抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用，所述的siRNA的正义链序列为：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，反义链序列为：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'。本发明抑制PDCD4基因表达的siRNA为研究PDCD4基因的功能提供了新的技术方案，用该siRNA沉默PDCD4后可显著降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种抑制PDCD4基因表达的siRNA 及其在研究PDCD4基因功能中的应用。

背景技术

程序性细胞死亡因子4（Programmed cell death4,PDCD4）是近年来发现的 一种新的抑癌基因，研究报道其在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、 卵巢癌、神经胶质瘤和肝细胞癌等多种恶性肿瘤细胞中表达缺失或低表达。Chen 等（Chen Y，Knosel T,Kristiansen G.J Pathol,2003,(5):640-646.）通过研究124 例不同亚型的原发性肺癌样本，结果显示，83%的肿瘤样本中PDCD4蛋白表达 缺失，相对于肺部正常组织中PDCD4mRNA的表达，肺癌组织中PDCD4mRNA 的表达水平比正常肺部组织中显著降低。Afonja等（Afonja O,Juste D,Das S,et al. Oncogene,2004,23:8135.）在对乳腺癌细胞系的研究中发现，通过转染PDCD4 到T-47D和MDA-MB-231乳腺癌细胞系，可以诱导细胞凋亡的发生。Zhang等 （Zhang H,Ozaki I,Mizuta T,et al.Oncogene,2006,25(45):6101-6112.）发现 PDCD4也可以诱导肝癌细胞系Huh7的凋亡。PDCD4的表达产物可调节细胞的 程序性死亡，也可通过抑制凋亡相关基因的转录或翻译从而抑制肿瘤的生成或 肿瘤细胞的生长。

肿瘤细胞中PDCD4的表达水平与药物对细胞的敏感性之间存在一定的关 系。通过转染反义PDCD4可以明显减弱肾癌细胞系UO-31对药物葛尔德霉素 的敏感性，说明细胞中下调PDCD4的表达会减弱药物的细胞毒性（Bohm,M., Sawicka,K.,Siebrasse,J.P.,Brehmer-Fastnacht,A.,Peters,R.,& Klempnauer,K.H. (2003).Oncogene,22(31),4905-4910.）。此外，通过转染全长PDCD4cDNA的质 粒到人胃腺癌细胞系BGC-823中，增强PDCD4蛋白在细胞中的表达，发现其 可相应的增强BGC-823细胞对药物羟基喜树碱（HCPT）的敏感性（王汉卿， 孙震晓。世界华人消化杂志，2009，（7）：647-651.）。Jansen等（Jansen,A.P., Camalier,C.E.,Stark,C.,& Colburn,N.H.Mol Cancer Ther,2004,3(2), 103-110.）。研究发现PDCD4的表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，肿瘤 细胞中PDCD4的表达水平与细胞对抗肿瘤药物的敏感性正相关，上调PDCD4 的表达会增加细胞对某些化疗药物的敏感性，反之，下调PDCD4的表达则会引 起某些药物对细胞毒性的减弱。

然而PDCD4在白血病中的功能研究较少，最近的研究发现，在急性髓性白 血病（Acute myelogenous leukemia,AML）中，PDCD4的表达可促进维A酸诱 导的粒细胞分化（Ozpolat B,Akar U,Steiner M,et al.Mol Cancer Res,2007,5: 95.）。近期的报道表明，在白血病中PDCD4基因直接被miRNA-21调控，抑制 miRNA-21可以导致PDCD4的表达水平显著升高，并展示出显著的抗白血病作 用（①Yumin Li,Xujiao Zhu,et al.Cancer Science.2010,101(4):948-954;②Haiyan  Hu,Yumin Li,Jingyi Gu,et al.Leuk Lymphoma.2010,51(4):694-701;③Jingyi Gu, Xujiao Zhu,Yumin Li,et al.Med Oncol.2011,28(1):211-218.），这提示抑癌基因 PDCD4在白血病中也有重要作用。

近年RNA干扰技术迅速发展，不仅广泛用于肿瘤基因治疗，而且也是研究 基因功能的有用工具。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种抑制PDCD4基因表达的siRNA。

本发明的另一目的在于提供上述抑制PDCD4基因表达的siRNA的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种抑制PDCD4基因表达的siRNA，其序列为：

