磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)抑制剂组合物,用途以及方法

摘要

在此披露了具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）抑制活性的分离的多肽，用于表达它们的载体和细胞以及它们用于治疗细胞毒性应激相关疾病的方法，例如脊髓损伤、中风、创伤性脑损伤、多发性硬化症、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬化（ALS）、帕金森病、以及亨廷顿病。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年10月16日提交的美国临时申请号 61/272,655的优先权。

技术领域

本发明涉及用于治疗与细胞毒性或刺激毒性应激相关的不同适应 症的治疗法，它们的用途以及方法。具体地是肽类以及它们的组合物， 它们具有在其中使用的磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）抑制活性以 及用于治疗与细胞毒性或刺激毒性应激相关适应症的方法。

发明背景

磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）是据报道涉及多种癌类型进展 的一种肿瘤抑制因子（Li等人1997；Steck等人1997；Baker 2007）。 PTEN是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT途径的一种负调节物-失去 PTEN导致PI3K/AKT信号级联的活化并且导致增加的细胞生长和增 殖。PTEN还显示具有与PI3K/AKT信号传导不相关的其他功能-例如， 在通过与着丝粒物理地相互作用维持染色体稳定性以及控制DNA修 复方面（Shen等人2007）。PTEN已经隐含在多种非癌适应症中，例 如中风，其中用siRNA下调PTEN已经显示在转染的神经元中具有抗 局部缺血神经元损伤的神经保护作用（Ning等人2004）。

PTEN的定位和降解已经显示涉及翻译后修饰，特别是泛素化作 用（Trotman等人2007；Wang等人2007；Wang等人2008）。PTEN 主要定位到细胞质中，但是已知一种独特集合的PTEN定位到细胞核 中（综述见（Lian和Di Cristofano 2005））。当PTEN不包含典型的细 胞核定位信号时，它的确包含两个PEST结构域，这些结构域通常发 现于靶向用于通过泛素化作用降解的蛋白中。实际上，多泛素化作用 已经显示主要靶向PTEN用于细胞降解（Wang等人2007），而单泛素 化作用主要涉及PTEN核转位（Trotman等人2007）。PTEN蛋白序列 中两个特异性泛素化位点（K13和K289）已经显示直接涉及PTEN核 转位-这些位点之一的单泛素化作用显示足以用于核转位。这两个位点 之一的突变显著地抑制了PTEN的核转位（Trotman等人2007）。

尚不清楚的是核转位是否发生在中枢神经细胞中，并且如果发生 的话，用于PTEN的这种核转位的机理是否与至今已经试验过的其他 细胞中的相同。

发明概述

本发明部分地基于这种出人意料的发现，即在神经元细胞中 PTEN的K13泛素化位点的突变显著地降低了PTEN的核转位，而在 相同细胞中PTEN的K289泛素化位点的突变未显著地影响PTEN的 核转位。此外，出人意料的是被设计成干扰PTEN的K13泛素化位点 处泛素化作用的某些新型肽类：1)在神经元细胞培养物中阻断了 NMDA-诱导的PTEN核转位；2)在神经元培养物中阻断了NMDA诱 导的刺激毒性神经元损伤；3)在大鼠局部缺血模型中体内地阻断了 PTEN核转位；4)当中风后给药时，在大鼠局部缺血模型中体内地减 少了中风相关梗死区；5)当中风后给药时，在大鼠局部缺血模型中体 内地改善了中风相关长期运动行为恢复；6)在ALS的转基因动物模 型中改善了行为结果；以及7)在大鼠体内局部脑缺血之后促进了脑 内地移植到梗死区中的iPS-NPC（干细胞）的存活；而当与设计成在 PTEN的K289位点处干扰泛素化作用的肽类比较时，不显示这类特性。

在本发明的某些方面中，提供了一种分离的多肽组合物，该多肽 组合物具有基本上类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID  NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸组成。其中基本上类似是指当比较等 效区域时（即约14个氨基酸），包括一种序列一致性程度。此外，基 本上类似是指包括保守取代以及修饰的氨基酸，其条件是针对PTEN  K-13在此说明的PTEN抑制活性或其他活性得以维持。

根据一个实施方案，提供了包括SEQ ID NO:1的一种分离的多肽 或包括与SEQ ID NO:1具有至少90%一致性的8-14个氨基酸序列的 一种多肽，或包括与SEQ ID NO:1的对应氨基酸具有至少90%一致性 的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO:1的位置8 是赖氨酸（K），并且其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN） 抑制活性。分离的多肽可以进一步包括结合到分离的多肽上的一个递 送和靶向（dat）部分。该dat部分可以是选自下面的一项或多项：配 体类、受体类、蛋白转导结构域类（PTD）、或抗体类。该dat部分可 以是一种PTD。该分离的多肽可以包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的一种氨基酸序列。该dat部分可以是选自：触角 足同源结构域、白喉毒素易位结构域、炭疽毒素易位结构域、假单胞 菌外毒素a易位结构域、皮抑菌肽s4、hsv-1 vp22、pep-1、tat蛋白转 导结构域、聚-l-赖氨酸、以及聚-d-赖氨酸。该多肽可以包括SEQ ID NO: 2。

