   9   2   19.3   2.2   2.85   0   10   48.2   18.4   0.6   1.86   4   11   8.6   20.7   2.4   1.94   0.5   12   20.8   21.9   8.7   1.86   3

表2：多种油的安全性的评价

然后在小鼠模型中测试所选择的制剂的免疫效力。将给出了不可接受 的反应的制剂去除。表3和4显示了与氢氧化铝参照（用于兽药和人类药 物的固体无机佐剂）比较，获得的抗体滴度。在第一次注射日期后的第 14/28/42/56/90天，给出了体液（IGG1）和细胞（IGG2）应答的滴度。在 记录抗体滴度后，在第28天进行制剂的第二次注射。长期应答（90天） 的结果显示，在第90天重馏分的低值与体液免疫的强度之间强烈的相关 性。当该馏分大于4.7%（7.1%和9.6%）时，应答显著地降低。

这些结果表明，含有小于10%的SF、小于5%的HF和P/N比率大于 或等于1.9的W/O乳剂形式的用于疫苗佐剂的矿物油诱导了好的细胞型应 答。

表3：在小鼠中，对于多种油，在以W/0乳剂形式注射后，随时间而 变针对OVA的IgG1型抗体应答。

表4：对于多种油，在以W/0乳剂形式注射后，在小鼠中针对OVA 的IgG2型抗体应答。

对含水连续相乳剂形式的研究

测试了两种代表含水连续相乳剂的盖伦类型（W/O/W复合乳剂和 O/W微乳剂）。

水包油微乳剂：

对于100%其质量，佐剂制剂包含，40质量%的亲水性表面活性剂（聚 山梨酯80）和60质量%的待测试的矿物油；然后在包含抗原（OVA）的 水相存在的情况下，通过高压匀浆器，室温乳化配制的油相；在最终的疫 苗组合物（OVA 10μg/剂量，每次注射100μl）中，使用10质量%的以前 制备的油相；在试验中包括了氢氧化铝的对照。结果显示于表5中。IGG1 应答的低强度与HF的存在直接相关，所述HF抑制短期应答（第28天， D28）和长期应答（第90天，D90）。

同样地，表6显示了IGG2滴度。

结果显示P/N比率和IGG2应答之间的相关性；制剂6和9优于其他 产品。

表5：在小鼠中，对于O/W微乳剂形式的多种油，随时间而变针对 OVA的IgG1型抗体应答

表6：在小鼠中，对于O/W微乳剂形式的多种油，随时间而变针对 OVA的IgG2型抗体应答。

IgG1/IgG2比率的比较清楚显示了与其他油比较，用油9和油6（差 异程度较小）接种的组的应答行为的差异（表7）。

表7：在小鼠中，对于O/W微乳剂形式的多种油，随时间而变针对 OVA的IgG1/IgG2比率。

水包油包水（Water-in-oil-water）（W/O/W）复合乳剂:

此次，佐剂制剂包含具有亲水亲脂平衡值（HLB）=9的脱水甘露醇十 八烯酸醚（anhydromannitol octadecenoate ether），其以15质量%分散 在待测试的矿物油中。通过在30℃搅拌，制备疫苗组合物，一份重量为佐 剂，一份重量为包含抗原OVA的抗原性介质（水相）。

小鼠上的试验：在表8和9中分别显示了小鼠试验的IGG1应答和 IGG2应答的结果。对于细胞应答，IGG2应答的值的差异显示，油9诱导 了强烈的且持久的应答，特别是在28天后。

牛模型上的试验：在该情况下，在用2ml皮下注射的5只牛上测试相 同的疫苗；比较制剂9和11。结果显示在表10中。没有观察到IGG1滴 度的差异（数据未显示）。与仅抗原比较，观察到了强的佐剂作用。使用 油9的IGG2应答非常强烈，使用油11的IGG2应答较低，并且仅抗原时 不存在IGG2应答。

