木霉菌产孢培养基及产孢方法

摘要

本发明公开了一种木霉菌产孢培养基及产孢方法。该木霉菌产孢培养基由果糖、木糖和一种基本培养基(酵母提取物、酒石酸铵、硝酸铵、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合氯化钙、七水合硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠和水)组成。分别以果糖和木糖为碳源，以酒石酸铵和酵母提取物为氮源；加入的无机盐具有构成微生物细胞的组成成分，并具有调节酶活性及细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等功能；其中的磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长的最适pH值；满足了该菌的生长需要。本发明的产孢方法为22～28℃，光照培养。本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基培养五天产孢量可达到7.4×10

说明书

技术领域

本发明涉及一种胡桃楸内生真菌高效的产孢方法，特别是木霉菌产孢培养基及产孢 方法。

背景技术

该内生真菌是从胡桃楸树皮部分离得到的其发酵产物具有抗癌活性的菌株，进行初 步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属。对该菌的发酵产物进行抗癌 活性检测，其发酵产物能显著抑制肝癌细胞的生长，发酵液抗癌能力与1mg/L紫杉醇溶 液基本相当。因此研究该木霉菌的分生孢子对其发酵产物抗癌活性和其机理的研究及其 菌种的保藏具有重要的作用。目前，该木霉菌(木霉菌属长枝木霉(Trichoderima  longibrachiatm)保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M208102；该 菌株已经在中国专利CN101487022中公开。)为受专利保护的本实验室独有菌种，因此 国内外尚无关于该种木霉菌产孢培养方法的报道，真菌通用的培养基不能很好的满足该 菌的产孢要求，这极大地限制了对该种胡桃楸内生真菌以及其发酵产生的抗癌物质的进 一步深入研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种木霉菌的产孢培养基及产孢条件。本发明的胡桃球内生真 菌木霉菌产孢培养基及产孢条件能很好的满足该菌种的产孢要求，培养五天产孢量可达 到7.4×10⁷个孢子/毫升培养基。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种木霉菌的产孢培养基，该培养基含有以下重量百分比的物质： 0.5～5％果糖，0.5～5％木糖以及90～99％的基本培养基。

优选地，所述基本培养基含有以下重量百分比的物质：0.025～2.5％酒石酸铵、 0.005～0.5％酵母提取物、0.005～0.5％硝酸铵、0.005～0.5％磷酸二氢钾、0.0025～ 0.25％七水合硫酸镁、0.0005～0.05％氯化钠、0.00065～0.065％二水合氯化钙、 0.01～1％七水合硫酸亚铁、0.01205～1.205％乙二胺四乙酸二钠、0.04～4％琼脂，余 量为水。

本发明还涉及一种木霉菌的产孢方法，包括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和产 孢培养基配制及产孢工艺步骤，产孢培养基配制时，将前述的产孢培养基中含有的物质 按重量百分比含量混合溶解后在100～140℃，高压灭菌20～60分钟；产孢工艺步骤为： 将前述的产孢培养基分装到250ml三角瓶中，每瓶10～25毫升，4℃保藏备用；吸取已 保藏的孢子悬液或已培养好的该菌菌球置于产孢培养基中；产孢条件为：温度22～28 ℃，每天光照时间0～15小时。

本发明的有益效果在于：

1、本发明产孢培养基中各物质性能稳定，分别以果糖和木糖为碳源，以酒石酸铵 和酵母提取物为氮源，提供了该菌产孢的碳元素和氮元素；加入的无机盐具有构成微生 物细胞的组成成分，并且具有调节酶活性及细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位 等功能；其中的磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长的最适PH值；满足了该菌 的生长需要。

2、本发明的产孢条件温和，容易控制。

3、本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基培养五天产孢量可达到7.4×10⁷个孢 子/毫升培养基。

附图说明

图1为孢子数量与培养时间之间关系的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的 技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些 都属于本发明的保护范围。

以下实施例及对比例中选用的木霉菌为木霉菌属长枝木霉(Trichoderima  longibrachiatm)，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M208102； 该菌株已经在中国专利CN101487022中公开。

对比例1

真菌通用培养基-PDA培养基各原料含量关系如下：

产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120℃、高压灭 菌40分钟，4℃保藏备用；

产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米左右的菌球接种到含有20毫升固体培养 基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。培养五天产孢量可达到2.3×10⁶个孢子/毫升培养基。

对比例2

产孢培养基各原料含量关系如下：

产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120℃、高压灭 菌40分钟，4℃保藏备用；

产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升固体培养 基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。培养五天产孢量可达到1.4×10⁵个孢子/毫升培养基。

实施例1

一种木霉菌产孢培养基各原料含量关系如下：

产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120℃、高压灭 菌40分钟，4℃保藏备用；

产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升产孢培养 基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。该木霉菌的孢子数量与培养时 间之间关系的曲线图如图1所示，由图1可知：培养五天产孢量可达到7.4×10⁷个孢子/ 毫升培养基。

由实施例1与对比例2的比较可知，实施例1的采用果糖和木糖作为碳源的产孢培养 基，培养五天产孢量可达到7.4×10⁷个孢子/毫升培养基，其效果远高于对比例2的采用 葡萄糖作为碳源的产孢培养基(培养五天产孢量为1.4×10⁵个孢子/毫升培养基)。

由实施例1与对比例1的比较可知，本发明的产孢培养基的产孢效果高于真菌通用培 养基-PDA培养基的产孢效果(培养五天产孢量为2.3×10⁶个孢子/毫升培养基)。

实施例2

产孢培养基各原料含量关系如下：

产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在100℃、高压灭 菌60分钟，4℃保藏备用；

产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升固体培养 基的三角瓶中，22℃，培养5天。培养五天产孢量可达到1.2×10⁷个孢子/毫升培养基。

实施例3

产孢培养基各原料含量关系如下：

产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在140℃、高压灭 菌20分钟，4℃保藏备用；

产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的木霉菌菌球接种到含有20毫升固 体培养基的三角瓶中，28℃，每天光照时间15小时，培养5天。培养五天产孢量可达到 5.2×10⁶个孢子/毫升培养基。