根据一个实施方案，提供了包括SEQ ID NO:1的一种分离的多肽 或包括与SEQ ID NO:1具有至少90%一致性的8-14个氨基酸序列的 一种多肽，或包括与SEQ ID NO:1的对应氨基酸具有至少90%一致性 的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO:1的位置8 是赖氨酸（K），并且其中该多肽保护细胞免受细胞毒性应激或刺激毒 性应激。分离的多肽可以进一步包括结合到分离的多肽上的一个递送 和靶向（dat）部分。该dat部分可以是选自下面的一项或多项：配体 类、受体类、蛋白转导结构域类（PTD）、或抗体类。该dat部分可以 是一种PTD。该分离的多肽可以包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的一种氨基酸序列。该dat部分可以是选自：触角 足同源结构域、白喉毒素易位结构域、炭疽毒素易位结构域、假单胞 菌外毒素a易位结构域、皮抑菌肽s4、hsv-1 vp22、pep-1、tat蛋白转 导结构域、聚-l-赖氨酸、以及聚-d-赖氨酸。该多肽可以包括SEQ ID NO: 2。

根据另一个实施方案，提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸 包括对在此所述多肽进行编码的一种核苷酸序列。该多核苷酸可以编 码包括SEQ ID NO:1的一种分离的多肽或包括与SEQ ID NO:1具有 至少90%一致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，或包括与SEQ ID  NO:1的对应氨基酸具有至少90%一致性的8-14个氨基酸序列的一种 多肽，其条件是SEQ ID NO:1的位置8是赖氨酸（K），并且其中该 多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）抑制活性。

根据另一个实施方案，提供了一种组合物，该组合物包括在此所 述的一种多肽和一种载体。该多肽可以包括选自下面一项或多项的一 种多肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、以及SEQ ID  NO:6，或与其基本上类似的一种氨基酸组合物。该载体可以是选自下 组：一种固相支撑体、一种稳定剂、一种防腐剂、以及一种药学上可 接受的载体。

根据另一个实施方案，提供了在此所述的一种分离的多肽，该多 肽已经被重组地生产并且从细胞中分离。

根据另一个实施方案，提供了包含一种分离多核苷酸的载体，该 多核苷酸包括对在此所述多肽进行编码的一种核苷酸序列。该多核苷 酸可以编码包括SEQ ID NO:1的一种分离的多肽或包括与SEQ ID  NO:1具有至少90%一致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，或包括 与SEQ ID NO:1的对应氨基酸具有至少90%一致性的8-14个氨基酸 序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO:1的位置8是赖氨酸（K）， 并且其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）抑制活性。

根据另一个实施方案，提供了包括在此所述的一种多核苷酸或在 此所述的一种载体的一种细胞，其中该核苷酸可操作地连接到一个表 达控制序列上。

根据另一个实施方案，提供了保护细胞免受细胞毒性应激或刺激 毒性应激的一种方法，该方法包括将选自下面一项或多项的一种多肽 递送到细胞中：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、以及 SEQ ID NO:6。

根据另一个实施方案，提供了保护细胞免受细胞毒性应激或刺激 毒性应激的一种方法，该方法包括(a)将包括如权利要求13所述多 核苷酸的载体递送到细胞中；以及(b)表达由该载体携带的序列。

根据另一个实施方案，提供了表达一种多肽的方法，包括：(a)提 供对该多肽进行编码的一种表达载体，其中该多肽是选自下面一项或 多项：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6； (b)将该载体引入到细胞中；以及(c)在允许表达的条件下维持细胞。 将载体引入到细胞中可以体内进行。将载体引入到细胞中可以离体进 行。将载体引入到细胞中可以体外进行。

根据另一个实施方案，提供了用于治疗与细胞毒性应激相关疾病 的一种方法，包括将一个生物学有效量的PTEN抑制剂施用到需要它 的受试者体内，该抑制剂包括SEQ ID NO:1的一种分离的多肽，或包 括与SEQ ID NO:1具有至少90%一致性的14个氨基酸序列的一种多 肽或包括与SEQ ID NO:1具有至少90%一致性的8-14个氨基酸序列 的一种多肽，或包括与SEQ ID NO:1的相应氨基酸具有至少90%一致 性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO:1的位置8 是赖氨酸  （K），并且其中该多肽具有磷酸酶以及张力蛋白同系物 （PTEN）抑制活性。该细胞毒性应激可以是刺激毒性应激。

根据另一个实施方案，提供了用于在干细胞移植之后增强干细胞 存活的一种方法，包括将一个生物学有效量的下面各项施用到需要它 的受试者体内：包括SEQ ID NO:1的一种分离的多肽，或包括与SEQ ID NO:1具有至少90%一致性的14个氨基酸序列的一种多肽或包括 与SEQ ID NO:1具有至少90%一致性的8-14个氨基酸序列的一种多 肽，或包括与SEQ ID NO:1的相应氨基酸具有至少90%一致性的8-14 个氨基酸序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO:1的位置8是赖氨酸 （K），并且其中该多肽具有磷酸酶以及张力蛋白同系物（PTEN）抑 制活性。

根据另一个实施方案，提供了用于治疗与细胞毒性应激相关疾病 一种药用组合物，该组合物包括在此所述的一种多肽以及一种药学上 可接受的载体。与细胞毒性应激相关的疾病可以是选自脊髓损伤、中 风、创伤性脑损伤、多发性硬化症、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬 （ALS）、帕金森病、以及亨延顿病。该细胞毒性应激可以是刺激毒性 应激。

根据另一个实施方案，提供了在此所述的多肽用于制备治疗细胞 毒性应激相关疾病药物的用途。该细胞毒性应激可以是刺激毒性应激。

根据另一个实施方案，提供了在此所述的多肽用于治疗细胞毒性 应激相关疾病的用途。

根据另一个实施方案，提供了包括在此所述的一种多肽以及一种 药学上可接受的载体的一种药用组合物用于治疗细胞毒性应激相关疾 病的用途。该细胞毒性应激可以是刺激毒性应激。

