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法律状态
2018-01-09
专利权的转移 IPC(主分类):C12Q1/68 登记生效日:20171221 变更前: 变更后: 申请日:20120426
专利申请权、专利权的转移
2014-04-02
授权
授权
2012-11-07
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20120426
实质审查的生效
2012-09-12
公开
公开
技术领域
本发明涉及到一种检验有机污染物对水生生物毒害或干扰 的方法,尤其涉及到一种检验水生生物体内内分泌是否受到外源 环境中低浓度类雌激素干扰物毒害或干扰的方法,属于水生生物 类雌激素干扰物的检验领域。
背景技术
生态环境中的化学污染物质干扰人类和野生动物的内分泌 功能,从而对个体的生殖、发育和性行为等产生多方面的影响, 甚至会影响到人类的生存繁衍(Tilghman S L,Nierth-Simpson E N,Wallace R,et al.Environmental hormones:Multiple pathways for response may lead to multiple disease outcomes[J].Steroids, 2010,75(8-9):520-523)。因而国际组织和发达国家对内分泌干 扰危害效应监控实行强制管理,如联合国GHS(全球化学品统一 分类和标签制度)和欧盟REACH(化学物质注册、评估、授权和 限制)法规1907/2006(EC)中均对内分泌干扰化学物质提出了明 确管控要求。
VTG是卵黄蛋白的前体,通常受循环的内源性雌激素刺激, 由雌性卵生脊椎动物肝脏产生,由血流进入卵巢,并被发育中的 雌性配子吸收并改变。它是直接通过雌激素受体调节途径来合成 的,一般只在成熟雌鱼体内合成,而在幼鱼或成年雄鱼体内含量 很低,难以检测出。但在受外源性的雌激素的刺激下,肝脏能够 合成并分泌VTG;而芳香酶通过抑制转化内源性雄激素为天然 雌激素17β-雌二醇,会引起VTG水平的降低。因此,通过测量 VTG水平的变化,能够探索不同化学物质的内分泌干扰作用机 制。
全氟碳化合物(PFCs)已成为重要的持久性有机污染物 (POPs),广泛分布于环境、野生动物和人类中。其中代表性的全 氟辛烷磺酰基化合物(Perfluorooctanesulphonate,PFOS)、全氟辛 酸(Perfluorooctanoic acid,PFOA)以及它们的衍生物已成为新型 持久性有机污染物质,可以通过呼吸和食物被生物体摄取,有很 高的生物蓄积性,可能具有内分泌干扰毒性、遗传毒性、肝脏毒 性等(Jensen A A,Leffers H.Emerging endocrine disrupters: perfluoroalkylated substances [J].International Journal of Andrology,2008,31(2):161-169;Clarke B O,Smith S R.Review of‘emerging’organic contaminants in biosolids and assessment of international research priorities for the agricultural use of biosolids [J].Environment International,2011,37(1):226-247), 其工业生产已于2000年禁止。在2009年5月4日-8日在瑞士 日内瓦召开的“有关持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约”会议 上,鉴于PFOS,其盐化合物以及全氟辛烷磺酰氟等的剧毒性和 持久性,将它们列入斯德哥尔摩公约新增受控化学物质范围。
当水生生物处于高浓度类雌激素干扰物的外源环境的毒害 或污染下,将显现出较为明显的形态特征变化或生理变化,再结 合采用多种生物标记物,可以非常准确和灵敏的检验出水生生物 是否受到外源环境中高浓度类雌激素干扰物的毒害或污染。水生 生物受到低浓度的类雌激素干扰物的毒害或污染时,无论是外部 的形态特征还是内部的生理指标都不会显现出较为明显的变化, 此外,现有的用于评价类雌激素干扰物对于水生生物内分泌干扰 效应的生物标志物均不同程度的存在敏感性较差、准确率较低的 缺陷。迄今为止,缺乏一种高灵敏、高准确率的检验水生生物体 内内分泌是否受到外源环境中低浓度类雌激素干扰物毒害或干 扰的方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足,本发明人进行了锐意研究, 发现,在暴露于低剂量的诸如全氟辛烷磺酰基化合物 (Perfluorooctanesulphonate,PFOS)或全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PFOA)等类雌激素干扰物时,虽然斑马鱼,特别是雄性斑 马鱼体征没有发生明显变化,但其卵黄蛋白原的VTG1和/或 VTG3的mRNA的表达水平明显升高,通过这种方法可以灵敏、 准确地确定斑马鱼是否受到外源环境中低剂量类雌激素干扰物 毒害或干扰,由此完成本发明。