正义链：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，

反义链：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'；

优选为，所述的抑制PDCD4基因表达的siRNA序列（包括正义链和反义链） 的3'端垂悬有dTdT，dTdT结构有利于保护RNA免受酶解；

所述的抑制PDCD4基因表达的siRNA以GenBank基因库中PDCD4已知序 列（Gene ID：27250，NM_145341，NM_014456）为基础，按照siRNA设计原则， 结合Ambion公司提供的在线设计工具siCatch^TM siRNA Design针对编码区的 siRNA靶点位置设计。

上述的抑制PDCD4基因表达的siRNA在研究PDCD4基因功能中的应用， 特别是用于进行PDCD4基因与白血病细胞对抗白血病化疗药物敏感性的相关性 研究。

本发明具有如下的优点：

(1)本发明提供的抑制PDCD4基因表达的siRNA能有效沉默PDCD4基因， 下调PDCD4基因的表达量，为研究PDCD4基因的功能提供了新的技术方案。

(2)通过研究白血病K562细胞中PDCD4对抗白血病化疗药物敏感性的影 响，发现在白血病细胞中下调PDCD4的表达可以降低抗白血病化疗药物对白血病 细胞的敏感性，减弱细胞毒性，从而恢复白血病细胞生长。这为进一步研究PDCD4 在白血病中的功能及关系提供理论依据。

附图说明

图1是Real-time PCR检测K562细胞内PDCD4 mRNA的相对表达水平图， *P＜0.05。

图2是Western bloting检测K562细胞内PDCD4和β-actin蛋白的表达水平 图。

图3是Western bloting检测K562细胞内PDCD4蛋白相对内参β-actin的相 对表达水平图，*P＜0.05。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

使用的材料：

白血病K562细胞购自中国科学院上海细胞所；新生牛血清购自杭州四季青 生物工程科技有限公司；1640培养基购自GIBCO公司；Lipofectamine^TM 2000购 自Invitrogen公司；MTT及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Trizol试剂 购自天根生物公司；Real-time PCR相关试剂购自Takara公司，引物由上海生工 合成；细胞裂解液（RIPA）和Bradford蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究 所，PVDF膜购自Millipore公司，β-actin一抗购自武汉博士德公司，PDCD4一 抗购自Cell Signaling Technology公司，二抗分别购自北京博奥森公司和Asbio  Technology公司；三氧化二砷购自北京双鹭药业股份有限公司，小檗碱（Bererine, BB）购自Sigma公司，阿糖胞苷（Arabinosylcytosine,Ara-C）购自赛德萨公司。

统计学处理：

SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差表示，采用完全随 机设计的单因素方差分析法（one-way ANOVA）分析各组数据间差异的显著性。 以P＜0.05为有显著性差异。

金正均Q值法判断PDCD4 siRNA与药物联合使用后的效果 Q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，Ea和Eb分别为单用PDCD4 siRNA和单用药物的抑 制率，Ea+b为两者联合用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母代表 “期望合并效应”，Q值为两者之比，Q<0.85为拮抗作用，0.85≤Q<1.15为相加作 用，Q≥1.15为协同作用。

实施例1

（一）PDCD4 siRNA的设计与合成

根据GenBank基因库中PDCD4已知序列（Gene ID：27250，NM_145341， NM_014456），按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具 siCatch^TM siRNA Design针对编码区不同的siRNA靶点位置设计了以下三条序列：

PDCD4 siRNA序列一：

正义链：5'-CACCAAUCAUACAGGAAUA-3'，

反义链：5'-UAUUCCUGUAUGAUUGGUG-3'；

PDCD4 siRNA序列二：

正义链：5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，

反义链：5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'；

PDCD4 siRNA序列三：

正义链：5'-GGUGGAAAGCGUAAAGAUA-3'，

反义链：5'-UAUCUUUACGCUUUCCACC-3'；

上述的各siRNA序列的3'端垂悬有dTdT；

随机对照采用siRNA通用对照（siRNA通用对照BLAST后与NCBI上所有 已知的哺乳动物都有至少5个碱基的差异）；PDCD4 siRNA由广州锐博生物技术 有限公司合成，siRNA通用对照购自广州锐博生物技术有限公司（产品编号为： siN05815122147-1-2）。

（二）白血病K562细胞的培养

将白血病K562细胞接种于含体积分数10%的新生牛血清、无抗生素的1640 培养基中，置于37℃、体积分数为5%的CO₂培养箱，饱和湿度下培养，每2天 换液传代，选用对数生长期、0.2%台盼蓝拒染率>95%的细胞进行实验。