根据另一个实施方案，提供了一个商业包，包括(a)所述的一种 多肽；以及(b)它的用于治疗细胞毒性应激相关疾病的使用说明书。 该细胞毒性应激可以是刺激毒性应激。

根据另一个实施方案，提供了一个商业包，包括(a)在此所述的 一种多肽以及一种药学上可接受的载体；以及(b)它的用于治疗细胞 毒性或刺激毒性应激相关疾病的使用说明书。

根据另一个实施方案，提供了一个商业包，包括(a)在此所述的 一种药用组合物；以及(b)它的用于治疗细胞毒性应激相关疾病的使 用说明书。该细胞毒性应激可以是刺激毒性应激。

在其他实施方案中，提供了用于防止、抑制或减少细胞中PTEN 的泛素化作用的方法，该方法包括使细胞与具有基本上类似于SEQ ID  NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸组 成的多肽相接触。在其他实施方案中，提供了治疗患有或怀疑患有神 经疾病或病症的受试者的方法，该方法包括将一个治疗有效量的能够 防止或抑制PTEN的泛素化作用的分离的多肽施用到受试者体内。该 分离的多肽可以进一步包括一个蛋白转导结构域或其他dat部分。该 多肽可以具有基本上类似于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID  NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸组成。该神经疾病或病症可以是与细 胞毒性应激或细胞死亡相关联的一种。该神经疾病或病症可以是选自 下组的一种：中风、脑损伤、神经退行性疾病、阿耳茨海默病、帕金 森病、亨延顿病、以及ALS。

生物学有效量可以是足以防止细胞死亡的一个数量。与细胞毒性 或刺激毒性应激相关的疾病可以是选自脊髓损伤、中风、创伤性脑损 伤、多发性硬化症、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬（ALS）、帕金森 病、以及亨延顿病。该细胞毒性或刺激毒性应激相关疾病可以是中风。 该PTEN抑制剂可以是包括SEQ ID NO:1的一种多肽。分离的多肽可 以进一步包括结合到分离的多肽上的一个递送和靶向（dat）部分。该 dat部分可以是选自下面的一项或多项：配体类、受体类、蛋白转导结 构域类（PTD）、或抗体类。该dat部分可以是一种PTD。该PTEN抑 制剂可以是一种多肽，包括选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5或SEQ  ID NO:6的一种氨基酸序列。该dat部分可以是选自：触角足同源结 构域、白喉毒素易位结构域、炭疽毒素易位结构域、假单胞菌外毒素 a易位结构域、皮抑菌肽s4、hsv-1 vp22、pep-1、tat蛋白转导结构域、 聚-l-赖氨酸、以及聚-d-赖氨酸。

治疗的可以是一种动物。该动物可以是一种哺乳动物。该动物可 以是人类。

对于本领域普通技术人员而言，通过结合附图查看下面本发明具 体实施方案的说明，本发明的其他方面和特征将变得清楚。

附图简要说明

图1显示了NMDAR活化增强了PTEN核转位。(a,b)LDH测定 （西格玛，#TOX7）和核染色（赫斯特33342）两者的结果。(c,d,e)内 源性PTEN的免疫染色以及亚细胞部分的蛋白质印迹。针对对应的亚 细胞标志物蛋白通过探查每个部分来证实不同细胞部分的纯度。(f)核 PIP3的水平，PIP3是核PTEN的底物。(g,h)PTEN的两个突变体过表 达于培养的海马神经元中。一个是磷酸酶死亡突变体 PTENC124S-GFP，并且另一个是野生型PTENGFP，这时它们两者都 与核定位信号（NLS）融合。

图2显示了通过干扰肽K13阻断PTEN核转位来拯救NMDAR介 导的刺激毒性。(a,b)对应地构建两个PTEN突变体，PTENK13R-GFP 和PTENK289R-GFP，并且转染到培养的海马神经元中。对每一项的 核对细胞质定位进行测量(c,d)。合成对应地位于K13和K289位点 侧翼的两个肽，其中肽e-K289作为肽-K13的对照起作用。对每一项 的核对细胞质定位进行测量，其中使用或不使用NMDA进行刺激。(e, f)具有或不具有NMDA刺激下来自用肽-K13和肽-K289处理的培养 神经元的核部分的蛋白质印迹结果。(g,h,i).NMDAR介导的细胞死 亡，通过(g,h)核染色（赫斯特33342）和(i)LDH测定（西格玛， #TOX7）两者来确定。

图3显示了在脑缺血之后施用PTEN肽减少了梗死体积（MRI） 并且提高了葡萄糖代谢活性（FDG-PET）。为了选择PTEN肽的最有效 治疗，用不同类型的肽治疗（静脉注射8.4mg/kg）将斯普拉-道来大 鼠（约200g）分成5组，(1)局部缺血发生后2小时给予肽-K13，(2) 局部缺血发生之后6小时给予肽-K13，(3)局部缺血发生之后2小时 给予肽-K13R，(4)局部缺血发生之后2小时给予肽-K289，以及(5)局 部缺血发生之后2小时给予盐水。每组n=10。(a)在脑缺血之后七天 时，通过MRI对梗死体积进行评估。(b)在治疗后一周通过FDG-PET 对皮层葡萄糖代谢进行检验。

图4显示了在脑缺血之后静脉内注射PTEN肽改善了移动行为性 能。在肽-K13-（2小时和6小时）、肽-K13R-（2小时）、肽-K289-（2 小时）以及盐水-（2小时）治疗的大鼠（n=10/组）中使用身体不对 称性、自发活动测试以及握力测量对神经缺陷恢复进行评估。(a)与 用肽-K13R、或肽-K289、或盐水用处理的大鼠相比较，身体摆动试验 中的恢复。(b,c,d)在接收肽-K13治疗、肽-K289、或盐水（2小时和 6小时）的大鼠中在自发活动（包括在垂直活动性、垂直时间、以及 垂直移动数量）方面的测量。(e)针对肽-K13-治疗组、肽-K289组或 盐水组（2小时和6小时）局部缺血之前和局部缺血后28天前肢握力 的比较。

