大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法

摘要

本发明公开了一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其通过收集和化验分析春季繁育期间雌性大熊猫尿样，将雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50％以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行为、雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值；由于本发明是从目前最大数据量的78例发情期大熊猫雌二醇变化规律统计分析中总结出的，因此具有非常高的可靠性，不仅填补了大熊猫研究领域的空白，还为提高圈养大熊猫人工授精受孕率提供了科学依据。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于圈养动物适时人工授精的判断依据，特别是涉及一种 大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法。

背景技术

大熊猫是我国特有的珍稀濒危野生动物，其自身繁殖能力偏低，雌性大熊 猫一年只有一次发情期，而一次发情期中只有1～3天接受自然交配，其排卵时 间可能只有一天，并且圈养大熊猫自然交配比例偏低，目前只有50％左右的大熊 猫能够自然交配，有一半左右的大熊猫需要通过人工授精完成繁殖，所以，确 定大熊猫适时适时配种时机是大熊猫繁育的关键技术。

在上世纪90年代中期以前，对大熊猫适时配种时机的判断主要根据大熊猫 发情行为定性观察，凭经验确定大熊猫适时配种时机，导致对大熊猫适时人工 授精时间把握不清，缺乏量化指标，这也是导致大熊猫繁殖效率低下的重要原 因。

上世纪90年代中期以后，通过监测大熊猫发情期尿液雌激素变化规律，利 用雌激素指标作为大熊猫适时配种的指标逐渐开始应用于大熊猫人工授精中， 但是对采用雌激素指标作为大熊猫适时人工授精的指标存在很大的争议，尚无 统一观点。

目前所提出的大熊猫适时人工授精观点全部基于雌激素峰值出现时间来提 出，由于大熊猫发情期雌激素变化曲线本身为波动性曲线，会出现多个峰值， 并且大熊猫排卵还涉及孕激素、发情行为等其他多个因素，对于如何确切判断 雌激素峰值是否为真实峰值尚无任何相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是一种为大熊猫进行适时人工授精提供判断标准 的大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法。

为解决上述技术问题，本发明一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，包 括以下步骤：

(1)春季繁育期间，按时间要求对雌性大熊猫进行尿样收集，同时观察大 熊猫发情行为，在尿样上标记后进行冷冻或冷藏保存，然后对尿样采用酶联免 疫吸附试验检测雌二醇值和孕酮值；所述记录在尿样上的标记主要包括雌性大 熊猫呼名、排尿时间等；所述的雌二醇值和孕酮值是指雌二醇和孕酮在尿样中 的浓度值大小；所述雌二醇为尿样中主要的一种雌激素，所述孕酮为尿样中主 要的一种孕激素；

(2)在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌二醇值和孕酮值作为纵坐标的 平面坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌二醇值和孕酮值所确定的两组坐 标点，将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌二醇值变化曲线图和孕酮值 变化曲线图，找出雌二醇最大峰值及其对应的孕酮值；所述的雌二醇最大峰值 亦是雌二醇的最高值；

(3)根据雌二醇最大峰值出现时间前的孕酮值计算出发情雌性大熊猫孕酮 基础值，并计算出雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基 础值的比值；

(4)依据雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌二醇最大峰值或 其后的雌二醇峰值在下降幅度达到50％以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其 后的峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高 峰行为、雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值 的比值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值；所述出现大 熊猫雌二醇真实峰值的时刻为对应的大熊猫排尿时间。

所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，若雌二醇最大峰值在10小 时～20小时范围内下降幅度达到50％以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌 二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌二醇从最大峰 值下降的过程中雌二醇最大峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发 情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰值为熊猫雌二醇真实峰值。

所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，若雌二醇最大峰值在20小 时～31小时范围内下降幅度达到50％以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌 二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于1.8，同时在雌二醇从最大 峰值下降的过程中孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以 确定此雌二醇最大峰值为大熊猫雌二醇真实峰值。

