调控斑马鱼卵黄蛋白原mRNA水平的方法

摘要

本发明公开了一种调控斑马鱼卵黄蛋白原mRNA水平的方法，用来检验低浓度类雌激素干扰物对水生生物毒害或干扰，该方法包括：(1)分别提取待检测水生生物以及对照水生生物肝脏的总RNA；(2)对所提取的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA表达水平进行定量；(3)如果待检测样品卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA的表达水平高于对照样品卵黄蛋白原的VTG1mRNA或VTG3mRNA的表达水平，则待检测水生生物体内内分泌受到低浓度类雌激素干扰物的毒害或干扰。本发明方法能够准确、灵敏的检验出水生生物是否受到外源环境中低浓度的类雌激素干扰物的毒害或干扰，具有灵敏性好、准确率高等优点，可应用于水生生物类雌激素干扰物的检验领域。

说明书

技术领域

本发明涉及到一种检验有机污染物对水生生物毒害或干扰 的方法，尤其涉及到一种检验水生生物体内内分泌是否受到外源 环境中低浓度类雌激素干扰物毒害或干扰的方法，属于水生生物 类雌激素干扰物的检验领域。

背景技术

生态环境中的化学污染物质干扰人类和野生动物的内分泌 功能，从而对个体的生殖、发育和性行为等产生多方面的影响， 甚至会影响到人类的生存繁衍(Tilghman S L，Nierth-Simpson E  N，Wallace R，et al.Environmental hormones：Multiple pathways  for response may lead to multiple disease outcomes[J].Steroids， 2010，75(8-9)：520-523)。因而国际组织和发达国家对内分泌干 扰危害效应监控实行强制管理，如联合国GHS(全球化学品统一 分类和标签制度)和欧盟REACH(化学物质注册、评估、授权和 限制)法规1907/2006(EC)中均对内分泌干扰化学物质提出了明 确管控要求。

VTG是卵黄蛋白的前体，通常受循环的内源性雌激素刺激， 由雌性卵生脊椎动物肝脏产生，由血流进入卵巢，并被发育中的 雌性配子吸收并改变。它是直接通过雌激素受体调节途径来合成 的，一般只在成熟雌鱼体内合成，而在幼鱼或成年雄鱼体内含量 很低，难以检测出。但在受外源性的雌激素的刺激下，肝脏能够 合成并分泌VTG；而芳香酶通过抑制转化内源性雄激素为天然 雌激素17β-雌二醇，会引起VTG水平的降低。因此，通过测量 VTG水平的变化，能够探索不同化学物质的内分泌干扰作用机 制。

全氟碳化合物(PFCs)已成为重要的持久性有机污染物 (POPs)，广泛分布于环境、野生动物和人类中。其中代表性的全 氟辛烷磺酰基化合物(Perfluorooctanesulphonate，PFOS)、全氟辛 酸(Perfluorooctanoic acid，PFOA)以及它们的衍生物已成为新型 持久性有机污染物质，可以通过呼吸和食物被生物体摄取，有很 高的生物蓄积性，可能具有内分泌干扰毒性、遗传毒性、肝脏毒 性等(Jensen A A，Leffers H.Emerging endocrine disrupters： perfluoroalkylated substances [J].International Journal of  Andrology，2008，31(2)：161-169；Clarke B O，Smith S R.Review  of‘emerging’organic contaminants in biosolids and assessment of  international research priorities for the agricultural use of  biosolids [J].Environment International，2011，37(1)：226-247)， 其工业生产已于2000年禁止。在2009年5月4日-8日在瑞士 日内瓦召开的“有关持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约”会议 上，鉴于PFOS，其盐化合物以及全氟辛烷磺酰氟等的剧毒性和 持久性，将它们列入斯德哥尔摩公约新增受控化学物质范围。

当水生生物处于高浓度类雌激素干扰物的外源环境的毒害 或污染下，将显现出较为明显的形态特征变化或生理变化，再结 合采用多种生物标记物，可以非常准确和灵敏的检验出水生生物 是否受到外源环境中高浓度类雌激素干扰物的毒害或污染。水生 生物受到低浓度的类雌激素干扰物的毒害或污染时，无论是外部 的形态特征还是内部的生理指标都不会显现出较为明显的变化， 此外，现有的用于评价类雌激素干扰物对于水生生物内分泌干扰 效应的生物标志物均不同程度的存在敏感性较差、准确率较低的 缺陷。迄今为止，缺乏一种高灵敏、高准确率的检验水生生物体 内内分泌是否受到外源环境中低浓度类雌激素干扰物毒害或干 扰的方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明人进行了锐意研究， 发现，在暴露于低剂量的诸如全氟辛烷磺酰基化合物 (Perfluorooctanesulphonate，PFOS)或全氟辛酸(Perfluorooctanoic  acid，PFOA)等类雌激素干扰物时，虽然斑马鱼，特别是雄性斑 马鱼体征没有发生明显变化，但其卵黄蛋白原的VTG1和/或 VTG3的mRNA的表达水平明显升高，通过这种方法可以灵敏、 准确地确定斑马鱼是否受到外源环境中低剂量类雌激素干扰物 毒害或干扰，由此完成本发明。