（三）Real-time PCR法筛选PDCD4 siRNA有效序列

（1）实验分PDCD4 siRNA序列一组、PDCD4 siRNA序列二组、PDCD4 siRNA序列三和随机对照组（Negative Control，NC）；将设计合成的三个PDCD4 siRNA序列及随机对照分别以100nmol/L的终浓度转染到K562细胞（转染方法 参照Invitrogen公司Lipofectamine^TM 2000说明书）；

（2）转染后的K562细胞培养48h后，提取各组细胞总RNA（提取细胞总 RNA的方法参照Trizol试剂说明书），提取的总RNA用微量核酸测定仪进行定量， 测得A₂₆₀/A₂₈₀及其浓度；

（3）利用SYBR Green ⅠReal-time PCR以GAPDH为内参检测K562细胞内 PDCD4mRNA的表达水平：将步骤2）提取的总RNA进行逆转录PCR和Real-time PCR，逆转录PCR条件：70℃持续5min，42℃持续60min；Real-time PCR条件： ①94℃持续5min，②94℃持续30s，③PDCD4 60℃、GAPDH 57.5℃持续30s， ④72℃持续30s，⑤读板，⑥步骤②～⑤循环39次，⑦融解曲线分析，从55℃到 95℃，每1℃读一次板，停留2秒，PDCD4 mRNA的相对表达水平用△C_T和2^-△△CT计算；其中PCR引物由上海生工合成，PDCD4上游引物： 5'-GTTGGCAGTATCCTTAGCAT-3'，下游引物：5'-CATCTCCTTCGCTTACAAA-3'； GAPDH上游引物：5'-CAACGGATTTGGTCGTATT-3'，下游引物： 5'-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。

Real-time PCR检测结果如图1所示，其中PDCD4siRNA序列二（即本发明 提供的抑制PDCD4基因表达的siRNA）组的PDCD4mRNA表达水平与随机对 照组相比显著下降（P<0.05），而其余两个序列组与随机对照组的PDCD4 mRNA 表达水平无明显变化，表明本发明提供的PDCD4 siRNA能有效抑制PDCD4 mRNA的表达。

（四）Western bloting检测PDCD4 siRNA（抑制PDCD4基因表达的siRNA） 对细胞内PDCD4蛋白表达水平的影响

（1）实验分为三组，空白对照组（Blank），随机对照组（Negative control,NC）， PDCD4 siRNA组；将PDCD4 siRNA组和随机对照组分别以100nmol/L的终浓度 按Lipofectamine^TM 2000说明书的方法转染到K562细胞；

（2）经过转染的K562细胞培养48h后收集细胞，按细胞裂解液（RIPA） 说明书的方法提取细胞蛋白并用Bradford蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据定 量结果对各蛋白质样本进行校正，加入loading buffer，置沸水中煮10min；

（3）将步骤（2）处理过的蛋白质样本进行不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳（10% 聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶），电压80V，待样本进入分离胶后电 压改为120V，电泳50min；

（4）将凝胶上的蛋白条带转到PVDF膜上，电压10V半干转膜25min；TBST 洗膜5min；用质量百分比5%的脱脂奶粉封闭缓冲液将膜室温封闭1h；TBST洗 膜3次，每次5min；4℃过夜孵育一抗；TBST洗膜3次，每次5min；室温孵育 二抗1h；TBST洗膜3次，每次5min；ECL化学发光，成像系统拍照；Image J 图像分析软件分析PDCD4和β-actin的灰度，以β-actin作为内参照计算PDCD4 蛋白的相对表达水平；其中，10×TBS缓冲液：1mol/L Tris·HCl（pH7.5）10mL、 NaCl 8.8g加蒸馏水至1000mL，TBST缓冲液：20％Tween201.65mL、TBS 700 mL，混匀后即可使用，最好现用现配。

转染终浓度为100nmol/L的PDCD4 siRNA于K562细胞48h后，结果如图 2和图3所示PDCD4的蛋白表达明显下调。其中转染PDCD4 siRNA组，PDCD4 蛋白的表达水平相对于随机对照组显著下降（P<0.05）；而转染随机对照组的 PDCD4蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显变化，表明本发明提供的 PDCD4 siRNA能有效抑制PDCD4蛋白的表达。

