聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯嵌段共聚物的合成方法

摘要

本发明涉及一种聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯嵌段共聚物的合成方法。采用的技术方案是：将适量的端氨基聚磷酸乙酯和L-谷氨酸-苄酯环内酸酐分别溶解于CH2Cl2中，然后混合，室温下搅拌反应12~48h，反应结束后，将产物滴加到乙醚中沉淀，2℃静置12~18h，过滤，沉淀于30℃真空干燥得目标产物。通过本发明得到了具有两亲性的聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯嵌段共聚物，可在水溶液中自组装形成内核疏水、外壳亲水的胶束，能够把疏水性药物分子组装到其疏水的核中，具有提高药物在血液中的循环时间等作用，在药物的控制释放和靶向药物传递等生物医用领域具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于化学合成领域，具体地涉及一种聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG-b-PEEP）嵌段共聚物的合成方法。

背景技术

聚氨基酸是一类具有低毒、生物相容性好、容易被机体吸收和代谢等优点的生物降解高分子，因此在医学领域如药物控释、组织工程等方面具有广泛的应用。但是其均聚物的水溶性较差，其应用具有一定的局限性。

聚磷酸酯是主链骨架类似于核酸和磷壁质酸的高分子材料，主链上的磷酸酯键具有在生理条件下易水解或酶促分解的特点，具有良好的可降解性、生物相容性及低毒性，并且在一定条件下表现出温敏性，可应用于药物控释、基因载体及组织工程等领域。作为药物载体材料，聚磷酸酯能增加细胞的胞饮能力及药物透过细胞膜的能力，使其易于直接键接药物分子或增强药物活性的氨基酸等组分，是一类理想的生物降解高分子材料。聚磷酸乙酯（Poly(ethyl ethylene phosphate)，PEEP）是一种比较常见的亲水性聚磷酸酯，具有很好的生物降解性和生物相容性，广泛应用于药物载体、基因传导和组织工程中。综上所述，将聚氨基酸与亲水性聚磷酸乙酯进行共聚，能够改善聚氨基酸的水溶性，得到具有特殊性质的新型两亲嵌段共聚物，有关内容未见文献报导。

发明内容

本发明的目的是为了克服聚氨基酸在水中溶解性较差的缺点，将疏水性聚氨基酸与亲水性聚磷酸乙酯制成两亲嵌段共聚物，从而通过改变各链段的含量得到能控制溶解性的嵌段共聚物。

作为疏水性链段的聚L-谷氨酸-苄酯的结构式为：

                                                 

作为亲水性链段的聚磷酸乙酯的结构式为：

 

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG-b-PEEP）嵌段共聚物的合成方法，方法如下：将适量的端氨基聚磷酸乙酯（H₂N-PEEP）和L-谷氨酸-苄酯环内酸酐（BLG-NCA）分别溶解于CH₂Cl₂中，然后混合，室温下搅拌反应12~48h，反应结束后，将产物滴加到乙醚中沉淀，2℃静置12~18h，过滤，沉淀于30℃真空干燥得目标产物。其中，

端氨基聚磷酸乙酯（H₂N-PEEP）与L-谷氨酸-苄酯环内酸酐（BLG-NCA）的摩尔比为1:10~40；

端氨基聚磷酸乙酯与CH₂Cl₂的摩尔比为1:40-50；

L-谷氨酸-苄酯环内酸酐与CH₂Cl₂的摩尔比为1:10-20。

上述的聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯嵌段共聚物的合成方法，所述的端氨基聚磷酸乙酯（H₂N-PEEP）的分子量为3000~5000。

上述的聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯嵌段共聚物的合成方法，所述的端氨基聚磷酸乙酯的制备方法如下：以辛酸亚锡Sn(Oct)₂为催化剂，N-叔丁氧羰基乙醇胺（BocNHCH₂CH₂-OH）为引发剂引发环状磷酸乙酯（EEP）开环聚合，得到的中间产物端N-叔丁氧羰基聚磷酸乙酯（BocNH-PEEP），在三氟乙酸（TFA）作用下脱去保护基叔丁氧羰基（Boc），得到目标产物端氨基聚磷酸乙酯（H₂N-PEEP）。

