抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)测定试剂盒(发色底物法)

摘要

本发明公开了一种发色底物法检测血浆中抗凝血酶III（AT-III）活性的试剂盒。本发明试剂盒包含肝素衍生物、凝血酶和发色底物试剂；所述肝素衍生物由肝素通过肝素酶II降解，从肝素上裂解出一个或多个不饱和双糖而得。本发明检测试剂盒能够避开血浆样本中肝素辅助因子II（HC-II）的干扰，具有抗干扰能力强、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、快速、仪器兼容性强等优点，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及医学体外诊断领域，特别涉及一种发色底物法检测抗 凝血酶III的试剂盒。

背景技术

抗凝血酶III（antithrombin III，AT-III）是一种依赖于肝素的丝氨 酸蛋白酶抑制剂，是一种重要的抗凝血因子，在血浆中承担着 60%~70%的抗凝血酶活性，在维持血液生理性凝血与抗凝血平衡中起 着重要的作用。AT-III由肝脏、血管内皮细胞和巨核细胞合成，分子 量约为60000Da，属于α2-球蛋白，其基因位于第1号染色体（1p23）。

在血栓形成过程中，AT-III是一个非常重要的调节剂，在肝素的 催化下，通过与凝血酶或凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa、纤溶酶等丝 氨酸蛋白酶以1:1的比例形成复合物，从而使这些酶失去活性，发挥 抗凝作用。

正常人AT-III的血浆浓度为20～30mg/dl，活性为80%～130%， 波动范围相对狭窄，当血液中AT-III水平低于正常范围，则增加形成 血栓的风险，是发生静脉血栓和肺栓塞的常见原因之一。血液中AT-III 缺乏可由多种原因造成，如AT-III合成降低，主要见于肝硬化、重症 肝炎、肝癌晚期等；AT-III丢失增加，见于肾病综合症；AT-III消耗 增加，见于血栓前期和血栓性疾病，如弥散性血管内凝血（DIC）、心 绞痛、心肌梗死等；先天性AT-III缺陷或异常。因此，AT-III在临床 诊断中是一个非常重要的指标。

目前，测定AT-III的方法主要分为三类：免疫学分析方法、凝固 法和发色底物法。

免疫学分析方法是通过单向放射免疫扩散法、免疫比浊法以及酶 联免疫吸附法测定样本中AT-III的浓度。这种方法比较特异和灵敏， 但是操作繁琐、耗时，由于该方法在测定AT-III过程中，非活性的AT-III 也参与了免疫学反应，检测的AT-III浓度并不能完全反映AT-III活性 水平，这对于由于AT-III活性降低而导致的AT-III缺乏II型的病人， 检出的高值结果明显是不合适的。

凝固法是通过血浆凝固时间直接或间接地测定样本中AT-III活 性，主要包括一步法和两步法。一步法是将检测样本与AT-III缺乏的 血浆混合，通过加入相应试剂激活外源性凝血途径或内源性凝血途径， 测定凝固时间，与参考标准进行对照，从而求得AT-III的活性，该方 法有多种蛋白酶参与反应，测定易受影响。两步法是将血浆通过加热 进行脱纤维蛋白处理，再与过量的凝血酶孵育，残余的凝血酶活性通 过测定加入血浆或纤维蛋白原后的凝固时间而换算出样本中AT-III的 活性，该方法缺点在于操作比较繁琐、费时，需要将血浆加热变性进 行脱纤维，从而会导致AT-III水平的降低。

发色底物法是在待测血浆中加入过量的凝血酶，在肝素存在下， 凝血酶与血浆中的AT-III形成1:1复合物，剩余的凝血酶作用于底物， 裂解出显色基团，显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆中 AT-III活性呈负相关。由于该方法灵敏度高、准确性好、检测时间短， 且能够适用于多种自动化分析仪器，目前，临床上已广泛应用。但是 该方法也存在一定的缺陷，该法是通过加入外源性凝血酶来分析样本 中AT-III活性，由于样本中也存在另一个肝素催化的凝血酶抑制剂— —肝素辅助因子II（HCII），因而测定剩余凝血酶的活性是凝血酶与 AT-III和HCII反应后剩余的活性，这在HCII水平正常的病人，AT-III 的缺乏将有可能由于HCII的抗凝血酶活性而掩盖。因此，该法易受 样本中HCII的干扰而导致AT-III的测定不准确，尤其是在AT-III缺 乏的样本中。

有研究显示，在肝素存在下HCII对凝血酶的抑制作用取决于离 子强度。美国专利US5646007通过提高盐的浓度，使凝血酶的构象发 生变化，HCII对凝血酶测定的干扰降低，但凝血酶对发色底物的敏感 度也随之降低。