所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，若雌二醇从最大峰值下降 50％的时间在20小时以上、雌二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值 小于1.8，同时雌二醇最大峰值之后出现一个或多个峰值、且雌二醇从最大峰值 下降的过程中雌二醇最大峰值对应的孕酮值未呈上升趋势和大熊猫未出现典型 发情高峰行为，则可以确定雌二醇最大峰值为假峰值；此时，大熊猫雌二醇真 实峰值为雌二醇最大峰值之后的某一峰值，并且该峰值必须同时具备在10小 时～20小时范围内下降幅度达到50％以上、之后雌二醇连续下降到基础值、该 峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、在雌二醇从该峰值下降的过程中 该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为等情况。

所述的10小时～20小时范围是指大熊猫雌二醇从真实峰值下降50％所用时 间的主要判断标准，它是通过78例大熊猫发情期雌二醇变化规律的统计中总结 出的，78例的数据量远远超过了以往的任何报道量，是迄今为止世界上最大的 数据量，78例中有80％的大熊猫个体均在这一范围内，因此，10小时～20小时 范围的判断标准具有非常高的可靠性。

所述的大熊猫典型发情高峰行为包括明显的压尾反射(在发情高峰期大熊 猫出现特殊的发情行为，即用竹竿刺激大熊猫后躯，大熊猫出现静立、翘尾反 应)和待配行为(大熊猫自主出现静立、翘尾、躯干下沉现象)。

所述的一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其发情雌性大熊猫孕酮基 础值的计算按以下步骤进行：

①选取大熊猫雌二醇最大峰值前的所有孕酮值，找出所选孕酮值中的最大 值A，计算出所选孕酮值的算数平均值B、标准差C，然后得出B+2C＝D；

②如果A-D为负，此时的算数平均值B即为孕酮基础值；

③如果A-D为正，则从选取的孕酮值中找出大于D的所有孕酮值，按①步 骤的方式从剩余孕酮值中找出最大值A₁，计算出剩余孕酮值的算数平均值B₁、 标准差C₁，然后得出B₁+2C₁＝D₁；

④如果A₁-D₁仍然为正，则重复①步骤的方式，直到A_n-D_n为负，此时的算数 平均值B_n即为孕酮基础值，其中n代表自然数。

所述的任何一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其按时间要求对雌性 大熊猫进行尿样收集的过程如下：

(1)观察雌性大熊猫外阴部，若外阴部出现红肿后，则每天收集1份雌性 大熊猫晨尿；

(2)从雌二醇连续上升后的第4天开始，每天间隔8小时左右收集3份尿 样；

(3)雌性大熊猫发情高峰行为前后，每天间隔5小时左右收集5份尿样；

(4)一旦监测到雌二醇值有下降趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时 左右。

所述的任何一种大熊猫雌二醇真实峰值的判断方法，其每一次大熊猫尿样 收集包括以下步骤：

(1)清洁并晾干兽舍硬化地面；

(2)将需收集尿样的大熊猫放入兽舍，工作人员守候，一旦大熊猫排出小 便，立即将大熊猫放到其它兽舍；

(3)用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入冷冻管，做好标记，然后立即 放入冷冻或冷藏装置。

现有资料无任何关于如何判断大熊猫雌激素真实峰值的报道以及相关技术 与判断标准，本发明将解决如何判断大熊猫雌二醇的真实峰值，同时确定判断 标准，并将雌二醇真实峰值对应的大熊猫排尿时间确定为雌二醇真实峰值的出 现时间。

大熊猫尿样采集间隔时间会直接影响到对峰值的判断，间隔时间过长会漏 掉真实的峰值，间隔时间过短一方面会增加工作量以及对动物的干扰，另一方 面会降低采样的可行性。现有资料报道的大熊猫尿样采集时间不确定且不统一， 有的采集时间间隔长达1天，会导致对峰值时间的判断误差范围较大；而本发明 采用的采样时间间隔方案在发情高峰期间隔时间为3小时左右，使对大熊猫雌 二醇峰值时间的判断误差范围缩小到1.5小时左右，大大缩小了对大熊猫雌二 醇峰值时间的判断误差。

现有公开报道对大熊猫雌激素峰值的判断时间均单纯检测尿液雌激素水平， 而没有检测发情高峰期孕激素水平与行为学综合判断。判断雌激素是否出现真 实峰值的关键是判断雌激素是否出现真实的下降，一旦监测出现雌激素下降， 尚不能判断究竟是雌激素波动还是真实的下降。为了解决该问题本发明一方面 在监测尿液雌二醇的同时监测尿液孕酮水平，同时确定量化雌二醇真实下降的 标准，采用行为学辅助手段综合判断大熊猫尿液雌二醇是否为真实下降。