（五）抑制PDCD4基因表达的siRNA（PDCD4 siRNA）对药物敏感性的影 响

（1）实验分空白对照组、随机对照组、PDCD4 siRNA组、药物组、随机对 照+药物组和PDCD4 siRNA+药物组，PDCD4 siRNA和随机对照的转染终浓度为 100nmol/L；

其中，所述的药物分别为三氧化二砷（ATO）、阿糖胞苷（Ara-c）或小檗碱 （BB）；

（2）取对数生长期K562细胞，各组细胞以1×10⁵/mL的密度接种于96孔 板，每孔50μL，按Lipofectamine^TM 2000说明书的方法转染PDCD4 siRNA或随 机对照，空白对照组和药物组用无血清Opti-MEM培养基替代siRNA，转染终体 积100μL（含细胞液50μL）；

（3）转染6h后，加入100μL含体积百分比20%的新生牛血清以及相应浓 度的药物（药物浓度分别为2μM ATO、2μM Ara-c和120μM BB）的1640培养 基（药物组、随机对照+药物组和PDCD4 siRNA+药物组加入100μL含药物和体 积百分比20%的新生牛血清的1640培养基，其余组加入100μL含体积百分比20% 的新生牛血清的1640培养基），终体积200μL，继续培养72h后每孔加入5mg/mL 的MTT液20μL，于培养箱中培养4h后，37℃、1000rpm/min离心10min，弃 上清，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO）；

（4）震荡使结晶充分溶解，在多功能酶标仪上测定吸光度A_570nm，以A_630nm作为参照，可间接反映细胞存活率；实验重复三次，计算增殖抑制率，增殖抑制 率=[1-（A_实验组/A_对照组）]×100%。

PDCD4 siRNA对As₂O₃(ATO)作用K562细胞敏感性的影响如表1所示：

表1：各组K562细胞增殖抑制率的比较

As₂O₃(ATO)对K562细胞的增殖具有抑制作用，PDCD4 siRNA可沉默PDCD4 基因的表达。转染PDCD4 siRNA到K562细胞，然后加入As₂O₃，72h后检测细 胞的增殖抑制率，siRNA可明显减弱As₂O₃对细胞药物毒性，恢复K562细胞的 生长。其中（ATO+siRNA）组的细胞增殖抑制率相对于（ATO+NC）组下降了8.56%， 两者联用表现为相互拮抗作用（Q<0.85）；（ATO+NC）组的细胞增殖抑制率相对 于单独ATO组无明显变化（P>0.05），其两者联用表现为相加作用（0.85≤Q≤ 1.15）。

PDCD4 siRNA对Ara-c作用K562细胞敏感性的影响如表2所示：

表2：各组K562细胞增殖抑制率的比较

Ara-c对K562细胞的增殖具有抑制作用，PDCD4 siRNA可沉默PDCD4基因 的表达。转染PDCD4 siRNA到K562细胞，然后加入Ara-c，72h后检测细胞的 增殖抑制率，siRNA可明显减弱Ara-c对细胞药物毒性，恢复K562细胞的生长。 其中（Ara-c+siRNA）组的细胞增殖抑制率相对于（Ara-c+NC）组下降了11.42%， 两者联用表现为相互拮抗作用（Q<0.85）；（Ara-c+NC）组的细胞增殖抑制率相对 于单独Ara-c组无明显变化（P>0.05），两者联用表现为相加作用（0.85≤Q≤1.15）。

PDCD4 siRNA对BB作用K562细胞敏感性的影响如表3所示：

表3：各组K562细胞增殖抑制率的比较

BB对K562细胞的增殖具有抑制作用，PDCD4 siRNA可沉默PDCD4基因的 表达。转染PDCD4 siRNA到K562细胞，然后加入BB，72h后检测细胞的增殖 抑制率，siRNA可明显减弱BB对细胞药物毒性，恢复K562细胞的生长。其中 （BB+siRNA）组的细胞增殖抑制率相对于（BB+NC）组下降了10.2%，两者联 用表现为相互拮抗作用（Q<0.85）；而（BB+NC）组的细胞增殖抑制率相对于单 独BB组无明显变化（P>0.05），两者联用表现为相加作用（0.85≤Q≤1.15）。

以上数据表明下调PDCD4的表达可以降低抗白血病化疗药物三氧化二砷、 阿糖胞苷或小檗碱对K562细胞的敏感性，减弱细胞毒性，从而恢复K562细胞生 长。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。