A、O和C型口蹄疫病毒的试剂盒及使用方法

摘要

本发明公开一种检测牛和猪以及相关牛和猪的产品是否感染A、O或C型口蹄疫病毒的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒中至少有三对用于扩增A型口蹄疫目的基因的引物、扩增C型口蹄疫目的基因的引物和用于扩增O型口蹄疫目的基因的引物组成。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对牛和猪以及相关牛和猪的产品是否感染特定的传染病进 行检测的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。确切讲是本发明是一种检测牛 和猪以及相关牛和猪的产品是否感染A、O或C型口蹄疫病毒的试剂盒，以及 这种试剂盒的使用方法。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是一种由口蹄疫病毒(Foot and mouth  disease virus，FMDV)引起的危害牛、羊等偶蹄动物的严重的急性热性高度接触 性传染病。由于其传播速度快，不易控制和消灭，严重危害世界动物贸易，被 世界卫生组织列为必须上报传染病之一。

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科(picornaviridas)中的口蹄疫病毒属 (aphthavirus)。共包括A、C、O、Asia I、SAT I、SAT II及SAT III型7个血 清型，各血清型之间无交叉保护力。FMDV的病毒粒子直径20-25nm，为正二 十面体结构，近似圆形；基因组为全长8500(nt)的正链RNA，包括一个开放 阅读框(open reading frame，ORF)，5’-非编码区(5’-Untraslated Region，5’-UTR) 和3’-非编码区(3’-Untraslated Region，3’-UTR)；ORF编码病毒多聚蛋白，依 赖于自身编码的蛋白酶(L、2A、3C)及少数的宿主因子，在经过3级裂解后， 形成4种病毒结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和9种非结构蛋白(Lab、 Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)；四种结构蛋白各60分子构成病毒颗 粒，VP1靠近由五个原粒组成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于远端，VP4 则完全位于衣壳里面。

尽管目前国内外对口蹄疫的病原学、血清分型、诊断做了大量的研究，但 口蹄疫病毒几乎遍及世界各地，口蹄疫对偶蹄类经济动物的威胁众所周知，它 的发病率和造成的经济至今仍为各类传染病之首。2004年，台湾爆发的口蹄疫 导致了600万头猪被屠宰，直接和间接经济损失到120亿美元。在畜牧兽医方 面，它也威胁着多种家畜和很多野生动物的繁衍和生存。O型和A型口蹄疫基 本呈世界性分布，Asia 1在我国曾经流行，到目前已经60年没有发生，科研人 员倾向于其可能已经在中国灭绝，SAT I、SAT II及SAT III型主要存在于非洲， C型口蹄疫流行范围相对较小，但对我国威胁较大。由于口蹄疫血清亚型众多， 毒力相差很大，所以在临床症状差别较大。尤其口蹄疫与猪水泡病、水泡性口 炎等类似症状的病毒，在临床上很难区分，而且临床症状和病理变化因感染动 物的种类、年龄、病程长短及感染毒株毒力等不同而有所差别，可能缺乏特征 病症，这给口蹄疫的诊断和防治带来极大困难。因此，单靠临床诊断难以定性。 快速简单的实验室诊断方法是确诊口蹄疫唯一有效地途径。随着分子生物学技 术的快速发展，口蹄疫诊断技术的研究不断取得新的进展，为口蹄疫病毒核酸 序列分析创造了条件。

为了确定口蹄疫是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全 可靠，还必须通过通过病原学检测以确诊病原的存在，一般检测方法为生物学 实验、血清型诊断技术和分子生物学技术等诊断技术，但是这些方法有的敏感 性不高、有的特异性不强、有的检出率较低，即使病毒分离技术被认为是检测 口蹄疫的金标准，但其确认结果至少需要7天，检测周期太长，并且这些技术 普遍费用太高，存在二次散毒的隐患，一般基层很难开展此项工作。同时，O 型和A型口蹄疫近年在我国流行比较普遍，而C型口蹄疫在我国周边亚洲地区 具有流行史，因此建立一种快速诊断C型、O型和A型口蹄疫的诊断技术，完 成对O型和A型口蹄疫的快速诊断以及对C型口蹄疫病毒进行监控，防止其传 入我国具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种快速、简便、灵敏和经济的检测试剂盒及使用方法，且这 种方法用于检测临床样品时，可以区分动物所感染的是A、O和C型口蹄疫病 毒。

本发明的试剂盒中至少有三对引物组成，其中的两对引物分别是：

第一对引物是用于扩增A型口蹄疫目的基因的引物，其中

上游引物：5-CAT CTA CGA GGC TGT CAA G-3

下游引物：5-TAG GGT GGA AAC CGA ACT-3

第二对引物是用于扩增C型口蹄疫目的基因的引物，其中

上游引物：5-GAA CTA CGG AGG CGA GAC G-3

下游引物：5-TGG TGC GGT GTA TGG GAG-3

第三对引物是用于扩增O型口蹄疫目的基因的引物，其中

上游引物：5-GACCATACAGGAGAAGTT-3

下游引物：5-CCCATCGCAGGTAAAGTG-3

本发明中所使用的其他试剂可以从市场中直接购置。

本发明的方法从待检动物的器官拭子或OP液或血液或病死动物的组织中 提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以试剂盒中的特异性A、O和C型口 蹄疫的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检 动物是否感染有A、O和C型口蹄疫病毒。