Demers等人（Thrombosis and Hemostasia，69（3），pp.231-235 （1993））报道采用FXa替代凝血酶，不会受到HCII的抑制，但是用 FXa分析价格更加昂贵，而且FXa不太稳定，分析时需要大量稀释， 不太适合自动分析仪。

发明内容

针对目前现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种发色 底物法检测抗凝血酶III（AT-III）活性的试剂盒，该试剂盒抗干扰能 力强、灵敏度高，具有广泛的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗凝血酶III活性检测 试剂盒，该试剂盒包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂包含肝素衍 生物、凝血酶，所述R2试剂包含发色底物试剂；所述肝素衍生物是 由肝素通过肝素酶II降解，从肝素上裂解出一个或多个不饱和双糖而 得。

上述试剂盒中，所述肝素衍生物能够增强AT-III的抗凝血酶活性， 但并不增强HCII的抗凝血酶活性，从而可以消除HCII对AT-III活性 测定的影响。

所述肝素衍生物的制备方法包括以下步骤：

步骤1：将肝素溶于pH值为6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，得肝素母 液；

步骤2：将肝素酶II加入上述肝素母液中，所得混合物于25-40℃ 反应20-40小时；

步骤3：将上述反应后的混合物于80-100℃灭活肝素酶II。

上述制备方法中，步骤1中所述肝素为人、牛或猪肝素中的任意 一种，优选猪肝素；所述肝素在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为1000～ 4000U/ml，优选浓度为2000U/ml。

步骤2中所述肝素酶II来源于肝素黄杆菌，可由商业化途径获得。

步骤2所述肝素酶II与肝素母液中所述肝素的量之比为1IU： 5000～10000U，优选比例为1IU：8000U。

上述制备方法中，步骤2还包括用紫外分光光度计分别检测所述 反应前、后，反应混合物在232nm处的吸光度值，将所述反应后的混 合物吸光度较反应前增强5%-20%认定为生成了所述肝素衍生物。优 选地，将所述反应后的混合物吸光度较反应前增强15%认定为生成了 所述肝素衍生物。

上述制备方法中，步骤3所得包含肝素衍生物的反应混合物，可 以直接配制R1试剂，也可以用本领域技术人员已知的分离方法从所 述混合物中分离出肝素衍生物作为R1试剂配制的原料，例如，使用 根据粒子大小分离的葡聚糖凝胶色谱柱纯化获得肝素衍生物。

上述试剂盒中，所述凝血酶选自人、牛、猪凝血酶中的任意一种， 优选牛凝血酶。

作为优选，上述试剂盒中所述R1试剂、R2试剂为冷冻干燥试剂。

所述R1冷冻干燥剂由包含肝素衍生物、凝血酶以及缓冲剂、表 面活性剂、稳定剂、防腐剂的试剂经冷冻干燥制成。

所述R2冷冻干燥剂由包含发色底物、赋形剂和防腐剂的试剂经 冷冻干燥制成；所述R2试剂中的赋形剂选自甘露醇、葡萄糖、乳糖、 B SA中的任意一种，防腐剂选择本领域技术人员已知的防腐剂，如叠 氮钠。

作为优选，上述试剂盒还包括R1复溶试剂，所述R1复溶试剂包 含无机盐和缓冲液，用于R1冷冻干燥剂的复溶重建。

上述R1复溶试剂中，所述无机盐为氯化钠或氯化钾，优选氯化 钾。

工作浓度的定义：在用上述试剂盒检测样本AT-III活性的过程中， 所述R1冷冻干燥剂用R1复溶试剂复溶后，与稀释样本混合，所形成 的分析混合物中各组分的浓度被定义为其工作浓度。

上述试剂盒中，所述肝素衍生物的工作浓度为0.25-3.0U/ml，优 选工作浓度为1.6U/ml。

所述凝血酶的工作浓度为5-20IU/ml，优选工作浓度为10.9IU/ml。

所述氯化钠或氯化钾的工作浓度为0.1M-0.3M。此浓度范围的氯 化盐不会引起凝血酶不利的构象变化，R1试剂中的肝素衍生物能够增 强AT-III的抗凝血酶活性，且HCII对AT-III活性测定的影响率不超 过5%。

在发色底物法检测AT-III活性的过程中，作为凝血酶底物，要求 具有较高的敏感性和较好的水溶性，才能有效提高检测的灵敏度，且 具有较宽的线性范围，保证检测结果的准确性。如果底物的溶解度过 低，试剂接近饱和状态，检测过程中易产生沉淀而导致测定结果的不 准确。

