无DNA残留的RNA提取试剂盒及RNA提取方法

摘要

本发明公开无DNA残留的RNA提取试剂盒及RNA提取方法，无DNA残留的RNA提取试剂盒包括RNA洗脱液、DNA洗脱液、至少一个与RNA洗脱液配合使用的DNA吸附柱以及至少一个与DNA洗脱液配合使用的RNA吸附柱。RNA提取方法RNA提取方法，至少包括如下两个步骤：A步骤，用RNA洗脱液将DNA吸附柱上的RNA洗脱下来；B步骤，用DNA洗脱液将RNA吸附柱上的DNA洗脱下来。本发明简单快速，提取的RNA纯度高，DNA残留少，一般紫外灯下肉眼不能见到DNA残留。

说明书

技术领域

本发明涉及RNA提取，属于核酸纯化领域，特别涉及无DNA残留的无DNA 残留的RNA提取试剂盒及RNA提取方法。

背景技术

分子生物学研究中提取纯化RNA是一个基础性的工作，各种临床检测或 者基础科研中都需要提取纯化RNA。RNA提取纯化的一个难点就是经常会残留 DNA。而残留DNA导致的RNA纯度不高可能对下游实验造成不利的影响。

目前国内外提取纯化RNA的方法过程中去除DNA残留的主要方法有两类： 一类是异硫氰酸胍一步法提取RNA(Trizol法)通过苯酚氯仿有机分相的方 法来去除；另一类是加上DNA酶消化的方法来去除。前一类方法缺点主要是 两点：一是使用了苯酚氯仿等毒性物质；二是很多样品尤其是植物样品含多 糖多酚或者复杂次级代谢产物，往往会干扰苯酚氯仿有机分相的过程，从而 导致无法去除DNA残留。

后一类方法虽然是目前主流的去除DNA残留的解决方案，但是也有一系 列缺点，例如DNA酶消化的操作时间长，步骤繁琐，消化过程中经常导致RNA 降解，残留DNA多的情况下常有消化不完全的情况发生，DNA酶成本也非常 高。

因此，目前迫切需要一种更好的方法来解决RNA提取纯化中DNA的残留 问题。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种不使用苯酚、 氯仿等毒性物质的无DNA残留的RNA提取试剂盒及RNA提取方法，并且能够 有效解决RNA提取纯化中的DNA残留问题。

本发明的技术方案是这样实现的：无DNA残留的RNA提取试剂盒，包括 RNA洗脱液、DNA洗脱液、至少一个与RNA洗脱液配合使用的DNA吸附柱以及 至少一个与DNA洗脱液配合使用的RNA吸附柱。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，所述RNA洗脱液含有：浓度为 2-5mol/L的异硫氰酸胍，以及体积分数为0.5-25％的无水乙醇。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，所述DNA洗脱液含有：浓度为 0.1-1mol/L的异硫氰酸胍，以及体积分数为3-30％的无水乙醇。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，还包括裂解液和漂洗液。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，所述裂解液中含有浓度为2-5mol/L 的异硫氰酸胍。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，所述漂洗液中含有：浓度为 10-100mmol/L的氯化钠，以及体积分数为60-80％无水乙醇。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，所述RNA洗脱液和/或所述DNA洗脱 液中含有：pH为6.0～8.0的Tris-HCl、浓度为5-50mmol/L。Tris-HCl为三 羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液，此为本领域技术人员公知常识。

上述无DNA残留的RNA提取试剂盒，DNA吸附柱和RNA吸附柱均为硅膜 吸附柱。

利用上述RNA提取试剂盒的无DNA残留的RNA提取方法，至少包括如下 两个步骤：A步骤，用RNA洗脱液将DNA吸附柱上的RNA洗脱下来；B步骤， 用DNA洗脱液将RNA吸附柱上的DNA洗脱下来。

