一种重组乳杆菌和中草药合生元、合生元制剂及用途

摘要

本发明涉及微生物添加剂技术领域，具体公开了一种重组乳杆菌和中草药合生元，同时还公开了由该合生元制成的合生元制剂及其用途。重组乳杆菌和中草药合生元由重组乳杆菌活菌粉和中草药组成，重组乳杆菌活菌粉和中草药的重量配比为：重组乳杆菌活菌粉∶中草药＝1∶50；重组乳杆菌活菌粉中活菌数为(5～8)×10

说明书

技术领域

本发明涉及微生物添加剂技术领域，具体涉及一种重组乳杆菌和中草药 合生元，同时还涉及由该合生元制成的合生元制剂及其用途。

背景技术

随着抗生素、激素等作为饲料添加剂的滥用，其危害性已逐渐被人们认 识，因此，禁止以添加剂形式添加这些化学药物已成为不争的事实，况且， 在发达国家，如美国、欧盟国家及其他一些国家已经执行。但在我国的饲料 行业中还普遍存在这种现象，主要还是因为我国整体的养殖环境较差，动物 饲养离开了这些药物，那么它们的健康和生长都会受到影响。所以要想促进 我国动物的健康养殖，改善动物产品的品质，就必须找到一种可以替代抗生 素或激素的产品，这种产品作为饲料添加剂不仅能够促进动物的生长和健康， 更重要的是不能在体内残留。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组乳杆菌和中草药合生元。

本发明的目的还在于提供一种由重组乳杆菌和中草药合生元制成的合生 元制剂。

本发明的目的还在于提供一种重组乳杆菌和中草药合生元的用途。

本发明的目的还在于提供一种由重组乳杆菌和中草药合生元制成的合生 元制剂的用途。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种重组乳杆菌和中 草药合生元，由重组乳杆菌活菌粉和中草药组成，重组乳杆菌活菌粉和中草 药的重量配比为：重组乳杆菌活菌粉∶中草药＝1∶50；重组乳杆菌活菌粉中 活菌数为(5～8)×10¹¹个/克，所述中草药由以下重量份数的原料药组成： 黄芪4份、党参4份、神曲4份、麦芽4份、茯苓4份、甘草1份。

一种由所述重组乳杆菌和中草药合生元制成的合生元制剂，由重组乳杆 菌和中草药合生元、CaCO₃、粘合剂、助悬剂、崩解剂组成，其中重组乳杆菌 和中草药合生元的重量百分含量为88～92％，CaCO₃的重量百分含量为1％， 粘合剂的重量百分含量为1～5％，助悬剂的重量百分含量为0.1～1％，崩解 剂的重量百分含量为1～5％。

所述合生元制剂为粉剂、片剂或液体制剂。

所述粘合剂为淀粉，所述助悬剂为海藻酸钠，所述崩解剂为羧甲基淀粉 钠。

一种重组乳杆菌和中草药合生元作为鸡饲料添加剂的应用。

重组乳杆菌和中草药合生元作为鸡饲料添加剂应用时，重组乳杆菌和中 草药合生元的添加量为：重组乳杆菌和中草药合生元中的中草药的重量为鸡 饲料重量的0.1～0.4％。优选的，重组乳杆菌和中草药合生元的添加量为：重 组乳杆菌和中草药合生元中的中草药的重量为鸡饲料重量的0.3％。

一种由重组乳杆菌和中草药合生元制成的合生元制剂作为鸡饲料添加剂 的应用。

合生元制剂作为鸡饲料添加剂应用时，合生元制剂的添加量为：合生元 制剂中的中草药的重量为鸡饲料重量的0.1～0.4％。优选的，合生元制剂的添 加量为：合生元制剂中的中草药的重量为鸡饲料重量的0.3％。

其中的重组乳杆菌来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(保藏编号为： ATCC No.5276，保藏单位：美国菌种保藏中心)，通过在干酪乳杆菌基因组中 整合了淀粉酶基因，并能高效表达。