图5显示了在脑缺血之后施用PTEN肽减少了梗死体积。与盐水 对照相比较以3种不同剂量（10mg/kg、1.0mg/kg、以及0.1mg/kg） 用PTEN肽来治疗斯普拉-道来大鼠（约200g），其中给药是缺血发生 之后2小时以及脑缺血之后7天，通过MRI对梗死体积进行评估。

图6A和6B显示了对应地针对雌性和雄性小鼠将Tat-K13 PTEN 肽施用到ALS的转基因小鼠模型中。

图7显示在移植之后7天完成的凋亡标志物TUNEL的免疫荧光 共区域化证明与盐处理的大鼠（iPS-NPC）相比较，Tat-K13治疗的大 鼠（iPS-NPCs+PTENK13）含有显著地更少的TUNEL阳性移植的 iPS-NPSc。

详细说明

中枢神经系统中PTEN的核转位机制以及这些过程干扰的说明可 以提供用于治疗不同细胞毒性应激或刺激毒性应激相关疾病的策略。 例如，中风、阿耳茨海默病、帕金森病、亨延顿病、绿内障、糖尿病 性神经病变、视黄醛退行性疾病、以及类似疾病。在此提供了多种肽、 多肽以及它们的组合物用于治疗与神经元休克、损伤和/或降解相关或 与细胞毒性或刺激毒性相关的疾病。刺激毒性或细胞毒性可以涉及脊 髓损伤、中风、创伤性脑损伤以及中枢神经系统（CNS）的神经退行 性疾病，例如多发性硬化症、阿耳茨海默病、肌萎缩性侧索硬（ALS）、 帕金森病、酒精中毒或戒酒以及亨延顿病。在神经元周围引起过多谷 氨酸酯浓度的其他常见病症是低血糖以及癫痫状态。

以合理地有效方式将生物活性分子例如在此所述的多肽类或肽类 递送到一个或多个细胞中可能需要将多于刚好的裸肽“倾卸”到细胞 上，或将该裸肽施用到病人或测试受试者体内。能够以适当方式将生 物活性分子递送或靶向到细胞中从而提供一个有效量例如一个药理学 有效量的试剂是本领域已知的，并且在例如Dietz等人2004.《分子 细胞神经科学》(Mol Cell.Neurosci）27:85-131中进行说明。在此说明 的肽或多肽可以结合到这样的一个或多个递送和靶向（dat）部分上。 如在此使用的术语递送和靶向（dat）部分是指包括帮助将在此所述的 肽或多肽递送或靶向到靶细胞或组织上或靶细胞中或靶组织的细胞中 的任何一个部分。此外，一个“dat部分”可以通过促进在此所述的肽类 或多肽类的生物学疗效来“帮助”递送或靶向。

‘dat部分’的实例可以包括脂质体类、脂类颗粒类、抗体类、受体 配体类、蛋白转导结构域类（PTD）、以及可以结合到在此所述的PTEN 抑制肽或多肽上的病毒载体类。

例如，当希望递送到脑时，可以将在此所述的分离的肽或多肽结 合到结合脑内皮细胞受体的抗体上，导致了受体和结合的配体的细胞 内吞/转胞吞作用（例如，美国专利7,744,879）。这些肽或多肽可以结 合到PDT上，例如HIV蛋白TAT（反式激活的转录激活因子蛋白）， 它允许这些肽通过内吞作用横过细胞膜。例如，SEQ ID NO:2（即 KEIVSRNKRRYQED-YGRKKRRQRRR），它是结合到TAT蛋白转导 结构域上的PTEN K13干扰肽（加下划线）。

PTD的实例包括触角足同源结构域（PEREZ等人1992《细胞科 学期刊》（J.Cell Sci）102:717-722）、transportan （POOGA等人1998 FASEB J 12:67-77）、白喉毒素的易位结构域（STENMARK等人1991 《细胞生物学期刊》（J Cell Biol）113:1025-1032;WIEDLOCHA等人 1994《细胞》（Cell）76:1039-1051）、炭疽毒素（BALLARD等人1998 《传染与免疫》（Infect.Immun）66:615-619;BLANKE等人1996《美国 国家科学院院刊》（Proc Natl Acad Sci）93:8437-8442）以及假单胞菌 外毒素A（PRIOR等人1992《生物化学》(Biochemistry)31:3555-3559）、 protegrin衍生物类例如皮抑菌肽S4（HARITON-GAZAL等人2002《生 物化学》（Biochemistry）41:9208-9214）、HSV-1 VP22（DILBER等人 1999《基因治疗》（Gene Ther.）6:12-21）、PEP-1（MORRIS等人2001 《自然生物技术》（Nature Biotechnol）19:1173-1176）、碱性肽类例如 聚-L和聚-D-赖氨酸（WOLFERT等人1996《基因治疗》（Gene Ther.） 3:269-273;RYSER等人1980《癌》（Cancer）45:1207-1211;SHEN等人 1978《美国国家科学院院刊》（Proc Natl Acad Sci）75:1872-1876）、 HSP70（FUJIHARA等人1999 EMBO J 18:411-419）以及HIV-TAT （DEMARCHI等人1996《病毒学期刊》（J Virol）70:4427-4437）。这 类蛋白转导结构域的其他实例和相关细节在DIETZ以上说明文献以及 其他本文所引述的参考文献中进行说明。此外，为了减少全身给药期 间肽的降解，可以使用改性的PEG将这些肽结合到小胶束或脂质体 上，或经受末端修饰，例如C-端酰胺化或N端乙酰化。