本发明试剂盒中，所述R2试剂中的发色底物为

Bz-Phe-Val-Arg-pNA（S-2160）、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl（S-2238）、 Tos-Gly-Pro-Arg-pNA（Chromozym TH）、H-D-Phe-Pro-Arg-pNA中的 任意一种；优选发色底物为H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl，其工作浓度 为0.2-1.7μmol/ml，优选工作浓度为0.42μmol/ml。

作为优选，上述试剂盒还包括AT-III的校准品，所述校准品由正 常健康人血浆添加稳定剂和防腐剂，经冷冻干燥制成。正常健康人血 浆可以从商业途径获得，也可以从健康个体获得，将收集的正常健康 人血浆混合后进行AT-III活性检测，检测值应在80%-120%。血浆中 加入适当的甘氨酸、叠氮钠，混合后通过过滤除去不溶颗粒，调节pH 值至6.0-9.0，优选7.5，分装后冻干，并用WHO抗凝血酶国际标准品 血浆对AT-Ⅲ校准品进行定值。

与现有技术相比，本发明试剂盒具有如下特点：

（1）特异性强，不受血浆样本中HCII的干扰。

（2）灵敏度高，最低检测限在5%以下。

（3）检测线性范围宽，最高检测限能达到150％。

（4）适用面广，仪器兼容性强，可适用于多种血凝分析仪。

附图说明

图1为本发明试剂盒的校准曲线；

图2为本发明试剂盒的线性范围相关性分析；

图3为本发明试剂盒与现有市售试剂盒检测结果的相关性分析。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结 合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1肝素衍生物的制备

步骤1：将肝素（购自sigma公司，货号：H3393，活性190USP/mg） 溶于50mM、pH值7.0磷酸盐缓冲液中，配成浓度为2000U/ml的肝 素母液。

步骤2：肝素酶Ⅱ（购自北京艾德豪克国际技术有限公司，货号 HS6512，9.8IU/mg）用蒸馏水复溶至浓度为20IU/ml。将肝素酶Ⅱ溶 液加到步骤1所得肝素母液中，肝素酶Ⅱ与肝素在该混合物中的浓度 比例为1IU：8000U。

混合液在30℃密闭条件下孵育30小时后，在232nm测定吸光度， 用磷酸盐缓冲液作为空白对照，相对于原始值提高15%，表明酶消化 反应已经发生，不饱和二糖已从肝素上裂解形成肝素衍生物。

步骤3：将步骤2所得反应液浸入沸水浴中5分钟，灭活肝素酶 Ⅱ。经检测，肝素衍生物的活性浓度为885U/ml。

实施例2检测试剂盒的组成及制备方法

R1试剂主要由以下原料配制而成：牛凝血酶浓度为60IU/ml，肝 素衍生物（实施例1所制）为9.0U/ml，Tris为10mM、吐温-80为 0.2mg/ml、明胶为0.05mg/ml、BSA为1.2mg/ml、聚乙二醇-8000为 5mg/ml及叠氮钠为0.5mg/ml，以1ml/瓶分装冻干。

R1试剂复溶试剂由以下原料配制而成：Tris浓度为40mM，KCl 为0.2M，EDTA-K2为3.75mM，NaN3为0.5mg/ml，在25℃以1mol/L HCl调节pH值至8.40。

R2试剂由以下试剂配制而成：发色底物

H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl为3.6μmol/ml，甘露醇为30mg/ml，叠氮 钠为3mg/ml，以1ml/瓶分装冻干。

AT-III校准品为将收集的健康正常人血浆混合后加入甘氨酸、叠 氮钠溶解，并调节pH值为7.5，甘氨酸浓度为10mM，叠氮钠为1mg/ml， 以1ml/瓶分装冻干。用WHO抗凝血酶国际标准品血浆06/166对AT-Ⅲ 校准品进行定值，定值为94%。

实施例3检测试剂盒的测定方法

（1）将实施例2所得R1试剂、R2试剂以及AT-III标准品进行 复溶重建：

每瓶R1试剂用3ml R1复溶试剂复溶，每瓶R2试剂用3ml蒸馏 水复溶，每瓶AT-Ⅲ校准品用1ml蒸馏水复溶。

（2）以日本东亚CA530血凝仪操作为例，根据仪器说明，设定 分析程序：测定波长为405nm；

取5μl血浆样本，加入生理盐水120μl稀释，稀释比例为1:25， 在37℃孵育30秒，取50μl稀释后样本，加入60μl R1试剂在37℃孵 育90秒，再加入60μl R2试剂在37℃孵育，测定第10秒和第40秒的 吸光度差值（△OD）。仪器自动将校准品稀释成144%、96%、48%、 24%、0%5个标准点，每管重复测定2次，以△OD的均值为纵坐标， 对应的活性为横坐标，制作“活性-吸光度差值”校准曲线： y=-0.0081x+1.4413，相关系数r=0.9993，见图1。