微生态制剂一般指的都是活的益生菌，这些益生菌在动物的肠道能够起 到调节菌群平衡，抑制有害菌，尤其是一些功能性益生菌，如分泌各种消化 酶、抗菌肽、过氧化氢的益生菌在肠道能够产生多种效应。目前在动物饲料 中广泛应用的微生物有乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等，实践证 明这些益生菌制剂在促进动物生长、预防或治疗腹泻等方面具有一定的作用。

我国中草药种类繁多，资源十分丰富，目前发现的中草药已达12000多 种。中草药含有的蛋白质、氨基酸、维生素等多种营养物质，对动物有促生 长和抗病的作用。经研究发现有200多种中草药含有免疫活性物质，能增强 动物体的免疫功能；有400多种中草药有杀菌、抑菌作用；50多种中草药对 病毒有灭活或抑制作用。尤其是一些扶正固本类中草药，如黄芪、党参等， 除可增强机体免疫功能外，还可促进益生菌的生长。因中草药是天然物质， 保持了各种成分的自然性和生物活性，易被动物机体吸收和利用，不被吸收 的也能顺利排出体外，因此，不存在药物残留的问题，所以它是一种很理想 的饲料添加剂。

合生元是一种将益生菌和能够特异性促进益生菌增殖的物质(益生元)按 照一定的配比联合应用的制剂，它同时具有益生菌和益生元的特性。不仅可 以通过体外饲喂益生菌调节肠道菌群，而且还可以通过益生元促进肠内固有 益生菌的增殖。因此，合生元中的两种组分能够在肠道内相互协同，为肠道 建立一个良好的微生态环境。

本发明提供的重组乳杆菌和中草药合生元是将构建的一株表达淀粉酶的 重组乳杆菌作为益生菌，再通过体外试验筛选出能够特异性促进该重组乳杆 菌增殖的中草药，将两者按照一定的比例配比后制成的。经体外试验表明， 本发明提供的重组乳杆菌和中草药合生元中的中草药能够促进重组乳杆菌的 增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长；体内试验表明，合生元能够促进肉 鸡的生长，提高免疫力，降低死亡率。本发明提供的重组乳杆菌和中草药合 生元可以作为添加剂应用于饲料中，对于畜禽，尤其是幼龄动物，对提高生 长速度、降低料肉比、增加经济效益等具有重要的意义。

在本发明提供的重组乳杆菌和中草药合生元以及由其制成的合生元制剂 中，重组乳杆菌为活的微生物制剂，口服这种活菌制剂后，能够在肠道中定 植，并在生长代谢中产生多种物质，如乳酸、抗菌肽、消化酶，尤其是重组 到该菌中的淀粉酶，能够在肠道高效表达，补充肠道中的淀粉酶，加之乳杆 菌和中草药的多重作用，能够抑制有害菌的生长，提高动物的生产性能，改 善机体的免疫力，减少腹泻，增强体质。本发明提供的重组乳杆菌和中草药 合生元以及由其制成的合生元制剂作为饲料添加剂用于动物的生产，为动物 肠道建立了一个良好的微生态环境。

本发明提供的重组乳杆菌和中草药合生元以及由其制成的合生元制剂与 现有的饲料添加剂相比具有如下优势和效果：

1、安全性好，无残留

本发明提供的合生元及合生元制剂是由重组乳杆菌与具有健胃消食和增 强免疫力的中草药按照一定比例配比而成的，各成份均不含有毒有害物质， 因此口服后也不会在机体内产生残留。

2、可以补充肠道内的淀粉酶

本发明提供的合生元及合生元制剂的组分重组乳杆菌是一种通过基因工 程技术将淀粉酶基因整合到干酪乳杆菌Lactobacillus cacei(ATCC5276)中的基 因工程菌，该重组乳酸杆菌的特征是含有表达质粒pIlac-sp-amy，重组表达质 粒pIlac-sp-amy含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、 乳酸杆菌信号肽基因(signal peptide，sp)、淀粉酶基因(amylase，amy)、核糖体结 合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery(erythromycin，Ery)基因，其表达式为： -ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-，在体外证明能够高效分泌表达淀粉酶。