在此考虑了两种不同类型的结合。一种类型的结合可以是通过非 共价的或吸引力结合例如用抗原和抗体或生物素或抗生物素蛋白。非 共价结合是物质之间通过离子键或氢键或范德华力，和/或它们的疏水 性或亲水性特性进行结合。可替代地，结合可以是通过共价键、电子 对键或连接。用于共价结合（或交联）的多种方法和试剂是已知的并 且在适当修饰下可以用于将希望的物质结合到该肽或多肽上。

在此所述的肽或多肽可以在氨基端或羧基端亦或两者上进一步结 合到保护基团上。保护基团可以是选自下组，其组成为：乙酰基、酰 胺、3至20个碳的烷基、Fmoc、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、 9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基（Xan）、三苯甲基（Trt）、4-甲 基三苯甲基（Mtt）、4-甲氧基三苯甲基（Mint）、4-甲氧基-2,3,6-三甲 基-苯磺酰基（Mtr）、均三甲苯-2-磺酰基（Mts）、4,4-二甲氧基二苯甲 基（Mbh）、甲苯磺酰基（Tos）、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基（Pmc）、 4-甲苄基（MeBzl）、4-甲氧苄基（MeOBzl）、苄氧基（BzlO）、苄基（Bzl）、 苯甲酰基（Bz）、3-硝基-2-吡啶次磺酸基（Npys）、1-（4,4二甲基-2,6- 二氧亚环己基）乙基（Dde）、2,6-二氯苄基（2,6-DiCl-Bzl）、2-氯苄 基氧基羰基（2-Cl-Z）、2-溴苄氧基羰基（2-Br-Z）、苄氧基甲基（Bom）、 叔-丁氧基羰基（Boc）、环己氧基（cHxO）、叔-丁氧甲基（Bum）、叔- 丁氧基（tBuO）、叔-丁基（tBu）、丙基、丁基、戊基、己基、以及三 氟乙酰基（TFA）。

在此所述的这些肽或多肽可以进一步共价地结合到包括选自下组 的脂肪酸的磷脂上，其组成为：丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、 庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、月桂酰基、十三烷 酰基、肉豆蔻酰基、十五烷酰基、棕榈酰基、十七烷酰基、硬脂酰基、 十九烷酰基、花生酰基、二十一烷酰基、山嵛酰基、二十三烷酰基、 二十四烷酰基、肉豆蔻烯酰基（9-顺式）、反肉豆蔻烯酰基（9-反式）、 棕榈油酰基（9-顺式）、以及反棕榈油酰基（9-反式）。

可替代地或另外地，在此所述的肽或多肽可以与一种药学上可接 受的载体（或赋形剂）结合用来形成一种药用组合物。这类“载体”可 以进一步帮助将在此所述的多肽或肽递送和靶向到它们自身上亦或与 一个dat部分结合。这些药学上可接受的载体可以包括一种或多种生 理学可接受的化合物，它们起作用例如用来稳定该组合物或用来增加 或减少所希望的一种或多种活性剂的吸收。这些生理学可接受的化合 物可以包括例如碳水化合物类，例如葡萄糖、蔗糖、或葡聚糖，抗氧 化剂类，例如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂类，低分子量蛋白类，保 护和吸收增强剂类，例如脂类，减少活性剂的清除或水解的组合物类、 或赋形剂类、或其他稳定剂类和/或缓冲剂类。因此，在此所述的这些 dat部分和载体之间可能存在一些重叠。然而，总体上，在此所述的载 体旨在包括潜在实体的较大基团，它们可以与特异性地递送或靶向在 此所述的肽或多肽具有较小的或没有关系并且可以仅仅帮助稳定在此 所述的肽或多肽。

结合到在此所述肽或多肽上的官能团可以是一个生物学递送和靶 向部分。为了本发明的目的，生物递送和靶向部分是结合到特异性生 物物质或位点上的那些。作为该递送和靶向部分预期目标的生物物质 或位点可以帮助将在此所述的肽或多肽递送到感兴趣的组织或细胞 中。下面说明生物递送和靶向分子的实例。

配体可以通过选择性地结合或对另一种物质具有特异性亲和力作 为递送和靶向部分起作用。配体可以通过特异性结合体或结合配偶体， 或受体来识别和结合。除其他事项之外，适合于靶向的配体实例可以 是选自抗原类、半抗原类、生物素、生物素衍生物类、凝集素类、半 乳糖胺和岩藻糖胺部分类、受体类、底物类、辅酶类以及辅因子类。

另一种类型的递送和靶向部分是抗体，该抗体被定义为包括所有 类别的抗体，单克隆抗体、嵌合抗体、Fab部分、片段以及它们的衍 生物。其他递送和靶向部分可以包括酶类，尤其是细胞表面酶类例如 神经氨酸苷酶类、血浆蛋白类、抗生物素蛋白类、链亲和素类、抑素 类、有空腔有机化合物类、甲状腺球蛋白、内因、球蛋白类、螯合剂 类、表面活性剂类、有机金属物质类、葡萄球菌A蛋白、G蛋白、细 胞色素类、凝集素类、某些树脂类、以及有机共聚物类。