判断雌二醇是否出现真实峰值的关键是判断雌二醇是否出现真实的下降，本 发明将通过统计分析尽可能多的大熊猫发情期雌二醇数据，确定大熊猫雌二醇 峰值的下降速度参考值范围来量化确定大熊猫雌二醇是否出现真实下降。

一旦监测到大熊猫出现可疑峰值，通过加大采样密度将采样间隔时间缩短到 3小时左右连续采样，监测雌二醇下降的速度来确定雌二醇是否为真实下降。

成都大熊猫繁育研究基地多年来对共计78例大熊猫雌二醇变化规律进行了 统计分析，分析雌二醇从真实峰值下降50％以上所需的最短时间分布，绘制出如 图1所示的发情期雌性大熊猫雌二醇从真实峰值下降50％所用时间分布频率，采 用百分位数法确定大熊猫尿雌二醇峰值下降50％所用时间参考值范围，结果见表 1：

表1.雌二醇真实峰值下降50％所需时间(h)

从表1可以看到通过对78例大熊猫发情期雌二醇变化规律的统计发现，大 熊猫尿雌二醇从真实峰值下降50％所需时间的最大值为31.17小时、最小值为 5.83小时，其中80％的大熊猫个体均在9.83～19.86小时范围内，即在10～20 小时范围内，小于20小时；同时分析出现了雌二醇假峰值的16例大熊猫，分 析雌二醇峰值下降50％所需时间及其时间分布，结果见表2：

表2.雌二醇假峰值下降50％所需时间(h)

从表2可以看到，对于出现雌二醇假峰值的个体，雌二醇从假峰值下降50％ 所需时间要长于真峰值个体，在14.58～41.5小时范围内，其中80％的个体在 20～38.7小时范围内，即在20～39小时范围内，大于20小时。

利用这一数据对鉴别判断大熊猫尿液雌二醇是波动还是真实下降提供了有 力的量化参考数据，一旦监测到大熊猫尿雌二醇从一高值在短时间内出现迅速 下降，若在10小时～20小时的范围内雌二醇下降幅度达50％以上，则可判断这 一下降为真实下降；而一旦出现雌二醇下降速度过慢，下降50％的时间超过20 小时，可初步判断为雌二醇波动，而非真实下降。

在现有关于大熊猫适时人工授精的公开报道中，仅仅采用了大熊猫雌激素 峰值作为参考，没有同时监测尿样孕激素水平。本发明在检测大熊猫尿样雌二 醇的同时，同时监测大熊猫尿样孕酮水平，一旦出现雌二醇的下降，同时查看 孕酮水平变化，若孕酮无上升趋势，则判断为雌二醇的波动，而非真实下降， 若孕酮出现上升趋势则雌二醇可能已经出现真实下降，将进一步缩短尿样的采 集间隔时间至每3小时左右一次，直至完全确认雌二醇的真实下降时间为止， 从而提高了雌二醇检测的准确性。

为了量化确定大熊猫出现真假雌二醇峰值时对应的孕酮水平差异，用以进 一步量化确定雌二醇真实峰值，比较了真假雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基 础值的比值的差异，结果见表3：

表3.真假雌二醇峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值比较

从表3可以看到，80％的个体当出现雌二醇真实峰值时，其对应的孕酮值水 平升高，孕酮值与其基础值的比值在1.79～3.14之间，即大于1.8；而当出现 假雌二醇峰值后，其对应的孕酮值水平较低，80％的个体孕酮值与其基础值的比 值在0.94～2.13之间，即小于2，该数据可进一步量化确定雌二醇是否为真实 峰值。若出现可疑的雌二醇峰值后，计算出其对应的孕酮值与孕酮基础值的比 值，若大于2可进一步确认该雌二醇峰值为真实峰值，若该比值小于1.8，则该 雌二醇峰值可能为假峰值，若大于1.8需要进一步结合行为学数据确定。