本发明的目的在于提供了一种检验水生生物是否受到外源 环境中低浓度类雌激素干扰物毒害或干扰的方法,包括以下步 骤:
(1)分别提取待检测水生生物肝脏的总RNA以及对照水 生生物肝脏的总RNA;
(2)对所提取的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/ 或VTG3的mRNA的表达水平进行定量;
(3)如果待检测样品卵黄蛋白原的VTG 1mRNA的表达水 平高于对照样品卵黄蛋白原的VTG1 mRNA的表达水平,以及/ 或者待检测样品卵黄蛋白原的VTG3 mRNA的表达水平高于对 照样品卵黄蛋白原的VTG3 mRNA的表达水平,则待检测水生 生物体内内分泌受到低浓度类雌激素干扰物的毒害或干染;
其中,,待检测水生生物与对照水生生物是同一种水生生物, 所述的对照水生生物是没有遭受类雌激素干扰物毒害或污染的 水生生物。
在根据本发明的方法中,所述的水生生物优选为水生鱼类, 更优选为斑马鱼(Brachydanio rerio);特别优选的,所述的斑 马鱼是雄性斑马鱼(Brachydanio rerio)。
斑马鱼(Brachydanio rerio)是淡水水族箱观赏鱼,原产于 亚洲,体长约4公分,具暗蓝与银色条纹。斑马鱼基因与人类基 因的相似度达到87%,在其身上做药物实验所得到的结果在多 数情况下也适用于人体,因此广泛应用于生命科学的研究,日益 受到生物学家的重视。斑马鱼的胚胎是透明的,所以生物学家很 容易观察到药物对其体内器官的影响。此外,雌性斑马鱼可产卵 200枚,胚胎在24小时内就可发育成形,这使得生物学家可以 在同一代鱼身上进行不同的实验,进而研究病理演化过程并找到 病因。
本发明人经过大量实验发现,当斑马鱼暴露于低浓度类雌激 素干扰物如全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物时, 雄性斑马鱼的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3 的mRNA的表达水平升高程度比雌性斑马鱼的肝脏总RNA中的 卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA的表达水平升高程度 更高,表明雄性斑马鱼对于低浓度类雌激素干扰物更为敏感,因 此通过雄性斑马鱼的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和/ 或VTG3的mRNA的表达水平更易于判定斑马鱼是否受到低浓 度类雌激素的毒害或干扰。
在根据本发明的方法中,所述的类雌激素干扰物包括全氟碳 化合物、对特辛基苯酚或17β-雌二醇;所述的全氟碳化合物优 选为全氟辛烷磺酰基化合物或全氟辛酸全氟碳化合物;进一步优 选的,所述全氟辛烷磺酰基化合物是全氟辛烷磺酸。
在本文中,所用术语“低浓度类雌激素干扰物”的含义是指浓 度为0.1μg·L-1-1000μg·L-1的类雌激素干扰物,进一步优选为浓 度为0.1μg·L-1-100μg·L-1的类雌激素干扰物,特别优选为浓度 为10μg·L-1-100μg·L-1的类雌激素干扰物,最优选为浓度为10 μg·L-1的类雌激素干扰物。
优选地,当水生生物为斑马鱼时,斑马鱼的肝脏总RNA 中的卵黄蛋白原的VTG1的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示;斑 马鱼的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG3的核苷酸序列为 SEQ ID No.2所示。