递送和靶向部分还可以包括不同物质例如任何蛋白类、蛋白片段 类或多肽类，它们对于被在此所述的肽或多肽（即包括SEQ ID NO:1 的分离的多肽，其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）抑 制活性）靶向的任何细胞或组织的表面具有亲和力。这些蛋白可以通 过本领域已知的重组DNA、遗传和分子工程技术来生产。具体使用的 可以是任何适当的膜转移蛋白以便有助于将在此所述的肽或多肽转移 到靶细胞内部（例如，如在此所述的PTD）。

这类递送和靶向部分可以有助于将在此所述的肽或多肽运送到细 胞内部。一个这样的实例是美国专利号6,204,054，它说明了转胞吞作 用运载体以及能够将生理活性剂运送横过包含GP60受体的上皮、内 皮以及间皮的增强子的用途。该GP60受体已经隐含在白蛋白横过细 胞屏蔽的受体介导的转胞吞作用中。美国专利号6,204,054开发了 GP60受体介导的转胞吞作用用于运送生理学活性剂，这些试剂在自然 情况下不通过GP60系统穿过上皮、内皮以及间皮。在此说明的肽或 多肽可以结合到白蛋白、白蛋白片段、抗GP60多克隆和单克隆抗体、 抗-GP60多克隆和单克隆抗体片段、以及GP60肽片段上用来促进转 运到细胞中。

结合到官能团上还可以改善在此所述的肽或多肽的其他性质。这 类官能团通常称为药物载体并且可以改善所携带药物的稳定性、溶解 度、或生物相容性。

例如，可以通过将在此所述的肽或多肽结合到一种肽聚合物上来 改善在此所述肽或多肽的溶解度。将这些多肽（包含谷氨酸和天冬氨 酸，或谷氨酸/丙氨酸，或谷氨酸/天冬酰胺，或谷氨酸/谷氨酰胺，或 谷氨酸/甘氨酸）用于结合到药物上用于作为载体起作用来改善这些药 物的溶解度和/或它们的体内疗效（美国专利号7,067,494）。类似地， 美国专利号5,087,616说明了一种或多种细胞毒性分子例如道诺霉素 结合到其上的生物可降解的聚合物载体的用途。该生物可降解的聚合 物载体被限定为是例如聚谷氨酸的一种均聚物。此外，美国专利号 4,960,790共价地结合到谷氨酸上。可替代地，美国专利号5,420,105 说明了能够结合一种药物或多种药物的多肽载体的用途。根据在此所 述的实施方案，该多肽载体可以进一步结合到一个靶向或递送部分上， 例如能够结合到体内的希望的靶位点上的一种抗体或配体（例如，美 国专利号5,420,105）。

类似地，美国专利号6,127,349说明了磷脂类用于改善肽溶解度以 及用于改善它们的生物利用率的用途。类似地，脂肪酸可以结合到在 此所述的肽或多肽上用来稳定这些抗血管形成物质的活性。美国专利 号6,380,253说明了抗血管形成物质（蛋白-抗血管形成素以及内皮生 长抑素等）结合到顺式不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸上用来增强和 稳定这些抗血管形成物质的活性。

其他适合的药物载体包括聚乙二醇（PEG）和相关的聚合物衍生 物。这类药物-PEG结合物已经被描述为在该结合物水解分解之前改善 了循环时间（延长了血清半衰期）并且随后释放结合的分子因而增加 了药物疗效。美国专利号6,214,966说明了PEG和相关聚合物衍生物 的用途，它们将该聚合物反应端附近弱的，水解地不稳定的连接结合 到药物上，例如蛋白类、酶类以及小分子类。

其他生理学可接受的化合物可以包括湿润剂类、乳化剂类、分散 剂类或对于防止微生物生长或活动特别有用的防腐剂类。不同的防腐 剂是熟知的并且包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域普通技术人员应当 理解的是药学上可接受的一种或多种载体（包括生理学可接受的化合 物）的选择依赖于例如一种或多种活性剂的给药途径以及依赖于该一 种或多种活性剂的具体物理化学性质。

赋形剂优选地是灭菌的并且通常不含有不希望的物质。这些组合 物可以通过常规的已知的灭菌和纯化技术来灭菌和纯化。

在治疗应用中，在此所述的组合物能够以足以治疗或至少部分防 止或延迟该疾病和/或它的并发症或足以帮助减轻与其相关症状的一 个数量施用到患有细胞毒性或刺激毒性应激相关疾病一种或多种症状 的受试者体内。足以完成这一项的数量被定义为“治疗有效剂量”或“治 疗有效数量”。对这种用途有效的数量将依赖于疾病的严重性以及受试 者健康的总体状况。可以施用这些组合物的单次或多次给药，这取决 于病人所需要和耐受的剂量和频率。组合物通常可以提供足够数量的 在此所述的活性肽或多肽用来在受试者体内进行有效地治疗（例如， 用来至少改善一种或多种症状）。

在此所述的肽或多肽的浓度可以广泛地改变，并且可以主要地根 据所选择的具体给药方式以及受试者的需要基于流体体积、粘度、体 重等进行选择。然而，典型地可以选择多种浓度用来提供范围从约0.1 或1mg/kg/天至约50mg/kg/天以及有时更高的剂量。典型的剂量范围 从约3mg/kg/天至约3.5mg/kg/天，优选从约3.5mg/kg/天至约7.2 mg/kg/天，更优选从约7.2mg/kg/天至约11.0mg/kg/天，并且最优选从 约11.0mg/kg/天至约15.0mg/kg/天。在某些优选实施方案中，剂量范 围从约10mg/kg/天至约50mg/kg/天。在某些实施方案中，剂量可以 范围从约20mg至约50mg，每日口服给药两次。应当理解的是可以 改变这类剂量以便优化一个具体受试者或一组受试者中的治疗方案。