3、能够同时通过外源和内源增加肠道中的乳杆菌

本发明提供的合生元及合生元制剂的组分中含有重组乳杆菌和乳杆菌的 益生元中草药，因此重组乳杆菌可以直接增加肠道内的乳杆菌，益生元中草 药不仅可以促进重组乳杆菌的增殖，还可以刺激肠道内源性的乳杆菌的增殖， 可以在肠道内尽快建立益生菌的优势菌群。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的重组乳杆菌和中草药合生元，由重组乳杆菌活菌粉和中 草药组成，重组乳杆菌活菌粉和中草药的重量配比为：重组乳杆菌活菌粉∶ 中草药＝1∶50；重组乳杆菌活菌粉中活菌数为5×10¹¹个/克，中草药由以下重 量份数的原料药组成：黄芪4份、党参4份、神曲4份、麦芽4份、茯苓4 份、甘草1份。

实施例2

本实施例提供的重组乳杆菌和中草药合生元，由重组乳杆菌活菌粉和中 草药组成，重组乳杆菌活菌粉和中草药的重量配比为：重组乳杆菌活菌粉∶ 中草药＝1∶50；重组乳杆菌活菌粉中活菌数为8×10¹¹个/克，中草药由以下重 量份数的原料药组成：黄芪4份、党参4份、神曲4份、麦芽4份、茯苓4 份、甘草1份。

实施例3

本实施例提供的合生元制剂，由本发明实施例1提供的重组乳杆菌和中 草药合生元制成，其组成为：由本发明实施例1提供的重组乳杆菌和中草药 合生元、CaCO₃、淀粉、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠组成，重组乳杆菌和中草药 合生元的重量百分含量为88％，CaCO₃的重量百分含量为1％，淀粉的重量百 分含量为5％，海藻酸钠的重量百分含量为1％，羧甲基淀粉钠的重量百分含 量为5％。

本实施例提供的合生元制剂为粉剂，其制备方法同常规粉剂的制备方法， 即将各种原料混合均匀后包装即得粉剂。每克制得的合生元制剂中含重组乳 杆菌40亿个。

实施例4

本实施例提供的合生元制剂，由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中 草药合生元制成，其组成为：由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中草药 合生元、CaCO₃、淀粉、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠组成，重组乳杆菌和中草药 合生元的重量百分含量为92％，CaCO₃的重量百分含量为1％，淀粉的重量百 分含量为3％，海藻酸钠的重量百分含量为0.5％，羧甲基淀粉钠的重量百分 含量为3.5％。

本实施例提供的合生元制剂为片剂，其制备方法同常规片剂的制备方法， 即将原料混合均匀后，直接压片，包装后即得片剂。每克制得的合生元制剂 中含重组乳杆菌36亿个。

实施例5

本实施例提供的合生元制剂，由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中 草药合生元制成，其组成为：由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中草药 合生元、CaCO₃、淀粉、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠组成，重组乳杆菌和中草药 合生元的重量百分含量为92％，CaCO₃的重量百分含量为1％，淀粉的重量百 分含量为1％，海藻酸钠的重量百分含量为1％，羧甲基淀粉钠的重量百分含 量为5％。

本实施例提供的合生元制剂为片剂，其制备方法同常规片剂的制备方法。

实施例6

本实施例提供的合生元制剂，由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中 草药合生元制成，其组成为：由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中草药 合生元、CaCO₃、淀粉、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠组成，重组乳杆菌和中草药 合生元的重量百分含量为92％，CaCO₃的重量百分含量为1％，淀粉的重量百 分含量为5％，海藻酸钠的重量百分含量为1％，羧甲基淀粉钠的重量百分含 量为1％。

本实施例提供的合生元制剂为片剂，其制备方法同常规片剂的制备方法。

实施例7

本实施例提供的合生元制剂，由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中 草药合生元制成，其组成为：由本发明实施例2提供的重组乳杆菌和中草药 合生元、CaCO₃、淀粉、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠组成，重组乳杆菌和中草药 合生元的重量百分含量为92％，CaCO₃的重量百分含量为1％，淀粉的重量百 分含量为3％，海藻酸钠的重量百分含量为0.1％，羧甲基淀粉钠的重量百分 含量为3.9％。