表8：在小鼠中，对于W/O/W乳剂形式的多种油，随时间而变针对 OVA的IgG1型抗体应答。

表9：在小鼠中，对于W/O/W乳剂形式的多种油，随时间而变针对 OVA的IgG2型抗体应答。

表10：在牛中，对于W/O/W乳剂形式的油9和11，随时间而变针对 OVA的IgG2A型抗体应答。

为了改进免疫应答的细胞组分，应当：

-A)获得以IgG1/IgG2比率在0.25至4之间为特征的免疫应答，和

-B)获得细胞组分也强烈的免疫应答，即以在施用的疫苗加强后28 天后并在当日测量IGG2滴度后，大于或等于32000的IgG2为特征（二 次和长期应答）。

A-IgG1/IgG2比率

a)在疫苗佐剂为W/O/W乳剂形式的情况下，IgG1/IgG2实验结果如下：

●对于油6：40（D14）、16（D28）、5.3（D42）、16（D56） 和160（D90）。

●对于油11：53.3（D14）、107（D28）、107（D42）、107（D56） 和107（D90）。

●对于油9：1.7（D14）、4（D28）、1（D42）、0.5（D56）和 0.5（D90）。

油9可以在第28天接种加强剂量之前和之后获得0.25至4的 IgG1/IgG2比率（在测量免疫应答后施用在第28天进行的接种加强剂量）。

b)在疫苗佐剂为O/W微乳剂形式的情况下，本发明的说明包括以下IgG1/IgG2实验结果：

■对于油6：1（D14）、1（D28）、2（D42）、6（D56）和8 （D90）

■对于油11：16（D14）、3（D28）、5（D42）、256（D56） 和64（D90）

■对于油9：4（D14）、2（D28）、1（D42）、1（D56）和1 （D90）

对于油9，在第D28天接种加强剂量之前仍然获得了0.25至4之间的 IgG1/IgG2比率，并随时间保持恒定。

对于油6，在接种加强剂量（初次应答）之前也获得了0.25至4之间 的IgG1/IgG2比率，但在二次应答（第28天接种加强剂量后）和长期应 答（第90天）的测量期间，并没有随时间持续。

对于油11，二次应答和长期应答都没有观察到0.25至4之间的 IgG1/IgG2比率。

c)在疫苗佐剂为W/O乳剂形式的情况下，本发明的说明包括以下IgG1/IgG2实验结果：

■对于油9：1（D14）、1（D28）、1（D42）、1（D56）和1 （D90）

所有这些记录结果都显示了IgG1/IgG2比率的良好结果。

B-IgG2应答的强度

a)在疫苗佐剂为W/O/W乳剂形式的情况下，IgG2实验结果如下（表9）：

a.对于油6（D14）、4000（D28）、12000（D42）、4000（D56） 和400（D90）

b.对于油11：300（D14）、600（D28）、1200（D42）、1200（D56） 和1200（D90）

c.对于油9：9600（D14）、16000（D28）、128000（D42）、256 000（D56）和256000（D90）

油9使得其可以在接种加强剂量施用28天后，获得强烈的细胞应答(根 据以前定义的标准）。

b)在疫苗佐剂为O/W微乳剂形式的情况下，本发明的说明包括以下IgG2实验结果（表6）：

a.对于油6：4800（D14）、16000（D28）、32000（D42）、8 000（D56）和4000（D90）

b.对于油11：600（D14）、16000（D28）、24000（D42）、1000 （D56）和40000（D90）

c.对于油9：1600（D14）、32000（D28）、48000（D42）、96 000（D56）和96000（D90）

油9可以在二次应答（接种加强剂量后）和长期应答（第90天）具有 强烈的细胞应答（根据以前定义的标准）。

c)在疫苗佐剂为W/O乳剂形式的情况下，本发明的说明包括以下IgG2实验结果（表4）：

a.对于油9：9600（D14）、16000（D28）、128000（D42）、256 000（D56）和256000（D90）

所有这些记录的结果都显示出IgG2应答的良好结果。

根据这些结果，清楚显示，本发明的主题是旨在用作为注射用的疫苗 佐剂的矿物油的组合物，例如油9，其具有以下特征：

●SF<10%和HF<5%；

●P/N在2.5至3之间（此处为约2.85）；

在W/O和W/O/W乳剂以及O/W微乳剂形式中都确保对于体液应答 和强烈的细胞应答良好的安全性、良好的效力。

II)第二部分

试验系列1：在“鸡”模型上的实验工作

在所使用的实验性试验的上下文中，每一制剂的应答效力基于以下标 准：

a)血清中的抗体滴度；

b)注射部位白细胞的浸润；

c)处理后两周，在用10000个堆形艾美虫（Emeria acervulina）的卵 囊接种的动物中存在的毒力攻击，并比较：

a.动物的体重增加

b.排泄的寄生虫的数量。

表11显示了测试的多种制剂

  组别   A   B   C   D   E   F   乳剂   W/O   W/O   W/O/W   W/O/W   CFA   没有乳剂   油   1   2   1   2   标准矿物质   没有油