在某些实施方案中，根据本领域普通技术人员熟知的标准方法在 此所述的肽或多肽可以口服地（例如，通过片剂）或作为注射剂给药。 在其他实施方案中，在此所述的肽或多肽还可以使用常规的经皮药物 递送系统（即经皮“贴剂”）通过皮肤来递送，其中该一种或多种活性 剂典型地包含在一个分层结构中，该分层结构用作附接到皮肤上的肽 或多肽递送装置。在这类结构中，该组合物典型地包含在一个层，或“容 器”中，在一个上部背衬层下面。应当理解的是在本发明上下文中术语 “容器”是指最终可用于递送到皮肤表面上的一定数量的“一种或多种 活性成分”。因此，例如，“容器”可以包括该贴剂的背衬层上粘合剂中 或本领域普通技术人员已知的多种不同基质配制品的任何一项中的一 种或多种活性成分。该贴剂可以包括一个单个容器，或它可以包括多 个容器。

用于局部药物递送的其他配制品可以包括但不限于软膏和乳膏。 软膏是半固体制剂，它们典型地是基于凡士林或其他石油衍生物。包 含选择的活性剂的乳膏典型地是粘性液体或半固体乳液，通常是水包 油亦或油包水。乳膏基质典型地是可水洗的，并且包含一种油相、一 种乳化剂以及一种水相。该油相（有时也称为“内”相）通常包括凡士 林以及一种脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇；该水相通常（虽然不必要） 在体积上超过油相，并且通常包含一种湿润剂。乳膏配制品中的乳化 剂通常地是一种非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。如本领 域普通技术人员应当理解的，有待使用的特异性软膏或乳膏基质是可 以提供最佳药物递送的那种。对于其他载体或运载体，软膏基质可以 是惰性的、稳定的、无刺激性的以及非致敏性的。

在此所述的肽或多肽可以口服给药。可以通过使用保护性赋形剂 来增强肽或多肽的递送。这典型地通过将该多肽与一种组合物复合从 而给予它对于酸性和酶水解抗性亦或通过将该多肽包装到适当的耐受 性载体中例如脂质体来实现。保护多肽用于口服递送的手段是本领域 熟知的。

通过使用持续释放的蛋白“包装”系统可以维持升高的血清半衰 期。这类持续释放系统是本领域普通技术人员熟知的。用于蛋白类和 肽类的ProLease^TM-生物可降解的微球递送系统是已知的（例如，Tracy (1998)《生物技术过程》（Biotechnol.Prog.）14:108；Johnson等人(1996), 《自然药物》（Nature Med.）2:795；Herbert等人(1998),《药学研究》 （Pharmaceut.Res.）15,357），其中干粉包括在聚合物基质中包含该蛋 白的生物可降解的聚合物微球，使用或不使用其他试剂可以将该基质 化合为一种干配制品。这种系统被特异性地设计成实现高蛋白封装效 率同时维持蛋白完整性。得到的粉末包含该肽或多肽的固体形式，该 肽或多肽被均匀地并且刚性地分散到多孔聚合物颗粒中。该过程中最 通常用的聚合物，聚丙交酯乙交酯共聚物（PLG）是生物相容性的并 且是生物可降解的。

封装可以在低温下（例如，-40°C）实现。在封装过程中，在缺少 水下可以将该肽或多肽维持在固态，因此将该肽或多肽的水诱导的构 象移动性降至最低，防止该肽或多肽降解反应（这些反应包括水作为 一种反应物），并且避免有机物-水界面（其中蛋白可能经历变性）。

在某些实施方案中，可以使这些肽或多肽结合一种或多种脂类来 施用。可以将这些脂类配制成一种赋形剂用来保护和/或增强该肽或多 肽的转运/吸收或可以将它们分开给药。

可以将这些脂类形成为封装在此所述肽或多肽的脂质体中，和/ 或可以使它们与肽或多肽化合/混合和/或可以使它们共价地结合到在 此所述的肽或多肽上。制造脂质体以及封装试剂的方法是本领域普通 技术人员熟知的（参见，例如，Martin和Papahadjopoulos(1982)《生 物化学期刊》（J.Biol.Chem.）,257:286-288；Papahadjopoulos等人 (1991)《美国国家科学院院刊》（Proc.Natl.Acad Sci.USA）,88: 11460-11464；Huang等人(1992)《癌症研究》（Cancer Res.）, 52:6774-6781；Lasic等人(1992)《FEBS通讯》（FEBS Lett.）,312: 255-258，等等）。