本发明的目的在于提供了一种检验水生生物是否受到外源 环境中低浓度类雌激素干扰物毒害或干扰的方法，包括以下步 骤：

(1)分别提取待检测水生生物肝脏的总RNA以及对照水 生生物肝脏的总RNA；

(2)对所提取的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/ 或VTG3的mRNA的表达水平进行定量；

(3)如果待检测样品卵黄蛋白原的VTG 1mRNA的表达水 平高于对照样品卵黄蛋白原的VTG1 mRNA的表达水平，以及/ 或者待检测样品卵黄蛋白原的VTG3 mRNA的表达水平高于对 照样品卵黄蛋白原的VTG3 mRNA的表达水平，则待检测水生 生物体内内分泌受到低浓度类雌激素干扰物的毒害或干染；

其中，，待检测水生生物与对照水生生物是同一种水生生物， 所述的对照水生生物是没有遭受类雌激素干扰物毒害或污染的 水生生物。

在根据本发明的方法中，所述的水生生物优选为水生鱼类， 更优选为斑马鱼(Brachydanio rerio)；特别优选的，所述的斑 马鱼是雄性斑马鱼(Brachydanio rerio)。

斑马鱼(Brachydanio rerio)是淡水水族箱观赏鱼，原产于 亚洲，体长约4公分，具暗蓝与银色条纹。斑马鱼基因与人类基 因的相似度达到87％，在其身上做药物实验所得到的结果在多 数情况下也适用于人体，因此广泛应用于生命科学的研究，日益 受到生物学家的重视。斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很 容易观察到药物对其体内器官的影响。此外，雌性斑马鱼可产卵 200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以 在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到 病因。

本发明人经过大量实验发现，当斑马鱼暴露于低浓度类雌激 素干扰物如全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物时， 雄性斑马鱼的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3 的mRNA的表达水平升高程度比雌性斑马鱼的肝脏总RNA中的 卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA的表达水平升高程度 更高，表明雄性斑马鱼对于低浓度类雌激素干扰物更为敏感，因 此通过雄性斑马鱼的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/ 或VTG3的mRNA的表达水平更易于判定斑马鱼是否受到低浓 度类雌激素的毒害或干扰。

在根据本发明的方法中，所述的类雌激素干扰物包括全氟碳 化合物、对特辛基苯酚或17β-雌二醇；所述的全氟碳化合物优 选为全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物；进一步优 选的，所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。

在本文中，所用术语“低浓度类雌激素干扰物”的含义是指浓 度为0.1μg·L^-1-1000μg·L^-1的类雌激素干扰物，进一步优选为浓 度为0.1μg·L^-1-100μg·L^-1的类雌激素干扰物，特别优选为浓度 为10μg·L^-1-100μg·L^-1的类雌激素干扰物，最优选为浓度为10 μg·L^-1的类雌激素干扰物。

优选地，当水生生物为斑马鱼时，斑马鱼的肝脏总RNA 中的卵黄蛋白原的VTG1的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；斑 马鱼的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG3的核苷酸序列为 SEQ ID No.2所示。

为了对水生生物肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和 VTG3的mRNA的表达水平进行定量，可以采用实时荧光定量 PCR或半定量RT-PCR等方法对VTG1或VTG3的mRNA的表 达水平进行定量；也可以采用组织芯片和原位杂交技术检测点阵 石蜡组织芯片中VTG1或VTG3的mRNA的表达，再用 LeicaQ500MC图像分析系统定量测试VTG1或VTG3的mRNA 表达水平，这些定量方法或手段均为本领域技术人员所通晓。作 为一个优选的实施方案，本发明采用实时荧光定量PCR的方法 对所提取的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和VTG3的 mRNA的表达水平进行定量；其中，所述荧光定量PCR的方法 中用于扩增目的基因的3对引物分别如下：第1对引物的核苷酸 序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；第2对引物的核苷酸 序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；第3对引物的核苷酸 序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；所述荧光定量PCR 的方法中的探针序列分别为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ  ID No.11所示。