表11

实验性试验中所涉及的油的特征在于下表。

  油编号   SF(<C16)   MD   HF(>C28)   P/N   LR   标准矿物质   4.9   21.5   7.1   1.86   0.5   油1（O1）   2   19.3   2.2   2.85   0   油2（O2）   8.6   20.7   2.4   1.94   0.5

组A和B的制剂，即W/O1乳剂（组A）和W/O2乳剂（组B）包含 100%其质量的：

-30质量%的含抗原和水的水相

-70质量%的油性佐剂，所述油性佐剂包含100%其质量的：

○  15质量%的一缩甘露醇油酸酯

○  85质量%的油（油1或油2）

抗原，蛋白质3-1E在这些制剂中以这样的比例存在，所述比例使得所 注射的制剂的剂量包含50μg的抗原，注射的制剂的剂量的体积为100μL。

组C和D的制剂，即W/O1/W微乳剂（组C）和W/O2/W微乳剂（组 D）包含100%其质量的：

-90质量%的包含抗原和水的水相

-10质量%的油性佐剂，所述油性佐剂包含100%其质量的：

○  40质量%的含20mol环氧乙烷（聚山梨酯80）的乙氧基化失水山 梨糖醇油酸酯

○  60质量%的油（油1或油2）。

抗原，蛋白质3-1E在这些制剂中以这样的比例存在，所述比例使得所 注射的制剂的剂量包含50μg的抗原，注射的制剂的剂量的体积为100μL。

就血清中抗体滴度而言，除仅具有蛋白质的组（组F）外，所有测试 组都具有高的且等同的血清抗体。每一组获得的体液应答都具有高的且满 意的水平（结果未显示）。

就注射部位白细胞的浸润而言，通过对各组的组织切片进行间接免疫 荧光，评价所述白细胞（淋巴细胞和巨噬细胞）的局部浸润强度。

在注射部位，对每组3只动物进行活组织检查，以从这些动物中获得 的皮肤样品。在第二次免疫所述动物后，即在第一次免疫后28天，进行活 组织检查。这些免疫包括注射抑制蛋白和所测试制剂的混合物。在相同的 操作条件下，也实施包括注射抑制蛋白但没有疫苗介质的对照。然后，将 获得的样品立即冷冻在含液氮的介质中并储存于-20℃。然后，将每一样品 的5μm切片置于已经预先清洁的载物台上，并在4℃温度下，在丙酮中洗 涤20分钟，并在20℃温度下，用10%马血清“固定”20分钟。加入1/200 稀释的鸡CD8抗体，并然后将得到的混合物在室温（20℃）温育2小时。 然后用磷酸缓冲液洗涤载物台并在室温（20℃）用1/500稀释的鸡IgG第 二抗体“Alexa Fluor 488-标记的抗鸡”（由公司Carlsbad在名称Invitrogen 下销售）温育2小时。然后将载物台与比色指示剂Fluoromount-G接触， 并用电子显微镜（由公司Carl Zeiss以名称LSM 510META销售）检查。

使用该方案，根据以下等级，通过评分评估CD8+细胞的显影：

-等级“0”：没有观察到CD8+细胞的点，

-等级“+“：观察到低密度CD8+细胞的存在，

-等级“++”：观察到高密度CD8+细胞的强烈的存在，和

-等级“+++”：观察到极高密度CD8+细胞的非常强烈的存在。

在注射部位观察到的淋巴细胞和巨噬细胞的量和密度越高，所测试的 疫苗产生有效的免疫应答的能力越强。

获得的结果显示于表12中

  组别   A   B   C   D   E   F   佐剂   W/O1   W/O2   W/O1/W   W/O2/W   CFA   没有佐剂   抗原   是   是   是   是   是   是   淋巴细胞   +++   +   ++   ++   +   0   巨噬细胞   ++   +   +   +   +   0

表12

与包含现有技术的佐剂的疫苗比较，对于组D、C和A，本发明疫苗 提高了注射部位淋巴细胞的产生；而对于巨噬细胞，只有组A的本发明疫 苗使得能够提高巨噬细胞的产生，并且本发明的其他疫苗在注射部位都获 得了与包含现有技术的佐剂的疫苗类似的巨噬细胞的产生结果。