上述无DNA残留的RNA提取方法，包括如下步骤：

(1)利用裂解液对样品进行裂解得到裂解物；

(2)将裂解物转入离心管，离心，取上清液，加入上清液的1/2体积的 无水乙醇混匀转入DNA吸附柱进行吸附离心，离心，弃掉滤液；

(3)A步骤，用RNA洗脱液将DNA吸附柱上的RNA洗脱下来：将RNA洗 脱液加入所述DNA吸附柱，离心，收集滤液；

(4)向步骤(3)中得到的滤液中加入其体积的二分之一的无水乙醇混匀 后加入RNA吸附柱中，离心，弃掉滤液；

(5)B步骤，用DNA洗脱液将RNA吸附柱上的DNA洗脱下来：将DNA洗 脱液加入RNA吸附柱，离心，弃掉滤液；

(6)向RNA吸附柱中加入漂洗液，离心，弃掉滤液；

(7)用无核糖核酸酶水洗脱得到RNA洗脱液。

上述无DNA残留的RNA提取方法，步骤(6)重复2次或2次以上。

上述无DNA残留的RNA提取方法，步骤(7)重复2次或2次以上。

本发明的有益效果是：传统的试剂盒均采用一根硅膜吸附柱，整个提取 过程中只有一次RNA吸附【先洗脱DNA以将DNA和RNA进行分离，然后将RNA 洗脱下来得到RNA洗脱液】。在实际操作，只采用一根硅膜吸附柱(一次RNA 吸附)的RNA提取方法和试剂盒去除DNA效果不好，残留DNA多。本发明采 用两根吸附柱【二次RNA吸附：RNA洗脱液和DNA吸附柱组合使用可以实现 吸附DNA洗脱RNA，DNA洗脱液和RNA吸附柱组合使用可以实现吸附RNA洗脱 DNA，最后从RNA吸附柱上将RNA洗脱下来得到RNA】的方法和试剂盒可以大 大提高去除DNA效果，残留DNA少。

裂解液裂解样品后加入乙醇可以尽可能的将RNA吸附到DNA吸附柱上的 同时减少DNA吸附；RNA洗脱液可以尽可能洗脱RNA的同时，将DNA保留在 DNA吸附柱上从而减少残留。DNA洗脱液可以选择性的漂洗去除RNA吸附柱上 的DNA而保留RNA。漂洗液漂洗掉蛋白和杂质。

本发明综合利用了两次硅膜柱吸附RNA和配套优化的溶液系统在RNA提 取过程中来消除基因组DNA残留。能够有效地解决RNA提取纯化中基因组DNA 残留问题，和现有的方法和试剂盒相比，不用苯酚、氯仿等毒性物质，也不 需要乙醇沉淀等步骤，操作更简单快速【单个样品操作一般可在30分钟内完 成】，大大简化了步骤和操作时间，适应性广泛，可重复性好，成本大幅度降 低。

本发明提取的RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2％； 0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70％-80％的 RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。

纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA， OD₂₆₀/OD₂₈₀读数(10mMTris，pH7.5)在1.8-2.1之间。本发明提取的RNA的 OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值为1.9～2.0。

附图说明

图1泳道1为标记(Marker)，泳道2、3、4是用北京艾德莱生物科技有 限公司的RN09EASYspin植物RNA提取试剂盒分别提取的百合花瓣、雌蕊、 雄蕊RNA的电泳图；泳道5、6、7是实施例1中分别提取的百合花瓣、雌蕊、 雄蕊RNA的电泳图。

图2泳道8是用北京艾德莱生物科技有限公司的RN09EASYspin植物RNA 提取试剂盒提取的草茎干RNA的电泳图；泳道9是本发明提取的草茎干RNA 的电泳图

具体实施方式

结合附图对本发明做进一步的说明：

实施例1.提取百合花瓣、雌蕊、雄蕊的RNA

(1)分别取50mg百合花花瓣、50mg百合花雌蕊、50mg百合花雄蕊，并 分别与0.5mL裂解液匀浆，得到裂解物。所述裂解液含有浓度为10mmol/L、 pH为7.0的Tris-HCl，浓度为3mol/L的异硫氰酸胍。裂解液的制备方法是： 称取异硫氰酸胍35.45克，加入适量无核糖核酸酶水溶解，再加入pH为7.0、 浓度为1mol/L的Tris-HCl 1mL，混匀，定容到100mL。

(2)将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13000rpm离心5-10 分钟取上清液，加入上清液的1/2体积的无水乙醇混匀转入一个DNA吸附柱 进行吸附离心。DNA吸附柱为硅膜吸附柱。

(3)向DNA吸附柱中加入0.5mL RNA洗脱液，13000rpm离心1分钟将 RNA从DNA吸附柱上洗脱后得RNA洗涤液，并丢弃DNA吸附柱。所述RNA洗 脱液含有浓度为10mmol/L、pH为6.5的Tris-HCl，浓度为3mol/L的异硫氰 酸胍和体积分数为2％的无水乙醇。RNA洗脱液制备方法是：称取异硫氰酸胍 35.45克，加入适量无核糖核酸酶水溶解，再加入pH为6.5、浓度为1mol/L 的Tris-HCl 1mL和2mL无水乙醇，混匀，定容到100mL。