本发明中从待检动物的器官拭子或OP液或血液或病死动物的组织，用生理 盐水稀释或研磨成1∶5的乳悬液，全基因组RNA提取的方法采用Trizol法。

本发明较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法快捷。本发明可以 相当方便地一次性鉴定出属于A、O型以及C型口蹄疫哪一种病毒感染，可以 及时快捷的对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，以最短的时间做出 正确的处理办法，这对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积极的意义。另外， 本发明采取的提取全基因组RNA提取的Trizol法具有快速、简单、成本低和所 需试剂少的特点，特别适于小样品的提取。因此，本发明具有广泛的市场应用 前景。

附图说明

图1为本发明与标准样进行的特异性检测的电泳图，从左至右依次为：M， DNA分子量标准DL-2000(marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp)；泳道1为A、O型和C型口蹄疫多重RT-PCR检测结 果；泳道2为O型口蹄疫标准样品RT-PCR检测结果；泳道3为C型口蹄疫标 准样品RT-PCR检测结果；泳道4为A型口蹄疫标准样品RT-PCR检测结果； 泳道5为阴性对照。

图2为临床样品评估的电泳图。从左至右依次为：M，DNA分子量标准 DL-2000(marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp)；泳道1为建立的A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR检测水泡性口炎病 毒的结果；泳道3为建立的A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR检测猪水泡病病 毒的结果；泳道4为建立的A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR检测Asia1型口蹄 疫病毒的结果；泳道5阴性对照；泳道6为建立的A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR 检测A、O和C型口蹄疫病毒的结果。

具体实施方式

以下是本发明的实施例及对比检测情况。

实施例<一>A、O和C型口蹄疫多重RT-PCR检测试剂盒的使用方法

1A、O和C型口蹄疫的核酸提取

无菌采集待检动物的器官拭子或OP液或血液或病死动物的组织，制成1∶5 的乳悬液，用Trozol法提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以试剂盒中的 特异性A、O和C型口蹄疫的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳， 根据电泳图谱分析被检动物是否感染有A、O和C型口蹄疫病毒。

2多重RT-PCR反应

本试剂盒参照Genbank登录的A、O和C型口蹄疫编码区基因的序列，设 计并合成三对引物。引物序列见如下表1：

表1本试剂盒涉及多重RT-PCR扩增的引物及片段的大小

以提取的FMDV的RNA为模板，在50μL反应体系中加入FMDV的RNA 各2μL，10μmol/L的上下游引物各1.2μL，2.5mmol/L的dNTP 2μL，5U Taq 聚合酶(Nippon Gene)，10×缓冲液5μL，加无菌的双蒸水至50μL。PCR反应 程序如下：94℃，2min，然后是循环程序94℃ 30s，55℃ 1min，72℃50s，36 个循环。最后72延伸10min。PCR反应在BIOMRTRA扩增仪中进行。

实施例<二>FMDV多重RT-PCR方法的特异性和敏感性试验

1FMDV多重RT-PCR的敏感性试验

1.1A、O型和C型FMDV的定量

A、O型和C型FMDV提取的病毒RNA1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32分别进 行稀释。

1.2结果检测

PCR产物反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。然后用溴化乙锭染色，BIO-RAD 凝胶成像仪中照相并分析，电泳结果见图1，从图中可以看出A、O型和C型 FMDV的多重RT-PCR可以特异的检出病毒目的基因。

2.FMDV多重RT-PCR的特异性试验

2.1O型、A型FMDV和猪水泡病病毒的提取和多重RT-PCRT反应

分别用经过RT-PCR鉴定过的O型、A型FMDV和猪水泡病病毒中提取的 RNA作为A、O和C型口蹄疫的多重PT-PCR的反应模板，以健康猪的血液提 取的RNA作为阴性对照模板。然后程序按照实施例<一>中的A、O和C型口 蹄疫的多重PT-PCR体系和条件进行反应，反应产物用琼脂凝胶电泳检测。

2.2特异性结果分析

O型、A和C型FMDV与猪水泡病病毒、水泡性口炎病毒等病毒的RT-PCR 方法交叉反应结果见图2。图中1-4道分别是水泡性口炎病毒、Asia 1型FMDV、 猪水泡病病毒的核酸和健康猪血清的RNA。从图中可以看见上述三种病毒与A、 O和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法无交叉反应。健康猪血液中提取的RNA的 反应结果也为阴性。上述结果表明本实验所建立的A、O和C型口蹄疫的多重 PT-PCR方法与上述三种在临床症状表现相似的病毒无交叉反应。

3A、O和C型口蹄疫的多重PT-PCR临床样品检测

3.1临床样品的准备

共包括137份临床样品为单个PCR和ELISA共同诊断为A、O和C型口蹄 疫阳性的血清和组织样品。

3.2多重RT-OCR检测结果

对上述142个A、O和C型口蹄疫阳性的临床样品用所建立的多重RT-PCR 方法检测，检测结果见表2，从表中可以看出，多重RT-RCR方法对142个A、 O和C型口蹄疫为阳性的临床样品的检出率为96.8％，总体上与单个PCR的检 出率基本相同，尤其检测O型口蹄疫病毒检出率与单个PCR相同，检出率为 100％，同时比ELISA检出率要高5个百分点。

4结论

上述试验证明所建立的A、O和C型口蹄疫的多重PT-PCR方法方法具有敏 感性高、特异性强、快速、实验设备简单和操作容易等特点，适合于实验室和 临床对A、O和C型口蹄疫的快速诊断。

表2多重PCR检测方法的敏感性比较