胰高血糖素样肽-1类似物单体、二聚体及其制备方法与应用

摘要

本发明提供一种GLP-1二聚体及其制备方法与应用。GLP-1二聚体是两个含有半胱氨酸的GLP-1单体通过半胱氨酸形成的二硫键连接而成。含有半胱氨酸的GLP-1单体其通式为7HAEX10T FTSX15V SSYLE X22X23AAKEFIX30W LX33KGR G37；其中，X10为甘氨酸或半胱氨酸，X15为天冬氨酸或半胱氨酸，X22为甘氨酸或半胱氨酸，X23为亮氨酸或半胱氨酸、X30为丙氨酸或半胱氨酸，X33为缬氨酸或半胱氨酸；且X10、X15、X22、X23、X30和X33中仅有一个为半胱氨酸。本发明的GLP-1二聚体在体内的半衰期可达到8～96小时以上，极大地便利了其临床推广和应用。

说明书

技术领域

本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种具有延 长的胰高血糖素样肽(GLP-1)类的体内半衰期的GLP-1二聚体。本发明还 涉及该GLP-1二聚体的制备方法以及其在制备治疗糖尿病药物、治疗和/或预 防肥胖症的药物中的应用。

背景技术

胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，以下简称：GLP-1)是主要由 小肠L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为 GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH₂(Mojsov S，J Clin Invest.1987 Feb；79(2)： 616-9)。GLP-1明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能 起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J，Diabetes.1998 Feb； 47(2)：159-69)。近期研究还表明GLP-1有胰腺再生作用(Drucker D J， 2003Dec；144(12)：5145-8)。此外，因为GLP-1为完全人源化多肽，作为临床 药物在安全上具有较大优势。然而，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅仅为3-5 分钟，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便。

目前已经有不少研究采用GLP-1类似物融合蛋白技术解决GLP-1类似 物在体内的存留时间(CN90101167.3、CN200710018734.2、 CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、 CN200610127237.1、CN200910009642.7)，然而，现有的技术与临床理想的 目标还有很大距离，普遍都还没有达到临床标准，最近Novo Norisk生产的利 拉鲁肽为GLP-1类似物，其对GLP-1进行了棕榈酸的修饰，并于2009年于美 国上市。但是利拉鲁肽也存在半衰期短的问题，其剂型仍需每日注射。

因此，目前需要解决GLP-1在体内半衰期短的问题。

发明内容

针对临床上GLP-1类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺 限，本发明的一个目的是提供一种半衰期较长的GLP-1的二聚体及其单体。

本发明的另一个目的是提供一种GLP-1二聚体及其单体的制备方法。

本发明的又一个目的是提供一种GLP-1二聚体在制备治疗糖尿病的药物 中的应用，以及该GLP-1二聚体在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的应 用。

本发明的再一个目的是提供一种以GLP-1二聚体作为有效成分的药用 组合物，其包含上述GLP-1二聚体。

其中，所述的药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的辅料，并且 所述药物组合物优选为注射剂，进一步优选为冻干粉针或溶液注射剂。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种胰高血糖素样肽-1类似物单体，所述单体具有 如下通式I：

⁷HAEX₁₀T FTSX₁₅V SSYLE X₂₂X₂₃AAK EFIX₃₀W LX₃₃KGR G³⁷；

其中，X₁₀为甘氨酸或半胱氨酸，X₁₅为天冬氨酸或半胱氨酸，X₂₂为甘 氨酸或半胱氨酸，X₂₃为亮氨酸或半胱氨酸、X₃₀为丙氨酸或半胱氨酸，X₃₃为缬氨酸或半胱氨酸；且X₁₀、X₁₅、X₂₂、X₂₃、X₃₀和X₃₃中仅有一个为半胱 氨酸。

如上所述的胰高血糖素样肽-1类似物单体，其选自：

SEQ ID NO 1：⁷HAECT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 2：⁷HAEGT FTSCV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 3：⁷HAEGT FTSCV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 4：⁷HAEGT FTSDV SSYLE CQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 5：⁷HAEGT FTSDV SSYLE GCAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 6：⁷HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFICW LVKGR G³⁷， 和