(4)向RNA洗涤液中加入RNA洗涤液的1/2体积的无水乙醇混匀转入一 个RNA吸附柱进行吸附离心。RNA吸附柱均为硅膜吸附柱。

(5)向RNA吸附柱中加入0.7mLDNA洗脱液，13000rpm离心1分钟，漂 洗RNA吸附柱一次。所述DNA洗脱液含有浓度10mmol/L、pH为7.5的 Tris-HCl，浓度为1mol/L的异硫氰酸胍，体积分数为20％的无水乙醇。DNA 洗脱液制备方法是：称取异硫氰酸胍11.84克，加入适量无核糖核酸酶水溶 解，再加入pH为7.5、浓度为1mol/L的Tris-HCl 1mL和20mL无水乙醇， 混匀，定容到100mL。

(6)加入0.5mL漂洗液，13000rpm离心1分钟漂洗RNA吸附柱，共二 次。所述漂洗液含有浓度为10mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl，浓度为50mmol/L 的氯化钠，体积分数为80％的无水乙醇。漂洗液制备方法是：量取pH为7.5、 浓度为1mol/L的Tris-HCl 1mL，再量取浓度为5mol/L的氯化钠1mL，加入 适量无核糖核酸酶水混匀，再加入80mL无水乙醇，混匀，定容到100mL。

(7)30-50μL无核糖核酸酶的水加入RNA吸附柱，13000rpm离心1分 钟洗脱得到RNA洗涤液。琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1：从图片可以看 出采用本发明方法提取的百合花瓣、雌蕊、雄蕊RNA残留DNA明显减少甚至 不可见。

实施例2.提取草茎干的RNA

(1)取50mg草茎干与0.5mL裂解液匀浆，得裂解物。所述裂解液含有 浓度为10mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为4mol/L的异硫氰酸胍。裂 解液制备方法是：称取异硫氰酸胍47.26克，加入适量无核糖核酸酶水溶解， 再加入pH为8.0、浓度为1mol/L的Tris-HCl 1mL，混匀，定容到100mL。

(2)将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13000rpm离心5-10 分钟取上清液，加入上清液的1/2体积的无水乙醇混匀转入一个DNA吸附柱 进行吸附离心。DNA吸附柱为硅膜吸附柱。

(3)向DNA吸附柱中加入0.5mL RNA洗脱液，13000rpm离心1分钟将 RNA从DNA吸附柱上洗脱后得到RNA洗涤液，并丢弃DNA吸附柱。所述RNA 洗脱液含有浓度为10mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl，浓度为3mol/L的异硫 氰酸胍和体积分数为2％的无水乙醇。RNA洗脱液制备方法是：称取异硫氰酸 胍35.45克，加入适量无核糖核酸酶水溶解，再加入pH为7.5、浓度为1mol /L的Tris-HCl 1mL和2mL无水乙醇，混匀，定容到100mL。

(4)向RNA洗涤液中加入RNA洗涤液的1/2体积的无水乙醇混匀转入一 个RNA吸附柱进行吸附离心。RNA吸附柱均为硅膜吸附柱。

(5)向RNA吸附柱中加入0.7mLDNA洗脱液，13000rpm离心1分钟，漂 洗RNA吸附柱一次。所述DNA洗脱液含有浓度为10mmol/L、pH为7.5的 Tris-HCl，浓度为0.5mol/L的异硫氰酸胍，体积分数为30％的无水乙醇。DNA 洗脱液制备方法是：称取异硫氰酸胍5.92克，加入适量无核糖核酸酶水溶解， 再加入pH为7.5、浓度为1mol/L的Tris-HCl 1mL和30mL无水乙醇，混匀， 定容到100mL。

(6)加入0.5mL漂洗液，13000rpm离心1分钟，漂洗RNA吸附柱二次。 所述漂洗液含有浓度为10mmol/L、pH为7.5的Tris-HCl，浓度为50mmol/L 的氯化钠，体积分数为60％的无水乙醇。漂洗液制备方法是：量取pH为7.5、 浓度为1mol/L的Tris-HCl 1mL，再量取浓度为5mol/L的氯化钠1mL，加入 适量无核糖核酸酶水混匀，再加入60mL无水乙醇，混匀，定容到100mL。

(7)30-50μL无核糖核酸酶的水加入RNA吸附柱，13000rpm离心1分 钟洗脱得到RNA。琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2：从图片可以看出采用本 发明方法提取的草茎干RNA残留DNA明显减少甚至不可见。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明创造所作的举例，而并非对本发 明创造具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说 明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有 的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发 明创造权利要求的保护范围之中。