本实施例提供的合生元制剂为液体制剂，其制备方法同常规液体制剂的 制备方法。

试验例1 证明中草药组方能够作为益生元促进重组乳杆菌的生长

菌种：重组乳杆菌(源于干酪乳杆菌Lactobacills casei ATCC5276)；

培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、K₂HPO₄2g、乙酸钠 5g、柠檬酸二铵2g、葡萄糖20g、吐温-801ml、MgSO₄·7H₂O 0.58g、MnSO₄·4H₂O 0.25g、水1000ml，调pH值至6.2；

中草药的制备：按以下重量份数称取原料药：黄芪4份、党参4份、神 曲4份、麦芽4份、茯苓4份、甘草1份，将药材粉碎成粉末备用；

测定不同浓度的中草药提取液对重组乳杆菌生长的影响：将活化的重组 乳杆菌液分别接种到含有重量百分比为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的中草药 的培养基中，以不含中草药的培养基为对照，置37℃恒温厌氧振荡培养24h， 然后以10倍稀释平板滴种法测定菌液的浓度，测定结果见表1所示。

表1 中草药提取液对重组乳杆菌生长影响试验结果(活菌数单位：10¹¹CFU/ML)

由表1可以看出，不同浓度的中草药对重组乳杆菌均有促生长作用，但 是浓度在0.3％时促生长效果最佳。随着浓度的增高，会抑制生长。经计算得 出，当重组乳杆菌活菌粉和中草药的重量配比为：重组乳杆菌活菌粉∶中草 药＝1∶50时，中草药对重组乳杆菌的促生长效果最佳。

试验例2 不同浓度的中草药提取液对大肠杆菌和沙门氏菌生长的影响 试验

以试验例1同样的方法测定含中草药提取液的普通肉汤培养基对大肠杆 菌和沙门氏菌的生长影响，结果见表2所示。

表2 中草药提取液对重组乳杆菌生长影响试验结果(活菌数单位：10⁹CFU/ML)

  0.00％   0.1％   0.2％   0.3％   0.4％   大肠杆菌   6.67   6.13   5.58   4.33   2.15   增长比   0.92   0.84   0.65   0.32   沙门氏菌   3.83   3.74   2.13   1.07   0.85   增长比   0.98   0.56   0.27   0.22

从表2可以看出，不同浓度的中草药对大肠杆菌和沙门氏菌都有不同程 度的抑制生长的作用，且抑制程度与中草药的添加量有关，浓度越高，抑制 作用越强。

试验例3 实施例3提供的合生元制剂对AA肉鸡生长性能的影响试验

1.材料

1.1实验动物

肉仔鸡：购自鹤壁某肉种鸡场，刚出壳同批次AA肉仔鸡600只。

1.2饲料添加剂

实施例3提供的合生元制剂，合生元制剂的添加量为：合生元制剂中的 中草药的重量为鸡饲料重量的0.3％。

1.3试验基础日粮

基础日粮参照AA肉鸡营养标准配制，其组成和营养成分见表3所示。

表3 试验基础日粮组成及营养水平

注：每公斤预混料含VA6000,000IU，VD33,300,000IU，VE27,000IU，VK31,500mg，VB120,000mg，VB2 6,000mg，VB64200mg，VB1210mg，烟酸4,500mg，泛酸4,000mg，叶酸150mg，生物素15mg，氯化胆碱75g，Fe 7,792mg，Cu 750mg，Zn 7,300mg，Mn 9,785mg，Se 33mg，I 150mg。

2.试验方法

2.1试验设计及管理

本试验选用刚出壳同批次商品AA肉仔鸡600只，公母各半，随机分成4 个处理，每个处理3个重复，每个重复50只鸡。各处理之间体重差异不显著 (P＞0.05)，试验方案见表4所示，试验周期为42天。