就毒力攻击而言，疫苗的有效保护意为：

-与未接种疫苗和未受攻击的对照比较，动物表现出类似的体重增 加；

-与受攻击的和未接种疫苗的动物比较，动物表现出寄生虫载量（通 过排泄的寄生虫的数量评价）的降低。

总之，毒力攻击对应于施用精确的和受控剂量的病原体，所述动物以 前已经对所述病原体接种免疫。根据多种标准，作为动物模型和病原体的 特性的函数，评价由实验性疫苗诱导的保护。

在毒力攻击后监测两个主要的标准：

-感染后10天，动物体重的增加，和

-排泄的病原体的数量的减少。

○  感染后10天，动物体重的增加

表13总结了接种疫苗和用鸟球虫（使用的株系为堆形艾美虫）感染鸡 期间获得的结果。该株系的致病性很高，并导致受感染的动物的体重增加 的改变。

表13：毒力攻击后，不同组的体重增加。

可以看出，对于受攻击的受试者，就体重增加而言，在没有佐剂的情 况下接种疫苗并没有诱导保护：因为没有佐剂（组F）和没有疫苗（组G） 的对照导致了类似的结果。

与受攻击的和未接种疫苗的受试者（组G）比较，除组D的疫苗外， 包含基于油O1和O2的佐剂的本发明疫苗允许显著的体重增加。

与包含现有技术的佐剂的疫苗（组E）比较，除了W/O2/W乳剂形式 的疫苗（组D）外，本发明疫苗诱导了更高的体重增加。

应当指出，包含基于油1的佐剂的本发明疫苗比包含基于油2的佐剂 的本发明疫苗诱导了更高的体重增加。

对于组A的本发明疫苗，体重增加仅比未受攻击的受试者的体重增加 低1.9%。

此外，对于所考虑的每一矿物油（O1或O2），应当理解，配制成水 /油乳剂的实验性疫苗要比水/油/水制剂更具保护性：

-对于油1，W/O1乳剂形式的疫苗（组A）的体重增加为834g，即 与没有佐剂的组的动物（组F）比较，体重增加了99g，而对于W/O1/W 乳剂形式的疫苗，体重增加（组C）为802克，并且与没有佐剂的组的动 物（组F）比较，给予了67g的体重增加。

-对于油2，W/O2乳剂形式的疫苗（组B）的体重增加为798g，即 与没有佐剂的组的动物（组F）比较，体重增加了63g，而对于W/O2/W 乳剂形式的疫苗，体重增加（组D）为740克，并且与没有佐剂的组的动 物（组F）比较，给予了5g的体重增加。

○排泄的病原体的数量的减少

获得的结果显示于表14中。

结果表示为排泄的卵囊的数量的减少（动物感染得越多，它们排泄得 越多，因此它们受到的保护越少）。

表14

因此，与组F中的对照（有抗原，但没有佐剂）比较，本发明疫苗诱 导了平均排泄数量的减少。

与组E（抗原+现有技术的佐剂）比较，组1的本发明疫苗给出了平均 排泄数量的减少。

此外，组A的标准差是最低的，表明接种疫苗的动物的更均一应答。 该标准是要点，因为其意味着通过疫苗的效力消除了动物的生物学应答的 个体敏感性。

结论试验1

包含本发明佐剂的疫苗可以提供改进的免疫应答和更好的效力，用于 保护家禽免于球虫病。

此外，本发明疫苗以W/O1乳剂的形式，其中O1的特征在于P/N比 率>2，具有在注射部位刺激更多的白细胞产生，以及在用堆形艾美虫株系 进行毒力攻击后，调节最高的体重增加和卵囊排泄的非常显著的减少的优 点。