本发明的有益效果是：通过本发明实现了聚L-谷氨酸-苄酯与聚磷酸乙酯的共聚，得到了具有两亲性的聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯嵌段共聚物。这种嵌段共聚物不仅能够改善聚L-谷氨酸-苄酯的水溶性，同时疏水性聚L-谷氨酸-苄酯链段也能够调节亲水性聚磷酸乙酯的降解速度及周期，因此通过改变各链段的含量来得到能控制溶解性和降解性的嵌段共聚物。本发明制备的聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯是一种两亲嵌段共聚物，可在水溶液中自组装形成内核疏水、外壳亲水胶束。这种嵌段共聚物胶束能够把疏水性药物分子组装到其疏水的核中，具有提高药物在血液中的循环时间等作用，在药物的控制释放和靶向药物传递等生物医用领域具有很好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中合成的H₂N-PEEP（A）和PBLG1-b-PEEP（B）的红外光谱图。

图2是实施例1中合成的 BLG-NCA（A）和PBLG1-b-PEEP（B）的红外光谱图。

图3是实施例1中合成的BocNH-PEEP的¹H NMR图。

图4是实施例1中合成的H₂N-PEEP的¹H NMR图。

图5是实施例1中合成的PBLG1-b-PEEP的¹H NMR图。

图6是实施例1中合成的H₂N-PEEP的GPC曲线图。

图7是实施例1中合成的PBLG1-b-PEEP的GPC曲线图。

图8是实施例1中合成的PBLG1-b-PEEP形成的胶束粒径分布图。

图9是实施例2中合成的PBLG2-b-PEEP形成的胶束粒径分布图。

图10是实施例3中合成的PBLG3-b-PEEP形成的胶束粒径分布图。

图11是实施例4中合成的PBLG4-b-PEEP形成的胶束粒径分布图。

具体实施方式

实施例1   聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG1-b-PEEP）嵌段共聚物的合成

（一）端氨基聚磷酸乙酯（H₂N-PEEP）的合成

1、环状磷酸乙酯（EEP）的合成

在500mL三口瓶中加入274.66g（2mol）三氯化磷和250mL无水二氯甲烷，缓慢滴加124.14g（2mol）无水乙二醇，滴加完毕后，室温继续反应 30min，减压蒸馏得到123.2g无色液体为2-氯-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（产率49%，42～45℃/1600 Pa）。

在250 mL圆底烧瓶中加入200 mL含有123.2g 2-氯-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷的甲苯溶液，在40℃通O₂反应48h。旋转蒸发除去甲苯，减压蒸馏得到77.9g无色液体为2-氯-2-氧-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷（产率: 56 %，88～90℃/107 Pa）。

将77.9g（0.55 mol）2-氯-2-氧-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷溶于 250 mL无水甲苯中, 在-5℃和磁搅拌下，缓慢加入25.3g（0.55mol）无水乙醇和61.6g（0.605mol）乙二胺的混合溶液，滴加反应2h。反应结束后过滤，滤液旋转蒸发除去甲苯，减压蒸馏得到50.6g无色液体为2-乙氧基-2-氧-1, 3, 2-二氧磷杂环戊烷，即环状磷酸乙酯（EEP）（产率: 61 % ，95～97℃/107 Pa）。反应式如下：

 

2、端氨基聚磷酸乙酯（H₂N-PEEP）的合成

称取3.003g（0.0198mol）环状磷酸乙酯置于反应瓶中，加入10mL 四氢呋喃，抽真空通氮气反复6次。称取0.074g（0.45mmol）N-叔丁氧羰基乙醇胺和0.201g （0.49mmol）辛酸亚锡分别溶在2mL和1.5mL 四氢呋喃中，然后将其用注射器加入到反应瓶中，40℃搅拌反应3h。反应结束后冷却至室温，旋转蒸发除去四氢呋喃，用5mL二氯甲烷溶解粗产物，然后滴加到100 mL石油醚中，2℃静置12h得沉淀。沉淀过滤，30℃真空干燥至恒重，得到粘性物质即为BocNH-PEEP，产率40%。

将BocNH-PEEP溶于10mL二氯甲烷中，然后将2mL 三氟乙酸滴加到上述反应液中，搅拌下控制温度0℃反应1h。反应结束后，将反应混合物滴加到100mL正己烷中，2℃静置12h得沉淀。沉淀过滤，30℃真空干燥至恒重，得到粘性物质即为H₂N-PEEP，产率80%。反应式如下：