SEQ ID NO 7：⁷HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LCKGR G³⁷。

另一方面，本发明提供一种胰高血糖素样肽-1类似物二聚体，所述二聚 体由两个符合通式I的单体分子连接形成，形成所述二聚体的两个单体可以 相同或不同；

优选地，所述二聚体由所述单体通过半胱氨酸形成的二硫键连接而成。

再一方面，本发明提供所述胰高血糖素样肽-1类似物单体的制备方法， 所述方法包括Fmoc策略固相合成含有半胱氨酸的胰高血糖素样肽-1类似物 单体。

又一方面，本发明提供如前所述的胰高血糖素样肽-1类似物单体或二 聚体在制备用于治疗糖尿病及糖尿病相关疾病的药物中的应用。

再一方面，本发明提供如前所述的胰高血糖素样肽-1类似物单体或二 聚体在制备用于治疗和/或预防肥胖症及肥胖症相关疾病的药物中的应用。

一方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如前所述的 胰高血糖素样肽-1类似物单体或二聚体。

优选地，所述药物组合物中还包含一种或多种药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物组合物为注射剂。

更优选地，所述药物组合物为冻干粉针剂或溶液注射剂。

以下是本发明的详细描述：

(1)含有半胱氨酸的GLP-1单体

本发明所述的含有半胱氨酸的GLP-1单体的通式如下：

⁷HAEX₁₀T FTSX₁₅V SSYLE X₂₂X₂₃AAK EFIX₃₀W LX₃₃KGR G³⁷。

如人源GLP-1的序列⁷HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷。

上述含有半胱氨酸的GLP-1单体为人工合成序列，分别在GLP-1第10、 15、22、23、30或33位氨基酸上进行了修饰，由半胱氨酸取代了原有的氨 基酸，形成含有半胱氨酸的GLP-1单体，序列如下：

SEQ ID NO 1：⁷HAECT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 2：⁷HAEGT FTSCV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 3：⁷HAEGT FTSCV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 4：⁷HAEGT FTSDV SSYLE CQAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 5：⁷HAEGT FTSDV SSYLE GCAAK EFIAW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 6：⁷HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFICW LVKGR G³⁷，

SEQ ID NO 7：⁷HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LCKGR G³⁷。

GLP-1二聚体为含有半胱氨酸的GLP-1单体通过半胱氨酸形成二硫键连 接而成。可以于上述氨基酸序列中选择一个作为二聚体的其中一条单体，而 与另一条可为同样的序列或其他序列。

(2)本发明的药用组合物

本发明的药用组合物为含有GLP-1二聚体可以与一种或多种药学上可 接受的辅料共同制成药用组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂、pH调节 剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等等。

本发明所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或几种：甘露醇、低 分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。

pH调节剂为选自以下的一种或几种：枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、 盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸 钠或碳酸钾或碳酸铵盐、碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的 有机或无机酸和碱及盐等。

稳定剂为选自以下的一种或几种：EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸 钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二 醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选焦 亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷中的一 种或几种。

渗透压调节剂是氯化钠和/或氯化钾。

(3)注射剂的制备方法

本发明的药用组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药， 优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。

冷冻干燥注射剂的制备方法：取GLP-1二聚体溶液适量，加入水溶性填 充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使 其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌10-20 分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制 得白色疏松块状物，封口即得，每个规格含有GLP-1二聚体在5μg到1mg 之间。

溶液注射液的制备方法：取GLP-1二聚体溶液或冻干粉适量，加入水溶 性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节pH值至4-8 使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1-0.5％活性炭，在0-10℃下搅拌 10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得，每 个规格含有GLP-1二聚体在5μg到1mg之间。

(4)药用组合物的用途

本发明的GLP-1二聚体可以用在制备糖尿病治疗药物方面。具体地，本 发明的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式给药。剂量依治疗对象、给 药方式、症状及其它因素而改变。本发明的GLP-1二聚体在相当宽的剂量范 围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在5μg/人--1mg/人，每日一次或 每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包 括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应， 患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明 的范围。

本发明的GLP-1二聚体克服了GLP-1半衰期短的问题，所提供的GLP-1 二聚体在体内的半衰期可达到8～96小时以上，较单独给药的GLP-1的半衰 期(半衰期仅为3-5分钟)明显延长，极大地便利了其临床推广和应用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为实施例2中GLP-1二聚体的降血糖实验；