试验系列2：考虑到试验系列1及其结论，即对疫苗更好性能的观察， 所述疫苗包括：

-包含堆形艾美虫序列3-1的重组蛋白质

-油1

-水

-表面活性剂系统

并以W/O乳剂形式提供，本发明人实施了两种类型的毒力攻击：

-堆形艾美虫（AE）株系的毒力攻击，

-禽艾美虫（Emeria tenella）（ET）株系的毒力攻击。

测试的制剂，即W/01乳剂，包含100%其质量的：

-30质量%的包含抗原和水的水相

-70质量%的油性佐剂，其包含100%其质量的：

○ 15质量%的失水甘露醇油酸酯；

○ 85质量%的油（油1或油2）。

抗原，蛋白质3-1E在这些制剂中以这样的比例存在，使得所注射的制 剂剂量包含30μg的抗原，注射的制剂剂量的体积为100μL。

为了鉴定交叉保护，扩大所测试的实验性疫苗的特性。事实上，如此 诱导的细胞型免疫应答可以保护免于多种寄生虫的株系的损害。

使用的蛋白质剂量为30μg/ml。通过每只鸟施用10000个卵囊进行毒 力攻击（表15）。

然后监测动物的体重增加、抗体、抗原再刺激或者用有丝分裂原再刺 激后脾淋巴细胞的增殖（以定量细胞应答）和毒力攻击期间的保护的参数。

堆形艾美虫（E.acervulina）：其是中度致病的。

病灶位于小肠，特别地十二指肠，具有发白的斑点以及随后在粘膜中 的斑纹=“成比例的”病灶。病灶由卵囊引起。

禽艾美虫（E.tenella）是最致病的球虫，病灶由裂殖体引起。

病灶位于盲肠，其充满了血液，可能破裂或者坏疽。宿主可能贫血。 死亡率通常很高。

表15描述了测试的多个组。

表15

CFA：完全弗氏佐剂（现有技术的佐剂）

然后根据以下不同标准监测多个组中的经疫苗接种的鸡：

a)体重增加；

b)抗体滴度的产生（血清学）；

c)在接种疫苗（或免疫）后48小时，在脾细胞样品上通过间接免疫 荧光法评价白细胞（淋巴细胞）局部浸润的强度。这些免疫包括注射抑制 蛋白和测试的制剂的混合物。对照包括在相同的操作条件下进行没有疫苗 介质的抑制蛋白的注射。所使用的方法与上述在来自动物的皮肤样品上所 使用的方法相同，即：

-将收集的脾细胞样品保存于-20℃

-将脾细胞样品置于载物台上，并在20℃用丙酮洗涤20分钟

-加入1/200稀释的CD8抗体，并随后在20℃温育2小时

-用磷酸缓冲液洗涤获得的载物台，并随后在室温（20℃）用1/500 稀释的鸡IgG第二抗体“Alexa Fluor 488标记的抗鸡”温育2小时

-与比色指示剂Fluoromount-G接触

-用电子显微镜检查（由公司Carl Zeiss以名称LSM 510META销 售）。

使用该方案，根据以下等级，通过评分评估CD8+淋巴细胞的显影：

-等级“0”：没有观察到CD8+细胞的点，

-等级“+“：观察到低密度CD8+细胞的存在，

-等级“++”：观察到高密度CD8+细胞的强烈的存在，和

-等级“+++”：观察到非常高密度CD8+细胞的非常强烈的存在。

d)排泄的卵囊的数量。

结果：

-体重增加：用W/O1乳剂形式的疫苗接种的组的特征在于，体重 增加与其他组所观察到的体重增加类似（结果未显示）；

-血清学：抗体滴度的大量产生，高于用具有CFA作为佐剂的疫苗 接种的组所观察到的抗体滴度且高于用没有佐剂的疫苗接种的组所观察 到的抗体滴度（结果未显示）；

-淋巴细胞的增殖：对于用W/O形式并且包含具有油O1的佐剂的 疫苗接种的组H和I，获得了最高的得分。

-排泄的卵囊数：

表16和17显示了分别用堆形艾美虫和禽艾美虫进行毒力攻击的组排 泄的卵囊的数量的结果。

  组别   B   D   F   H   平均值(X 10E 8)   3.44   3.33   3.30   2.71   标准差   0.50   0.67   0.89   0.27

表16：用EA株系毒力攻击后排泄的结果

  组别   C   E   G   I   平均值(X 10E 8)   1.49   1.20   1.11   0.95   标准差   0.23   0.27   0.42   0.13

表17：用ET株系毒力攻击后排泄的结果。

对于两种株系，用包含基于O1的佐剂的疫苗接种的组表现出比用包 含现有技术的佐剂（CFA）的疫苗接种的组中所观察到的排泄平均值更低 的排泄平均值。与用不含佐剂的疫苗接种的组（组D和E）比较的结果也 同样如此。