本发明的另一目的在于提供了将水生生物肝脏总RNA中的 卵黄蛋白原的VTG1 mRNA和/或VTG3 mRNA的表达水平作为 检验水生生物体内内分泌是否受到低浓度类雌激素干扰物毒害 或干扰的生物标记物的用途；优选的，所述的水生生物是水生鱼 类；进一步优选为斑马鱼(Brachydanio rerio)；更优选的，所 述的斑马鱼是雄性斑马鱼(Brachydanio rerio)。

卵黄蛋白原(VTG)是由内源性雌激素或外源性雌激素作用 下，刺激卵生动物肝细胞(作用于肝雌激素受体)而产生的，经血 运输到卵巢，经过修饰后以卵黄蛋白形式储存于卵母细胞，为胚 胎的发育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营 养和功能性物质。

本发明将斑马鱼(Brachydanio rerio)暴露于各种不同浓度 全氟辛烷磺酸(PFOS)的环境中，测定斑马鱼体内肝脏总RNA 中的卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA的表达水平的变 化。实验结果表明，低剂量的PFOS暴露均不同程度地引起雄性 和雌性斑马鱼肝脏中VTG mRNA水平升高，说明低浓度PFOS 暴露对斑马鱼的内分泌干扰作用明显，斑马鱼肝脏中 VTG1 mRNA和/或VTG3 mRNA水平可作为PFOS内分泌干扰效 应评价的敏感生物标志物；此外，本发明进一步的实验发现，斑 马鱼暴露于低浓度全氟辛烷磺酰基化合物后，斑马鱼肝脏中 VTG3 mRNA水平响应比VTG1更敏感，表明斑马鱼肝脏中VTG3 mRNA水平比VTG1 mRNA水平更适合作为PFOS内分泌干扰效 应评价的敏感生物标志物。

作为本发明的一个具体的应用方式，可以分别将斑马鱼体内 肝脏中所提取的VTG1 mRNA和/或VTG3 mRNA作为探针制备成 生物芯片，例如：基因芯片、组织芯片或细胞芯片等，采用高通 量的方式检验待检测水生生物的肝脏中VTG1 mRNA水平和/或 VTG3 mRNA水平，再将其与对照水生生物的肝脏中VTG1 mRNA 和/或VTG3 mRNA的表达水平进行比较，从而检验水生生物内 分泌是否受到外源环境中低浓度类雌激素干扰物的毒害或干扰。

基因芯片是在载体(尼龙膜、玻璃片或硅片等)上按照预先 设计的位置高密度有序的排列大批量的核酸探针(也称DNA芯 片或DNA微阵列)，形成高密度点阵，与样品中的靶分子作用 后，通过分子杂交技术在相同条件下进行分子反应，采用同位素 法、化学荧光法或化学发光法等方法对反应结果进行显示，并采 用相应的方法进行定量。

具体到本发明，可以将水生生物的肝脏中VTG1 mRNA或 VTG3 mRNA作为探针采用原位点样法或直接点样法等方式将 探针按照预先设计的位置高密度有序的排列或点样到尼龙膜载 体(或玻璃片、硅片等载体)上，得到基因芯片；从待检测的水 生生物的肝脏中提取VTG1 mRNA或VTG3 mRNA，将所提取的 VTG1 mRNA或VTG3 mRNA经过逆转录后再进行PCR扩增，将 扩增产物的末端用荧光标记后与芯片上的探针分子进行分子杂 交，采用共聚焦荧光扫描仪进行信号检测，定量待测样品中 VTG1 mRNA或VTG3 mRNA的表达水平，再与对照样品中的 VTG1 mRNA或VTG3 mRNA的表达水平进行比较，就可快速、 准确的检验出待检测水生生物体内内分泌是否受到外源环境中 低浓度类雌激素干扰物毒害或干扰。

组织芯片，又称组织微阵列，是将大量的组织片有序的排列 于载体上而得到的微缩组织切片，用于研究同一基因或蛋白质分 子在不同细胞或组织中的表达情况，具有体积小、高通量、丰富 样本、快速省时等优点。组织芯片还可以与免疫组化、荧光核酸 原位杂交、RNA原位杂交等技术相结合。