图2为实施例3中GLP-1二聚体的降血糖实验；

图3为实施例4中GLP-1二聚体的降血糖实验；

图4为实施例5中GLP-1二聚体的降血糖实验；

图5为实施例6中GLP-1二聚体的降血糖实验；

图6为实施例7中GLP-1二聚体的降血糖实验；

图7为实施例8中GLP-1二聚体的降血糖实验。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施 例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的 常规方法。

实施例1：多肽的固相合成

使用Fmoc策略的固相多肽合成方法，使用CSBio公司生产的CS 336X 型仪器进行本发明的含有半胱氨酸的GLP-1单体的合成。合成的方法按照 生产商的仪器说明书进行。

将制得的含有半胱氨酸的GLP-1单体使用HPLC C18半制备柱进行纯 化，流动相为乙腈。经脱盐及冷冻干燥得到含有半胱氨酸的GLP-1单体干 粉。本实施例中的二硫键通过碳酸氢铵或其他还原剂来形成。

实施例2：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 1及其他GLP-1单体形成)相关的降血糖功能

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 1的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 2的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 3的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 4的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 5的二 聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 6的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 1与SEQ ID NO 7的 GLP-1二聚体。

分别将上述二聚体(共计7种)各1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射 于小鼠(200μl/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中 的空白(Saline)为皮下注射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注 射于每只小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及 96小时测定小鼠的血糖，每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图1，结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。

实施例3：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 2及其他GLP-1单体形成)相关的降血糖功能。

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 2与SEQ ID NO 2的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 2与SEQ ID NO 3的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 2与SEQ ID NO 4的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 2与SEQ ID NO 5的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 2与SEQ ID NO 6的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 2与SEQ ID NO 7的 GLP-1二聚体。

分别将上述二聚体(共计6种)各1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射 于小鼠(200μl/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中 的空白(Saline)为皮下注射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注 射于每只小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及 96小时测定小鼠的血糖，每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图2结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。

实施例4：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 3及其他GLP-1单体形成)相关的降血糖功能

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 3与SEQ ID NO 4的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 3与SEQ ID NO 5的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 3与SEQ ID NO 6的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 3与SEQ ID NO 7的 GLP-1二聚体。

将上述二聚体(共计4种)各1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射于小 鼠(200μl/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中的空 白(Saline)为注射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只 小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测 定小鼠的血糖，每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图3结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。

实施例5：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 4及其他GLP-1单体形成)相关的降血糖功能

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 4与SEQ ID NO 5的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 4与SEQ ID NO 6的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 4与SEQ ID NO 7的 GLP-1二聚体。

将上述二聚体(共计3种)各1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射于小 鼠(200μl/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中的空 白(Saline)为注射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只 小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测 定小鼠的血糖，每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图4结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。

实施例6：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 5及其他GLP-1单体形成)相关的降血糖功能

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 5与SEQ ID NO 6的 GLP-1二聚体；

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 5与SEQ ID NO 7的 GLP-1二聚体。

将上述二聚体(共计2种)各1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射于小 鼠(200μl/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中的空 白(Saline)为注射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只 小鼠。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测 定小鼠的血糖，每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图5结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。

实施例7：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 6及其他GLP-1单体形成)相关的降血糖功能

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体为SEQ ID NO 6与SEQ ID NO 7的GLP-1 二聚体。

将此二聚体1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射于小鼠(200μl/只，6 只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中的空白(Saline)为注 射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只小鼠。分别于葡萄 糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖，每 次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图6结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。

实施例8：GLP-1二聚体(由SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 7单体形成)相关的降血糖功能

本实施例中，采用的GLP-1二聚体如下：

含有半胱氨酸的GLP-1单体分别为SEQ ID NO 7与SEQ ID NO 7的 GLP-1二聚体。

将此二聚体1mg溶于1ml生理盐水，皮下注射于小鼠(200μl/只，6 只/组，购自中科院上海实验动物中心)，本实施例中的空白(Saline)为注 射生理盐水。给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只小鼠。分别于葡萄 糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖，每 次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖。

结果见图7结果显示上述的GLP-1二聚体具有较长的体内半衰期。