 

（二）L-谷氨酸-苄酯环内酸酐(BLG-NCA)的合成

称取16.5g L-谷氨酸，30 mL HBr，110 mL苯甲醇于250 mL三口圆底烧瓶中，磁力搅拌下70℃回流反应至溶液澄清。反应混合液冷却至30℃后，将其倒入220 mL乙醇和33 mL吡啶组成的混合溶液中，2 ℃放置8 h。沉淀过滤，分别用乙醇和乙醚洗涤，再将其溶于500mL热的5 %乙醇溶液中，并用碳酸氢钠将溶液调至中性，以除去残留的L-谷氨酸。冷却后析出沉淀，过滤得粗产物。重结晶，30℃真空干燥至恒重，得L-谷氨酸-苄酯7.27 g，产率44 %。

在装有温度计，回流冷凝管，碱吸收装置的250 mL三口圆底烧瓶中加入7.27g L-谷氨酸-苄酯，150 mL无水四氢呋喃，升温至40 ℃，搅拌下加入9.11g三聚光气。待悬浊液澄清后，通入氮气30 min，以除去反应生成的氯化氢及剩余光气。将溶液倒入450 mL正己烷中，2 ℃放置12 h，析出白色针状晶体。抽滤，真空干燥至恒重得L-谷氨酸-苄酯环内酸酐(BLG-NCA)6.919g，产率42.2 %，m.p. 95~96℃（文献值m.p.96~97 ℃）。反应式如下：

 

（三）聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG1-b-PEEP）嵌段共聚物的合成

称取0.2g（1.0mmol）H₂N-PEEP和0.3g BLG-NCA （10.1mmol）分别溶于3mL（46mmol）和20mL（0.311mol）CH₂Cl₂中，然后置于三口烧瓶中混合，室温搅拌反应24h。反应结束后，将反应混合物滴加到250 mL乙醚中沉淀，2℃静置12h，过滤。重复上述沉淀操作1次，过滤，沉淀于30℃真空干燥至恒重得目标产物PBLG1-b-PEEP，产率45%。反应式如下：

 

图1中（A）和（B）分别是H₂N-PEEP和PBLG1-b-PEEP的红外光谱图。（B）与（A）相比，不仅在1732cm^-1 处出现了C=O的伸缩振动峰，而且在1268 cm^-1处出现了P=O的伸缩振动峰以及1045和978 cm^-1 处出现了P-O-C不对称和对称伸缩振动峰，还在800～700  cm^-1处出现了苯环单取代双峰。

图2中（A）和（B）分别是为BLG-NCA和PBLG1-b-PEEP的红外光谱图。从图（B）中可以看出，3302 cm^-1处是N-H之间的伸缩振动，在1732 cm^-1处的吸收峰为L-谷氨酸苄酯中酯键的特征吸收，1633 cm^-1和1562cm^-1是酰胺的特征吸收；图（A）中BLG-NCA分子两个羰基在1781 cm^-1和1705 cm^-1 处的吸收峰消失，表明BLG-NCA开环形成了嵌段共聚物。

图3 是BocNH-PEEP的¹H NMR图。化学位移3.75，4.12和4.25分别对应的是PEEP链段上的亚甲基质子峰f，侧链甲基质子峰c，主链亚甲基质子峰e特征峰。化学位移1.36对应的是PEEP链段上的甲基质子峰d，化学位移3.81和3.20是N-叔丁氧羰基乙醇胺上的亚甲基质子峰b和a，化学位移1.41是N-叔丁氧羰基乙醇胺上的甲基质子峰q。

图4是H₂N-PEEP的¹H NMR图。化学位移3.75，4.12和4.25分别对应的是PEEP链段上的亚甲基质子峰f，侧链甲基质子峰c，主链亚甲基质子峰e特征峰。化学位移1.36对应的是PEEP链段上的甲基质子峰d，化学位移3.81和3.20是N-叔丁氧羰基乙醇胺上的亚甲基质子峰b和a，化学位移1.41是N-叔丁氧羰基乙醇胺上的甲基质子峰消失，说明脱去了保护基团。谱图上没有其它峰出现，说明得到了目标产物。