现有公开报道中，没有关于采用大熊猫发情行为辅助判断雌激素是否为真 实下降的有关报道，仅在2006年科学出版社出版、书刊号为p257、作者为张志 和与魏辅文的《大熊猫迁地保护理论与实践》中有相关说明：86.4％(19/22)的 大熊猫首次自然交配的发生时间在雌激素峰值以后，大熊猫能进行自然交配的 时间通常出现在发情高峰。该《大熊猫迁地保护理论与实践》表明，可辅助采 用大熊猫是否出现发情高峰行为作为雌激素是否真实下降的辅助参考依据。

本发明一旦监测到大熊猫出现雌二醇下降，孕酮上升，同时观察大熊猫发 情行为，若大熊猫出现典型发情高峰行为，则可辅助判断大熊猫出现雌二醇真 实下降，否则尚不能完全确认，这将进一步排除雌二醇和孕酮同时出现波动的 情形。

由于大熊猫发情期雌二醇呈现波动式变化曲线，并且一旦出现雌二醇峰 值，其下降速度很快，由于在大熊猫上不可能连续采集尿样，采样存在一定的 时间间隔，尽管加大了采样频率，依然可能漏掉真实的雌二醇峰值样品，造成 部分个体会出现从数值上看到的雌二醇最大峰值却不一定是真实的雌二醇峰值 的情形，出现假峰值。在现有的所有公开报道中，均没有关于如何剔除假峰值 的技术内容。

由于本发明对目前最大数据量的78例发情期大熊猫雌二醇变化规律进行了 统计分析，得出了三种非常可靠的判断大熊猫雌二醇真实峰值及其出现时刻的 方法，其中80％的大熊猫个体的尿雌二醇从真实峰值下降50％所需的时间范围为 10小时～20小时，80％的个体当出现雌二醇真实峰值时，其对应的孕酮值水平 升高，孕酮值与其基础值的比值大于1.8；而当出现雌二醇假峰值后，其对应的 孕酮值水平较低，80％的个体的孕酮值与其基础值的比值小于2，将这几个时间 范围作为主要判断标准，用以量化确定大熊猫雌二醇真实峰值及其出现时刻， 具有非常高的可靠性，填补了大熊猫研究领域的空白，为提高圈养大熊猫人工 授精受孕率提供了科学依据。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明发情期雌性大熊猫雌二醇从真实峰值下降50％所用时间分布频 率示意图；

图2为本发明雌性大熊猫个体的第一种雌二醇值和孕酮值的变化曲线图；

图3为本发明雌性大熊猫个体的第二种雌二醇值和孕酮值的变化曲线图；

图4为本发明雌性大熊猫个体的第三种雌二醇值和孕酮值的变化曲线图。

图中标识：α为雌二醇值变化曲线图上大熊猫雌二醇真实峰值的坐标点， β为孕酮值变化曲线图上与α对应的坐标点，Ec ng/mg Cr表示为肌酐测定方法 得到的雌二醇浓度值，Pg ng/mg Cr表示为肌酐测定方法得到的孕酮浓度值。

具体实施方式

本发明在春季繁育期间每日观察雌性大熊猫外阴颜色，大熊猫外阴红肿为 大熊猫发情启动的特征表现，一旦发现外阴红肿，即可初步确定大熊猫进入发 情期，继续每日观察大熊猫发情行为，若出现频繁标记行为、咩叫行为则可确 定大熊猫已经发情。

大熊猫发情启动后，开始对雌性大熊猫尿样进行收集，在尿样上记录熊猫 呼名、排尿时间、是否出现典型发情高峰行为等标记，并及时地对收集的大熊 猫尿样进行化验分析，采用酶联免疫吸附试验检测出与大熊猫呼名及排尿时间 对应的雌二醇值和孕酮值；起初每天收集1份晨尿；雌二醇值连续上升后第4 天开始，每天收集3份尿样，间隔8小时左右，时间分别为7:00，15:00，23:00 左右；发情高峰前后，每天尿样增加到5个左右，间隔5小时左右，收集时间 分别为：6:00，11:00，16:00，21:00，1:00左右；一旦监测到雌二醇值有下降 趋势，将尿样收集间隔时间缩短为3小时左右，直至最终确认雌二醇值真实下 降为止。

