血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂

摘要

本发明公开一种血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂，利用肌酐测定试剂的试剂1中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢，进而由肌酐测定试剂的试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂1中的过氧化氢酶，从而测定样本中肌酐含量。本发明具有可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成的本底升高、致使检测结果准确度、精密度不好的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种血清中肌酐的二步酶法测定方法及测 定试剂。

背景技术

肌酐（Cr）是一种低分子含氮化合物，相对分子质量116,000。Cr主要由肌肉产生， 是肌酸的终末代谢产物，正常情况下，人体内Cr的含量基本稳定，一般维持在3~14 mg/L，仅仅由肾小球排泄，不被肾小管重吸收，由于Cr是小分子物质不与血浆蛋白结 合，所以测定血清Cr浓度及根据血清Cr与尿酐浓度计算所得的Cr清除率是既简单又 可靠的肾小球滤过功能指标，深受临床重视。

临床实验室对于血和尿中Cr的测定常用酶法或碱性苦味酸法（Jaffe法），Jaffe法 虽然试剂较便宜，但线性范围窄，易受血清中其他假性Cr物质的干扰，尤其是当血清 胆红素值≥165.5μmol/L时开始出现负偏差，而且血清胆红素越高偏差越大。此外。Jaffe 法受到酮体、乳糜血和溶血的严重干扰，头孢类和维生素C及多巴胺等药物也使其结果 出现较大干扰。

酶法利用Cr在肌酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶等酶及显色剂和水、 氧的共同作用下生成醌亚胺（红色），通过检测反应终点的吸光度来推算样品中Cr的含 量，酶法不管是一步酶法或两步酶法，测定过程中Cr水解后产生的肌酸和内源性肌酸 同时转化为醌亚胺，Cr测定结果包括了Cr和肌酸之和。正常男性血Cr参考范围为53~106 μmol/L，女性44~88μmol/L；正常男性血肌酸参考范围为15~45μmol/L，女性为30~80 μmol/L，当发生急性肌损伤、饥饿、糖尿病、营养不良、甲亢、发热时肌酸显著升高， 对Cr造成的偏差更显著。

为解决内源性肌酸干扰，仅以肌酐酶为第二试剂的两步酶测定方法，由于第一步反 应体系中有4-AAP和色原，肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶催化作用产生醌亚胺， 肌酸被转化而被耗尽，当加入肌酐酶后启动Cr水解反应生成肌酸，再经肌酸酶、肌氨 酸氧化酶、过氧化物酶催化作用产生醌亚胺，反应过程如下：

第一步反应

第二步反应

内源性肌酸和Cr水解产生的肌酸先后呈色，仪器以第一步反应产生的醌亚胺为空 白，仅以第二步产生的醌亚胺计算出肌酸的含量，以此去除内源性肌酸的影响，但由于 正常情况下，内源性肌酸产生的吸收信号较低且不稳定，因此该法试剂准确度、精密度 较差，临床结果重复性不好，无法满足常规检测要求。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提出一种可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成 的本底升高、致使检测结果准确度、精密度不好的血清中肌酐的二步酶法测定方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种血清中肌酐的二步酶法测 定方法，利用肌酐测定试剂的试剂1中的过氧化氢酶消除内源性肌酸产生的过氧化氢， 进而由肌酐测定试剂试剂2中的过氧化氢酶抑制剂抑制试剂1中的过氧化氢酶，从而测 定样本中肌酐含量的方法，其具体的反应过程如下：

第一步反应

第二步反应

抑制剂抑制过氧化氢酶活性    （4）

上述的肌酐测定试剂的试剂1中包含过氧化氢酶，肌酸酶，肌氨酸氧化酶和色原， 试剂2中包含过氧化氢酶抑制剂，肌酐酶，过氧化物酶和4-氨基安替比林；其中过氧化 氢酶抑制剂为叠氮化物,羟胺,氟化物,醋酸盐,甲酸盐,乙醇、甲醇中的一种或几 种。

本发明上述血清中肌酐的二步酶法测定方法的测定试剂由试剂1和试剂2组成，其 中试剂1、2各组分及浓度范围为：

试剂1：

试剂2：

试剂可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试剂，直接使用。

其中所述缓冲液可以是磷酸缓冲液、三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N- 三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗 啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2- 羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2- 羟基丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺 酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3- 氨基丙磺酸缓冲液的一种或几种。

所述色原包括酚类化合物（如2-氯酚，2,4-二氯苯酚，4-氯酚，2,6-二氯苯酚）， 和/或苯胺类似物（如N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙 基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)， N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基 -N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2- 羟基-3-磺丙基)-3 5-二甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯 胺钠盐），3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸的一种，优选3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸。

所述去干扰剂亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶等中的一种或几种。

所述抑制剂为叠氮化物,羟胺,氟化物,醋酸盐,甲酸盐,乙醇、甲醇。优选叠氮 化物。

所述防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂（如Proclin300） 中的一种或几种。

所述稳定剂选自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一 种或者几种。

所述表面活性剂，优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，更优选地，所述 非离子表面活性剂选自TWEEN系列（如Tween 80、Tween 20）、SPAN系列、TRITON系 列（如Triton X-100）。

本发明的优点和有益效果：

本发明采用过氧化氢酶消除肌酸产生的过氧化氢，产生的水和氧气不会造成本底升 高，试剂中的过氧化氢酶在检测反应时被抑制剂完全抑制，不会对反应造成影响，因此 本法可规避以过氧化物酶氧化过氧化氢造成的本底升高、致使检测结果准确度、精密度 不好的问题。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背 离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的保护 范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均 可容易地从商业公司获取。

实施例1

试剂1：

试剂2：

试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏 水后各自混合搅匀即可。

实施例2

试剂1：

试剂2：

实施例2试剂的制备方法同实施例1。

实施例3

试剂1：

试剂2：

实施例3试剂的制备方法同实施例1。

本发明试剂测定样本中Cr的测试条件如下：温度：37℃；比色杯光径为1.0cm。 检测主波长546nm，副波长700nm。

应用本发明Cr测定试剂测定样本中Cr的方法如下：样品（校准管以校准品做样品） 加R1混匀，37℃孵育5min后加入R2混匀，记录吸光度A1，在37℃反应5min后， 记录吸光度A2。其中样本用量8μl，试剂1用量200μl，试剂2用量100μl。

本发明试剂测定样本中Cr含量按以下公式进行计算：

得到本发明Cr测定试剂测定样本中Cr的浓度。

对照例4

试剂1：

试剂2：

试剂测定样本中Cr的测试条件如下：温度：37℃；比色杯光径为1.0cm。检测 主波长546nm，副波长700nm。

应用本发明Cr测定试剂测定样本中Cr的方法如下：样品（校准管以校准品做样品） 加R1混匀，37℃孵育5min后记录吸光度A1，加入R2混匀，在37℃反应5min后， 记录吸光度A2。其中样本用量6μl，试剂1用量225μl，试剂2用量75μl。

对靶值为88.3（72.4—104.2）μmol/L的质控液Ⅰ和靶值为324（267—381）μmol/L 的质控液Ⅱ在相同条件下，采用试剂对同一质控液的Cr浓度连续检测20次，将检测结 果的平均值与靶值范围进行比较，以检测所述的试剂的准确性，同时比较每个测定的变 异系数，以检测所述实施例试剂的精密度，结果如表1所示：

表1：

表1的结果表明：本发明试剂的准确度、精密度均较好。