为了对水生生物肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和 VTG3的mRNA的表达水平进行定量,可以采用实时荧光定量 PCR或半定量RT-PCR等方法对VTG1或VTG3的mRNA的表 达水平进行定量;也可以采用组织芯片和原位杂交技术检测点阵 石蜡组织芯片中VTG1或VTG3的mRNA的表达,再用 LeicaQ500MC图像分析系统定量测试VTG1或VTG3的mRNA 表达水平,这些定量方法或手段均为本领域技术人员所通晓。作 为一个优选的实施方案,本发明采用实时荧光定量PCR的方法 对所提取的肝脏总RNA中的卵黄蛋白原的VTG1和VTG3的 mRNA的表达水平进行定量;其中,所述荧光定量PCR的方法 中用于扩增目的基因的3对引物分别如下:第1对引物的核苷酸 序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示;第2对引物的核苷酸 序列为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示;第3对引物的核苷酸 序列为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示;所述荧光定量PCR 的方法中的探针序列分别为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。
本发明的另一目的在于提供了将水生生物肝脏总RNA中的 卵黄蛋白原的VTG1 mRNA和/或VTG3 mRNA的表达水平作为 检验水生生物体内内分泌是否受到低浓度类雌激素干扰物毒害 或干扰的生物标记物的用途;优选的,所述的水生生物是水生鱼 类;进一步优选为斑马鱼(Brachydanio rerio);更优选的,所 述的斑马鱼是雄性斑马鱼(Brachydanio rerio)。
卵黄蛋白原(VTG)是由内源性雌激素或外源性雌激素作用 下,刺激卵生动物肝细胞(作用于肝雌激素受体)而产生的,经血 运输到卵巢,经过修饰后以卵黄蛋白形式储存于卵母细胞,为胚 胎的发育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和硫等营 养和功能性物质。
本发明将斑马鱼(Brachydanio rerio)暴露于各种不同浓度 全氟辛烷磺酸(PFOS)的环境中,测定斑马鱼体内肝脏总RNA 中的卵黄蛋白原的VTG1和/或VTG3的mRNA的表达水平的变 化。实验结果表明,低剂量的PFOS暴露均不同程度地引起雄性 和雌性斑马鱼肝脏中VTG mRNA水平升高,说明低浓度PFOS 暴露对斑马鱼的内分泌干扰作用明显,斑马鱼肝脏中 VTG1 mRNA和/或VTG3 mRNA水平可作为PFOS内分泌干扰效 应评价的敏感生物标志物;此外,本发明进一步的实验发现,斑 马鱼暴露于低浓度全氟辛烷磺酰基化合物后,斑马鱼肝脏中 VTG3 mRNA水平响应比VTG1更敏感,表明斑马鱼肝脏中VTG3 mRNA水平比VTG1 mRNA水平更适合作为PFOS内分泌干扰效 应评价的敏感生物标志物。
作为本发明的一个具体的应用方式,可以分别将斑马鱼体内 肝脏中所提取的VTG1 mRNA和/或VTG3 mRNA作为探针制备成 生物芯片,例如:基因芯片、组织芯片或细胞芯片等,采用高通 量的方式检验待检测水生生物的肝脏中VTG1 mRNA水平和/或 VTG3 mRNA水平,再将其与对照水生生物的肝脏中VTG1 mRNA 和/或VTG3 mRNA的表达水平进行比较,从而检验水生生物内 分泌是否受到外源环境中低浓度类雌激素干扰物的毒害或干扰。
基因芯片是在载体(尼龙膜、玻璃片或硅片等)上按照预先 设计的位置高密度有序的排列大批量的核酸探针(也称DNA芯 片或DNA微阵列),形成高密度点阵,与样品中的靶分子作用 后,通过分子杂交技术在相同条件下进行分子反应,采用同位素 法、化学荧光法或化学发光法等方法对反应结果进行显示,并采 用相应的方法进行定量。
具体到本发明,可以将水生生物的肝脏中VTG1 mRNA或 VTG3 mRNA作为探针采用原位点样法或直接点样法等方式将 探针按照预先设计的位置高密度有序的排列或点样到尼龙膜载 体(或玻璃片、硅片等载体)上,得到基因芯片;从待检测的水 生生物的肝脏中提取VTG1 mRNA或VTG3 mRNA,将所提取的 VTG1 mRNA或VTG3 mRNA经过逆转录后再进行PCR扩增,将 扩增产物的末端用荧光标记后与芯片上的探针分子进行分子杂 交,采用共聚焦荧光扫描仪进行信号检测,定量待测样品中 VTG1 mRNA或VTG3 mRNA的表达水平,再与对照样品中的 VTG1 mRNA或VTG3 mRNA的表达水平进行比较,就可快速、 准确的检验出待检测水生生物体内内分泌是否受到外源环境中 低浓度类雌激素干扰物毒害或干扰。
组织芯片,又称组织微阵列,是将大量的组织片有序的排列 于载体上而得到的微缩组织切片,用于研究同一基因或蛋白质分 子在不同细胞或组织中的表达情况,具有体积小、高通量、丰富 样本、快速省时等优点。组织芯片还可以与免疫组化、荧光核酸 原位杂交、RNA原位杂交等技术相结合。