每一次大熊猫尿样收集都是从清洁后的硬化地面收集，先清洁并晾干兽舍 地面后，将需收集尿样的大熊猫放入兽舍；然后工作人员守候，一旦大熊猫排 出小便，立即将大熊猫放到其它兽舍，用清洁注射器采集地面新鲜尿样，装入 冷冻管，做好标记，立即放入冰箱冷冻室冷冻保存或冷藏室冷藏保存。

在以大熊猫排尿时间作为横坐标、以雌二醇值和孕酮值作为纵坐标的平面 坐标上，分别标出排尿时间及其对应的雌二醇值和孕酮值所确定的两组坐标点， 将两组坐标点分别依次连接起来，绘制出雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲 线图，找出雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值对应的孕酮值，计算出发情雌 性大熊猫孕酮基础值。

发情雌性大熊猫孕酮基础值的计算按以下步骤进行：

①选取大熊猫雌二醇最大峰值前的所有大熊猫雌二醇值对应的孕酮值，找 出所选孕酮值中的最大值A，计算出所选孕酮值的算数平均值B、标准差C，然 后得出B+2C＝D；

②如果A-D为负，此时的算数平均值B即为孕酮基础值；

③如果A-D为正，则从选取的孕酮值中找出大于D的所有孕酮值，按①步 骤的方式从剩余孕酮值中找出最大值A₁，计算出剩余孕酮值的算数平均值B₁、 标准差C₁，然后得出B₁+2C₁＝D₁；

④如果A₁-D₁仍然为正，则重复①步骤的方式，直到A_n-D_n为负，此时的算数 平均值B_n即为孕酮基础值，其中n为自然数。

依据雌二醇值变化曲线图和孕酮值变化曲线图，将雌二醇最大峰值或其后 的雌二醇峰值在下降幅度达到50％以上所用的时间、雌二醇从最大峰值或其后的 峰值在下降的过程中孕酮值是否呈上升趋势和大熊猫是否出现典型发情高峰行 为、雌二醇最大峰值或其后的雌二醇峰值所对应的的孕酮值与孕酮基础值的比 值等情况同时结合起来，共同判断出大熊猫雌二醇真实峰值。判断大熊猫雌二 醇真实峰值的方法分别有如下三种情况。

第一种情况：如图2所示，若雌二醇最大峰值在10小时～20小时范围内下 降幅度达到50％以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最大峰值对应的孕 酮值与孕酮基础值的比值大于2，同时在雌二醇从最大峰值下降的过程中孕酮值 呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰值为 大熊猫雌二醇真实峰值，即图2中的α坐标点，β为与α对应的孕酮值坐标点。

第二种情况：如图3所示，若雌二醇最大峰值在20小时～31小时范围内下 降幅度达到50％以上、之后雌二醇连续下降到基础值、雌二醇最大峰值对应的孕 酮值与孕酮基础值的比值大于1.8，同时在雌二醇从最大峰值下降的过程中孕酮 值呈上升趋势和大熊猫出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰值 为大熊猫雌二醇真实峰值，即图3中的α坐标点，β为与α对应的孕酮值坐标 点。

第三种情况：如图4所示，若雌二醇从最大峰值下降50％的时间在20小时 以上、雌二醇最大峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值小于1.8，同时雌二醇 最大峰值之后出现一个或多个峰值、且雌二醇从最大峰值下降的过程中孕酮值 未呈上升趋势和大熊猫未出现典型发情高峰行为，则可以确定此雌二醇最大峰 值为假峰值；此时，大熊猫雌二醇真实峰值为雌二醇最大峰值之后的某一峰值， 并且该峰值必须同时具备在10小时～20小时范围内下降幅度达到50％以上、之 后雌二醇连续下降到基础值、该峰值对应的孕酮值与孕酮基础值的比值大于2、 在雌二醇从该峰值下降的过程中该峰值对应的孕酮值呈上升趋势和大熊猫出现 典型发情高峰行为等情况，即图4中的α坐标点，β为与α对应的孕酮值坐标 点。

所述大熊猫雌二醇真实峰值的出现时刻为对应的大熊猫排尿时间。