表4 试验设计方案

注：0.3％是指占基础日粮的重量百分比。

参照北京华都肉鸡公司AA商品肉鸡饲养管理手册要求控制温度、湿度 和光照时间。前7天24h光照，以后23h光照，1h黑暗，相对湿度55～70％， 饲养初期保持室温33℃左右，以后逐渐降低，最低室温保持在23℃左右。每 周用0.1％的新洁尔灭带鸡喷雾消毒一次，免疫程序按常规进行。地面平养， 采用传统的饮水器自由饮水和采食。

在饲养过程中，每天观察鸡只健康情况，记录死亡数，及时扣除耗料量。

2.2生长性能测定

以重复为单位，试验前每组称重，于7日龄、14日龄、21日龄、28日龄、 35日龄、42日龄称重(称重前空腹4h)，计算周增重、日增重、周耗料量和日 耗料量、料肉比，计算公式如下：

平均周体重＝3个重复的鸡的总重量/鸡只数；

平均周增重＝下一周周平均体重-上一周周平均体重；

平均日增重＝(末体重-初体重)/天数；

料肉比＝耗料量/增重；

生长性能测定结果见表5-表9所示。

表5 不同添加剂对AA肉鸡1-6周平均体重的影响(单位：克)

注：同列小写字母不同的表示差异显著(P＜0.05)，大写字母不同的表示差异极显著(P＜0.01)， 含相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，下表同。

表6 不同添加剂对AA肉鸡1-6周平均周增重的影响(单位：克)

表7 不同添加剂对AA肉鸡1-6周各周日增重的影响(单位：克)

表8 不同添加剂对AA肉鸡1-6周平均耗料的影响(单位：克)

表9 不同添加剂对AA肉鸡1-6周料重比的影响

由表5-表9可以看出，重组乳杆菌作为添加剂对AA肉鸡不同周龄的体 重、周增重和日增重方面，均可在一定程度上提高AA肉鸡的生产性能，在 第2周、第3周均显著低于对照组(P＜0.05)，其它周龄和日龄也均有降低，但 差异不显著(P＞0.05)。

由表5-表9可以看出，中草药作为添加剂对AA肉鸡不同周龄的体重、 周增重和日增重方面，在第4周(P＜0.01)、5周(P＜0.05)、6周(P＜0.01)的体重 较对照组差异显著或极显著；而在第4周的周增重和日增重较对照组有明显 提高(P＜0.05)，在整个饲养周期0-6周的平均周增重和日增重却较对照组有极 显著提高(P＜0.01)；耗料也有不同程度的增加，料重比虽然仅在第3周较对照 组差异极显著(P＜0.01)，但0-6周的终末料重比却较对照组极显著提高 (P＜0.01)。

由表5-表9可以看出，实施例3提供的合生元制剂作为饲料添加剂对 AA肉鸡不同周龄的体重、周增重和日增重方面的影响，在各周的平均体重方 面显示了较强的增重效应，在第1周就较对照组差异显著(P＜0.05)，而其余周 龄均有极显著提高(P＜0.01)；周增重和日增重方面自第2周开始较对照组增重 显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；料重比更是明显，除第1周外，其余饲养期 均较对照组差异极显著(P＜0.01)。

2.3死淘率

按重复组记录死淘数，据下列公式计算每个处理组的死淘率：

死淘率＝死淘数/总鸡数(处理组)。

处理组AA肉鸡死亡数与成活率结果见表10所示。

表10 不同添加剂对AA肉鸡死亡数与死淘率的影响

  处理组   饲养只数  第1周  第2周  第3周  第4周  第5周  第6周   总计死亡只数   死淘率(％)   I   150  3  3  5  3   14   9.33   II   150  3  3  3   9   6   III   150  3  2  2   7   4.67   IV   150  1  1   2   1.33

由表10可以看出，处理组IV即食用添加有实施例3提供的合生元制剂的 饲料的肉鸡组，在肉鸡抗病方面有明显作用，该组死淘率仅为1.33％，存活率 达98.67％，而重组乳杆菌组和中草药组存活率只有94.0％和95.33％，对照 组存活率仅有90.67％。