取待测样本，同上方法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线， 即可以计算出待测样本中AT-III的活性。

本试剂盒不仅适用于日本东亚CA530血凝仪，而且还适用于其它 品牌、型号的凝血分析仪，如法国思达高STA Compact血凝仪、美国 贝克曼库尔特ACL elite血凝仪、德国BE Compact X血凝仪等，具体 参数可根据仪器不同进行适当调整。

实施例4本发明试剂盒的分析性能评估

（1）线性范围

将接近线性范围上限的高活性样本（AT-III活性147%）用生理盐 水分别按2/3、1/3、1/6、1/12的比例稀释，并以生理盐水为空白样本， 加上稀释前原样本，共得到6份不同活性的样本，使用实施例2所得 本发明试剂盒、实施例3所述检测方法检测各样本，每份样本重复测 定2次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回 归方程Y=0.9944X+0.4903，相关系数r=0.9991，见图2，表明本发 明试剂盒在0%～150%线性范围内相关性较好。

（2）灵敏度

以5%人血清白蛋白为空白样本，使用实施例2所得本发明试剂 盒、实施例3所述检测方法，重复测定20次，计算空白样本△OD均 值和标准差（SD），以空白均值减两倍标准差代入校准曲线方 程，计算最低检测限，其结果如表1所示。

表1最低检测极限分析

表1结果显示：本发明试剂盒检测AT-III的最低检测限可达3.4%。

（3）干扰物质HCII的影响

将已知AT-III活性为94%的德国Siemens公司AT-III校准品，用 HCII活性正常的AT-III免疫清除的血浆（AT-III活性小于1%）系列 稀释，分别获得AT-III活性为94%、70.5%、47%、23.5%、0%的样本， 分别用实施例2所得本发明试剂盒、以肝素替代肝素衍生物的试剂盒 按实施例3所述检测方法进行AT-III活性测定，每个样本重复测定3 次，取平均值，结果如表2所示。上述肝素替代衍生物的试剂盒，是 指除了将肝素衍生物替代为肝素，其余试剂组成与实施例2所得试剂 盒的试剂组成完全相同的试剂盒。

表2HC II的影响实验

对于上述系列稀释的AT-III活性血浆的检测结果表明：

使用本发明试剂盒的检测活性与其理论活性的相对误差均在5% 之内，且随着稀释液（HCII活性正常的AT-III免疫清除的血浆）的比 例增加，其相对误差没有进一步加大，表明AT-III活性的检测基本不 受HC Ⅱ的干扰；

而使用肝素替代肝素衍生物的试剂盒的检测活性与理论活性的 相对误差较大（大于5%），且随着稀释液（HCII活性正常的AT-III 免疫清除的血浆）的比例增加，其相对误差增大，表明AT-III活性的 检测受到了HC Ⅱ的干扰。

结论：本发明试剂盒以肝素衍生物替代了现有技术的肝素，可以 较好地避开干扰物质HCII对AT-III活性检测的影响。

实施例5与已上市产品的比较

从上海交通大学医学院附属瑞金医院和上海中医药大学附属龙 华医院的住院及门诊随机抽取正常人和患者的血液样本共200份，其 中男107例，女93例。血液按9：1的比例与0.109mol/L枸橼酸钠抗 凝液混匀后，3000r/min离心15分钟，分离得到血浆。用实施例2所 得本发明试剂盒和德国Siemens公司AT-III检测试剂盒（货号： OWWR17）分别对样本测定，计算两者的相关系数，并进行线性回归。 结果显示两种试剂盒的相关系数r=0.9922，线性回归方程为y= 1.0298x-2.6331，见图3。

根据美国临床实验室标准化组织（CLSI）文件的要求（r＞0.975）， 本发明试剂盒和德国Siemens公司进口试剂盒的检测数据具有良好的 一致性。由此可见两种试剂盒在临床上对于遗传学AT-Ⅲ缺乏、肝硬 化、重症肝炎、弥散性血管内凝血、血友病A、血友病B、口服抗凝 药等疾病的诊断和病程检测具有等同作用，本发明的试剂盒在临床上 可以替代进口试剂盒使用，降低检测成本，减轻患者的经济负担。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出 若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。