本领域技术人员可以参考以下方法制备组织芯片,包括:待 测样品的收集、芯片的制备、染色及染色后扫描、数据处理。其 中,制作组织芯片时多采用石蜡组织芯片,石蜡组织芯片的制作 是采用组织芯片制作机的活检细针,从大量供体蜡块组织中钻取 若干个圆柱形的组织芯,然后将样本整齐的放到受体蜡块中制作 组织芯片蜡块,对组织芯片蜡块进行切片,再将切片转移到载玻 片上。利用显微镜精密的机械控制功能,进行打孔、取样、点样、 观察与定位、通过化学染色或原位杂交,载玻片上所有标本的信 号可以同时显现出来。与普通切片相比,组织芯片的单次可以同 时对上百个样本进行免疫组织化和原位杂交,可以大规模分析样 本,并具有数据统计精确性和高效性等优点。
附图说明
图1示出低浓度PFOS暴露对雄性斑马鱼肝脏VTG1和 VTG3 mRNA水平的影响。
图2示出低浓度PFOS暴露对雌性斑马鱼肝脏VTG1和 VTG3 mRNA水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和 特点将会随着描述而更为清楚明确。但这些实施例仅是范例性 的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理 解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案 的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明 的保护范围内。
试验例 低浓度的全氟辛烷磺酸暴露对于斑马鱼肝脏VTG1 mRNA和VTG3 mRNA表达水平的影响试验
1材料与方法
1.1仪器与试剂
仪器:荧光定量PCR仪(ABI-7500,ABI公司,美国),混 合型球磨仪(MM400,RETSCH公司,德国),冷冻离心机(3-18K, Sigma公司,德国),涡旋混匀器(IKA MS3 digital,北京德泉兴 贸有限公司);紫外分光光度计(UNIC 4802 UV/Vis Spectrophotometer,北京德泉兴贸有限公司);peqSTAR梯度PCR 仪(德国peQLab,北京德泉兴贸有限公司);微型离心机 (BAYGENE QspinTM,北京德泉兴贸有限公司)。
试剂:全氟辛烷磺酸(Assay LC-MS 98%,Sigma-Aldrich公 司,美国);Trizol试剂(CAS 15596-026,Invitrogen Beijing Office);三氯甲烷,异丙醇,乙醇(北京化工厂,分析纯);氧化 锆(3mm,BioLAB Materials Institute);Oligo dT(10μmol·L-1), dNTP(99%以上,2.5mmol·L-1),Quant Reverse Transcriptase, 10×RT Buffer,RNase-free H2O(TIANGEN BIOTECH(BEIJING) CO.,LTD);Taqman Mixture(2×),ROXII(TakaRa,宝生物工程(大 连)有限公司),目的基因和内参基因引物和探针(Invitrogen英潍 捷基(上海)贸易有限公司)。基因引物和探针设计分别如表1。
表1目的基因和内参基因引物和探针序列
1.2供试生物
实验鱼:斑马鱼(Brachydanio rerio),体长1.0-1.5cm,体重 0.120-0.220g,雌雄兼有,购于北京市东郊市场。采用反渗透纯 净水机制备的水。试验前将雌雄斑马鱼分开,在试验条件下预养 7d,水温(25±2)℃,饲养容器为2L烧杯,饲养密度不大于1 g·L-1(即每升水容纳斑马鱼的质量为1g),每日光照12-14h,早 晚定时投喂孵化的丰年虫2次,并每天清除排泄物,预养期间斑 马鱼死亡率不超过5%。
1.3 21天毒性试验
预养结束后停止喂食1d,然后进行以下实验:设置染毒浓 度为0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1、100μg·L-1的4个实验组, 同时设置空白对照组,每组3个平行样,分别对雌、雄斑马鱼进 行21d的毒性试验。实验在2L烧杯中进行,每缸内盛有1.8L 不同浓度的染毒液,且每缸随机投放8尾斑马鱼。暴露期间水温 维持在(25±2)℃,采用每周两次更换全部药液的半静态法进行暴 露,暴露周期为21d,暴露期间每天喂食2次,其余条件与预养 期间相同。
1.4肝脏提取
21d染毒结束后,立即捞出斑马鱼并将其置于冰上冷冻处 死,每浓度组中分别取雌雄性别斑马鱼肝脏3-5个(约20mg左 右),置于1mL Trizol试剂中,加入1颗氧化锆的小珠,于-80℃ 保存,留待用于检测VTG1和VTG3 mRNA水平,所有操作在 冰上完成。
1.5RNA提取