本领域技术人员可以参考以下方法制备组织芯片，包括：待 测样品的收集、芯片的制备、染色及染色后扫描、数据处理。其 中，制作组织芯片时多采用石蜡组织芯片，石蜡组织芯片的制作 是采用组织芯片制作机的活检细针，从大量供体蜡块组织中钻取 若干个圆柱形的组织芯，然后将样本整齐的放到受体蜡块中制作 组织芯片蜡块，对组织芯片蜡块进行切片，再将切片转移到载玻 片上。利用显微镜精密的机械控制功能，进行打孔、取样、点样、 观察与定位、通过化学染色或原位杂交，载玻片上所有标本的信 号可以同时显现出来。与普通切片相比，组织芯片的单次可以同 时对上百个样本进行免疫组织化和原位杂交，可以大规模分析样 本，并具有数据统计精确性和高效性等优点。

附图说明

图1示出低浓度PFOS暴露对雄性斑马鱼肝脏VTG1和 VTG3 mRNA水平的影响。

图2示出低浓度PFOS暴露对雌性斑马鱼肝脏VTG1和 VTG3 mRNA水平的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和 特点将会随着描述而更为清楚明确。但这些实施例仅是范例性 的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理 解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案 的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明 的保护范围内。

试验例  低浓度的全氟辛烷磺酸暴露对于斑马鱼肝脏VTG1 mRNA和VTG3 mRNA表达水平的影响试验

1材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：荧光定量PCR仪(ABI-7500，ABI公司，美国)，混 合型球磨仪(MM400，RETSCH公司，德国)，冷冻离心机(3-18K， Sigma公司，德国)，涡旋混匀器(IKA MS3 digital，北京德泉兴 贸有限公司)；紫外分光光度计(UNIC 4802 UV/Vis  Spectrophotometer，北京德泉兴贸有限公司)；peqSTAR梯度PCR 仪(德国peQLab，北京德泉兴贸有限公司)；微型离心机 (BAYGENE Qspin^TM，北京德泉兴贸有限公司)。

试剂：全氟辛烷磺酸(Assay LC-MS 98％，Sigma-Aldrich公 司，美国)；Trizol试剂(CAS 15596-026，Invitrogen Beijing  Office)；三氯甲烷，异丙醇，乙醇(北京化工厂，分析纯)；氧化 锆(3mm，BioLAB Materials Institute)；Oligo dT(10μmol·L^-1)， dNTP(99％以上，2.5mmol·L^-1)，Quant Reverse Transcriptase， 10×RT Buffer，RNase-free H₂O(TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO.，LTD)；Taqman Mixture(2×)，ROXII(TakaRa，宝生物工程(大 连)有限公司)，目的基因和内参基因引物和探针(Invitrogen英潍 捷基(上海)贸易有限公司)。基因引物和探针设计分别如表1。

表1目的基因和内参基因引物和探针序列

1.2供试生物

实验鱼：斑马鱼(Brachydanio rerio)，体长1.0-1.5cm，体重 0.120-0.220g，雌雄兼有，购于北京市东郊市场。采用反渗透纯 净水机制备的水。试验前将雌雄斑马鱼分开，在试验条件下预养 7d，水温(25±2)℃，饲养容器为2L烧杯，饲养密度不大于1 g·L^-1(即每升水容纳斑马鱼的质量为1g)，每日光照12-14h，早 晚定时投喂孵化的丰年虫2次，并每天清除排泄物，预养期间斑 马鱼死亡率不超过5％。

1.3 21天毒性试验

预养结束后停止喂食1d，然后进行以下实验：设置染毒浓 度为0.1μg·L^-1、1μg·L^-1、10μg·L^-1、100μg·L^-1的4个实验组， 同时设置空白对照组，每组3个平行样，分别对雌、雄斑马鱼进 行21d的毒性试验。实验在2L烧杯中进行，每缸内盛有1.8L 不同浓度的染毒液，且每缸随机投放8尾斑马鱼。暴露期间水温 维持在(25±2)℃，采用每周两次更换全部药液的半静态法进行暴 露，暴露周期为21d，暴露期间每天喂食2次，其余条件与预养 期间相同。

1.4肝脏提取

21d染毒结束后，立即捞出斑马鱼并将其置于冰上冷冻处 死，每浓度组中分别取雌雄性别斑马鱼肝脏3-5个(约20mg左 右)，置于1mL Trizol试剂中，加入1颗氧化锆的小珠，于-80℃ 保存，留待用于检测VTG1和VTG3 mRNA水平，所有操作在 冰上完成。