图5是PBLG1-b-PEEP的¹H NMR图。化学位移3.75，4.12和4.25分别对应的是PEEP链段上的亚甲基质子峰f，侧链甲基质子峰c，主链亚甲基质子峰e特征峰。化学位移1.36对应的是PEEP链段上的甲基质子峰d，化学位移3.81和3.20是N-叔丁氧羰基乙醇胺上的亚甲基质子峰b和a。化学位移7.22对应的是PBLG链段上苯环的峰j，化学位移2.61、5.04和4.65分别对应的是PBLG侧链亚甲基质子峰h，PBLG侧链上的亚甲基质子峰i和PBLG链段上次甲基质子峰g，谱图上没有其它质子峰出现，表明得到了目标嵌段共聚物。

图6是H₂N-PEEP GPC流出曲线图。从图中可以看出，均聚物显示单一的平滑曲线，没有其它峰出现，表明得到了H₂N-PEEP均聚物。

图7是PBLG1-b-PEEP的GPC曲线图。从图中可以看出，显示单一的平滑曲线，没有其它峰出现，表明得到了PBLG1-b-PEEP嵌段共聚物。

实施例2   聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG2-b-PEEP）嵌段共聚物的合成

称取0.2g（1.0mmol）H₂N-PEEP和0.6g BLG-NCA （20.2mmol）分别溶于3mL（46mmol）和40mL（0.621mol）CH₂Cl₂中，然后置于三口烧瓶中混合，室温搅拌反应26h。反应结束后，将反应混合物滴加到300mL乙醚中沉淀，2℃静置14h，过滤。重复上述沉淀操作1次，过滤，沉淀于30℃真空干燥至恒重得产物PBLG2-b-PEEP，产率34%。产物通过红外光谱、核磁共振和凝胶渗透色谱等确认。

实施例3  聚L-谷氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG3-b-PEEP）嵌段共聚物的合成

称取0.2g（1.0mmol）H₂N-PEEP和0.9g BLG-NCA （30.3mmol）分别溶于3mL（46mmol）和60mL（0.932mol）CH₂Cl₂中，然后置于三口烧瓶中混合，室温搅拌反应28h。反应结束后，将反应混合物滴加到350mL乙醚中沉淀，2℃静置16h，过滤。重复上述沉淀操作1次，过滤，沉淀于30℃真空干燥至恒重得产物，产率27%。产物通过红外光谱、核磁共振和凝胶渗透色谱等确认。

实施例4   聚L-谷氨氨酸-苄酯/聚磷酸乙酯（PBLG4-b-PEEP）嵌段共聚物的合成

称取0.2g（1.0mmol）H₂N-PEEP和1.2g BLG-NCA （40.4mmol）分别溶于3mL（46mmol）和80mL（1.243mol）CH₂Cl₂中，然后置于三口烧瓶中混合，室温搅拌反应30h。反应结束后，将反应混合物滴加到400mL乙醚中沉淀，2℃静置18h，过滤。重复上述沉淀操作1次，过滤，沉淀于30℃真空干燥至恒重得产物，产率18%。产物通过红外光谱、核磁共振和凝胶渗透色谱等确认。

实施例5  胶束的制备

分别称取0.10g PBLG1-b-PEEP、PBLG2-b-PEEP PBLG3-b-PEEP和PBLG4-b-PEEP共聚物，溶于5mL 四氢呋喃中，待完全溶解后，在搅拌下向溶液中缓慢加入40mL二次蒸馏水。用旋转蒸发仪旋转2h以除去四氢呋喃，将剩余的溶液置于50mL容量瓶中用二次蒸馏水定容得到一定浓度的胶束溶液，利用纳米粒度仪测定胶束的粒径。

从实施例1～实施例4中可以看出，随着H₂N-PEEP与BLG-NCA的摩尔比的增加，嵌段共聚物的产率降低，所以最适宜的比例是1：10～40。经试验测定，H₂N-PEEP与BLG-NCA的摩尔比超过此比例范围，嵌段共聚物变得难溶于水。PBLG1-b-PEEP、PBLG2-b-PEEP PBLG3-b-PEEP和PBLG4-b-PEEP在水溶液中能自组装成纳米级的胶束，平均粒径分别为99nm（图8）、121nm（图9）、133nm（图10）和147nm（图11），这类由两亲共聚物形成的胶束能够把疏水性药物分子组装到其疏水的核中，具有提高药物在血液中的循环时间等作用，在药物控制释放和靶向药物传递等领域具有很好的应用前景。