将冷冻的含组织的Trizol试剂解冻,使用组织破碎机在 30Hz/2min进行匀浆。匀浆后的组织液在冰上孵育5min。在组 织液中加入200μL三氯甲烷,颠倒混匀后冰浴3min。以12000 r·min-1的速度4℃离心15min,可见蛋白沉淀。取300μL上清 液移入装有700μL的100%异丙醇的1.5ml离心管中,颠倒混 匀,冰浴10min。于12000r·min-1,4℃离心10min,离心管底 部可见白色RNA沉淀。弃去上清液,加入1mL的75%乙醇, 涡旋片刻。在7400r·min-1,4℃离心5min,弃去上清。简短离 心,用移液枪吸出残余乙醇,室温晾干3-5min。待RNA晾至半 透明,视沉淀大小加入适量无RNA酶的水。待溶解后进行反转 录。
1.6反转录
取1μL的RNA溶液,用紫外分光光度法测其浓度并进行适 当稀释至适当浓度范围(200-500ng·μL-1),然后进行反转录。反 转录体系(20μL)为:10×RT Buffer 2μL,Oligo dT(10μM)2μL, dNTP(每个2.5mmol·L-1)2μL,定量反转录酶1μL,RNA体积 (μL)=1000/RNA浓度(ng·μL-1),无RNA酶的水体积(μL)=13-RNA 体积(μL)。由于RNA提取后马上进行反转录操作,故反转录反 应体系中可不加入RNA酶抑制剂。
将上述体系涡旋混匀,简短离心后进行反转录,反转录条件 设置为:37℃1h,94℃3min。
1.7 Real Time PCR(实时PCR)
反应体系用Taqman Mixture+Rox II进行扩增,反应体系为 目的基因与内参基因在同一管中进行反应,具体反应体系(20μL) 为:Taqman Mixture(2×)10μL,ROXII 0.4μL,目的基因上游引 物(10μmol·L-1)0.4μL,目的基因下游引物(10μmol·L-1)0.4μL, 目的基因探针(10μmol·L-1)0.4μL,内参基因上游引物(10 μmol·L-1)0.4μL,内参基因下游引物(10μmol·L-1)0.4μL,内参 基因探针(10μmol·L-1)0.5μL,cDNA模板2μL,无RNA酶的 水5.1μL。
两步法PCR扩增标准程序:①Stage 1:预变性,Reps:1, 95℃30s;②Stage2:PCR反应,Reps:40,95℃5s,60℃34 s。
1.8样品相对定量分析结果
用AB 7500型荧光定量PCR仪,采用2-ΔΔCt法进行数据的 相对定量分析。根据Real Time PCR原始检测结果,按照2-ΔΔCt相对定量计算公式,即:
计算出各样品的目的基因相对定量结果,即各个样品相对于 对照样品,目的基因mRNA转录水平的差异。
1.9数据处理
实验数据用统计学方法进行处理,采用SPSS 13.0统计软件 进行显著性分析,各数据均用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示, 各组间的差异采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA),P≤0.05 为差异显著。
2结果与分析
2.1雄性斑马鱼肝脏中VTG含量
雄性斑马鱼肝脏中VTG1和VTG3含量结果见图1。图中数 据用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示,每组数据样本量n≥3。 柱形上方参数有一个字母相同则无显著性差异,反之则有显著性 差异(P≤0.05)。
由图1中可看出,PFOS暴露引起雄性斑马鱼肝脏 VTG1 mRNA和VTG3 mRNA水平升高。其中VTG1 mRNA水平 升高与剂量呈正相关,在100μg·L-1暴露浓度处与对照组呈现显 著性差异;VTG3 mRNA水平升高与剂量呈倒U型曲线,呈现典 型的毒物刺激荷尔蒙效应,在10和100μg·L-1暴露浓度处与对 照组呈现显著性差异。
2.2雌性斑马肝脏中VTG含量
雌性斑马鱼肝脏中VTG1和VTG3含量结果见图2。图中数 据用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示,每组数据样本量n≥3。 柱形上方参数有一个字母相同则无显著性差异,反之则有显著性 差异(P≤0.05)。
由图2中可看出,PFOS暴露引起雌性斑马鱼肝脏中VTG1 mRNA水平升高,在10μg·L-1暴露浓度处与对照组呈现显著性 差异,但在高浓度(10和100μg·L-1)处实验结果误差较大;VTG3 mRNA水平只在10μg·L-1暴露浓度处升高,但相比于对照组均 没有显著性差异。
机译: 检测试剂盒,其中使用的测定板,检测方法,评估方法,青蛙卵黄蛋白原的多克隆抗体及其生产方法
机译: 以及制造相同的多克隆抗体检测试剂盒的方法,所用的量板,检测方法,评估方法,蛙卵黄蛋白原
机译: 检测试剂盒,其中使用的测定板,检测方法,评估方法,青蛙卵黄蛋白原的多克隆抗体及其生产过程