1.5RNA提取

将冷冻的含组织的Trizol试剂解冻，使用组织破碎机在 30Hz/2min进行匀浆。匀浆后的组织液在冰上孵育5min。在组 织液中加入200μL三氯甲烷，颠倒混匀后冰浴3min。以12000 r·min^-1的速度4℃离心15min，可见蛋白沉淀。取300μL上清 液移入装有700μL的100％异丙醇的1.5ml离心管中，颠倒混 匀，冰浴10min。于12000r·min^-1，4℃离心10min，离心管底 部可见白色RNA沉淀。弃去上清液，加入1mL的75％乙醇， 涡旋片刻。在7400r·min^-1，4℃离心5min，弃去上清。简短离 心，用移液枪吸出残余乙醇，室温晾干3-5min。待RNA晾至半 透明，视沉淀大小加入适量无RNA酶的水。待溶解后进行反转 录。

1.6反转录

取1μL的RNA溶液，用紫外分光光度法测其浓度并进行适 当稀释至适当浓度范围(200-500ng·μL^-1)，然后进行反转录。反 转录体系(20μL)为：10×RT Buffer 2μL，Oligo dT(10μM)2μL， dNTP(每个2.5mmol·L^-1)2μL，定量反转录酶1μL，RNA体积 (μL)＝1000/RNA浓度(ng·μL^-1)，无RNA酶的水体积(μL)＝13-RNA 体积(μL)。由于RNA提取后马上进行反转录操作，故反转录反 应体系中可不加入RNA酶抑制剂。

将上述体系涡旋混匀，简短离心后进行反转录，反转录条件 设置为：37℃1h，94℃3min。

1.7 Real Time PCR(实时PCR)

反应体系用Taqman Mixture+Rox II进行扩增，反应体系为 目的基因与内参基因在同一管中进行反应，具体反应体系(20μL) 为：Taqman Mixture(2×)10μL，ROXII 0.4μL，目的基因上游引 物(10μmol·L^-1)0.4μL，目的基因下游引物(10μmol·L^-1)0.4μL， 目的基因探针(10μmol·L^-1)0.4μL，内参基因上游引物(10 μmol·L^-1)0.4μL，内参基因下游引物(10μmol·L^-1)0.4μL，内参 基因探针(10μmol·L^-1)0.5μL，cDNA模板2μL，无RNA酶的 水5.1μL。

两步法PCR扩增标准程序：①Stage 1：预变性，Reps：1， 95℃30s；②Stage2：PCR反应，Reps：40，95℃5s，60℃34 s。

1.8样品相对定量分析结果

用AB 7500型荧光定量PCR仪，采用2^-ΔΔCt法进行数据的 相对定量分析。根据Real Time PCR原始检测结果，按照2^-ΔΔCt相对定量计算公式，即：

计算出各样品的目的基因相对定量结果，即各个样品相对于 对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异。

1.9数据处理

实验数据用统计学方法进行处理，采用SPSS 13.0统计软件 进行显著性分析，各数据均用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示， 各组间的差异采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，P≤0.05 为差异显著。

2结果与分析

2.1雄性斑马鱼肝脏中VTG含量

雄性斑马鱼肝脏中VTG1和VTG3含量结果见图1。图中数 据用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，每组数据样本量n≥3。 柱形上方参数有一个字母相同则无显著性差异，反之则有显著性 差异(P≤0.05)。

由图1中可看出，PFOS暴露引起雄性斑马鱼肝脏 VTG1 mRNA和VTG3 mRNA水平升高。其中VTG1 mRNA水平 升高与剂量呈正相关，在100μg·L^-1暴露浓度处与对照组呈现显 著性差异；VTG3 mRNA水平升高与剂量呈倒U型曲线，呈现典 型的毒物刺激荷尔蒙效应，在10和100μg·L^-1暴露浓度处与对 照组呈现显著性差异。

2.2雌性斑马肝脏中VTG含量

雌性斑马鱼肝脏中VTG1和VTG3含量结果见图2。图中数 据用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示，每组数据样本量n≥3。 柱形上方参数有一个字母相同则无显著性差异，反之则有显著性 差异(P≤0.05)。

由图2中可看出，PFOS暴露引起雌性斑马鱼肝脏中VTG1 mRNA水平升高，在10μg·L^-1暴露浓度处与对照组呈现显著性 差异，但在高浓度(10和100μg·L^-1)处实验结果误差较大；VTG3 mRNA水平只在10μg·L^-1暴露浓度处升高，但相比于对照组均 没有显著性差异。