上述配制品和给药方法旨在是说明性的并且不是限制性的。应当 理解的是，使用在此提供的传授内容，可以容易地设计其他适当的配 制物和给药方法。

可以将另外的药理学活性试剂连同主要活性剂（例如在此所述的 肽或多肽）一起递送。可以将该肽或多肽结合到另一种药物活性剂上 用来通过递送具有类似或互补活性的一种第二化合物来增强在靶细胞 或组织上的疗效。在一个实施方案中，这类试剂包括但不限于降低中 风或局部缺血损伤和/或它们的并发症风险的试剂。这类试剂包括但不 限于抗凝剂类（例如，苊香豆醇、杀鼠萘、双香豆素、双香豆乙酯、 苯丙香豆素、苄丙酮香豆素、氯茚二酮、二苯茚酮、苯茚二酮、噻氯 香豆素、贝米肝素、舍托肝素、达肝素、依诺肝素、那曲肝素、帕肝 素、瑞肝素、亭扎肝素、磺达肝素、艾屈肝素、达那肝素、舒洛地特、 硫酸皮肤素、阿哌沙班、贝曲西班、依度沙班、奥米沙班、利伐沙班、 水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、阿加曲班、达比加群、美 拉加群、希美加群、REG1、去纤苷、雷马曲班、抗凝血酶III、以及 屈曲克凝α)、抗血小板药物（例如，阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、 氯吡格雷、普拉格雷、噻氯匹啶、替卡格雷、贝拉普罗、前列腺环素、 伊洛前列素、曲前列环素、乙酰水杨酸/阿司匹林、阿洛普令、卡巴匹 林钙、吲哚布芬、三氟柳、双嘧啶氨醇、吡考他胺、特鲁曲班、西洛 他唑、双嘧啶氨醇、三氟柳、氯克罗孟、地他唑）、以及溶栓和溶纤维蛋白药物（例如，组织纤溶酶原激活剂（tPA）或重组组织纤溶酶原激 活剂（rtPA）例如，阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、尿激酶、尿激 酶原、溶栓酶、阿尼普酶、孟替普酶、安克洛酶、纤溶酶、以及纤维 蛋白酶）、等等。

在此未直接定义的任何术语应当被理解为具有与它们在本发明领 域中通常所理解的相关联的含义。如贯穿本说明书使用的，下面术语， 除非另外说明，应当理解为具有下面含义。

如在此使用的，“肽”或“多肽”可以互换地使用，并且通常地是指 包括通过肽键或修饰的肽键共价连接的至少两个氨基酸残基的一种化 合物。然而，当具体地与短语“如在此所述”或“包括SEQ ID NO:1的 分离的多肽”一起使用时，它是指包括通过SEQ ID NO:1（即 KEIVSRNKRRYQED）表示的PTEN K13干扰肽的一种氨基酸序列， 其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）抑制活性。修饰的 肽键可以包括例如肽等排体（修饰的肽键），它们可以为该肽提供额外 希望的特性，例如增加的半衰期。该肽可以包括至少两个氨基酸。包 括在此所述肽或多肽的氨基酸还可以通过自然过程例如翻译后加工亦 或通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以发生在肽中任 何地方，包括肽主链，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。应当理解的 是相同类型的修饰能够以相同或不同程度存在于给定肽的几个位点 处。

如在此使用的“载体”是指用于将外源性或内源性多核苷酸引入到 宿主细胞中的多核苷酸化合物。载体包括一种核苷酸序列，它可以编 码一种或多种多肽分子。处于天然状态或已经经历重组工程化的质粒、 黏粒、病毒以及噬菌体是常用载体的非限制性实例用来提供包括至少 一种希望的分离的多核苷酸分子的重组载体。

在肽或蛋白的情况下，或在根据编码的肽或蛋白定义核酸的情况 下，对应包括与限定的肽或多肽或蛋白或其部分具有至少约80%一致 性，更优选至少约90%一致性，甚至更优选约95%并且最优选至少约 98-99%一致性的一种肽。

在此所述的实施方案包括一种分离的多肽，该多肽包括与SEQ ID  NO:1至少90%一致性，其条件是SEQ ID NO:1的位置8处或等效位 置处（相对于全长PTEN蛋白也称为K13-参见SEQ ID NO:7）的赖氨 酸（K）未被改变用来保留泛素化位点。

如在此使用的术语“一致性”是指测量两个肽之间或两个核酸分子 之间序列的一致性。可以通过比较每个序列中的一个位置来确定一致 性，出于比较的目的该位置可以是一个线。如果两个氨基酸或核酸序 列享有至少约85%序列一致性，或至少约86%序列一致性，或至少约 87%序列一致性，或至少约88%序列一致性，或至少约89%序列一致 性，或至少约90%序列一致性，它们被认为是基本上相同的。可替代 地，如果两个氨基酸或核酸序列享有至少约91%序列一致性，或至少 约92%序列一致性，或至少约93%序列一致性，或至少约94%序列一 致性，或至少约95%序列一致性，或至少约96%序列一致性，或至少 约97%序列一致性，或至少约98%序列一致性，或至少约99%序列一 致性，它们被认为是基本上相同的。

还可以通过目前使用的BLAST算法来确定序列一致性，该算法 最初在Altschul等人(1990)《分子生物学期刊》（J.Mol.Biol.） 215:403-410中进行说明。该BLAST算法可以与公开的默认设置一起 使用。当比较的序列中一个位置被相同碱基或氨基酸占据时，这些分 子被认为在该位置具有共享的一致性。序列之间的一致性程度是这些 序列共有的匹配位置数量以及这些序列之间重叠程度的函数。此外， 当考虑与SEQ ID NO:1的一致性程度时，预期的是等效的14个氨基 酸（例如，在位置8处赖氨酸（K）之前相应的7个氨基酸以及在位 置8处赖氨酸（K）之后的6个氨基酸与SEQ ID NO:1相比较）。当 确定与SEQ ID NO:1的一致性程度时，另外的序列（即除了相应于 SEQ ID NO:1的14个氨基酸的那些）未预期进行考虑。

此外，包括SEQ ID NO:1或包括与SEQ ID NO:1具有至少90% 一致性的14个氨基酸的序列的分离的多肽可以具有小于或等于59个 氨基酸。可替代地，该分离的多肽可以具有55个氨基酸，或该分离的 多肽可以具有54个氨基酸，或该分离的多肽可以具有53个氨基酸， 或该分离的多肽可以具有52个氨基酸，或该分离的多肽可以具有51 个氨基酸，或该分离的多肽可以具有50个氨基酸，或该分离的多肽可 以具有49个氨基酸，或该分离的多肽可以具有48个氨基酸，或该分 离的多肽可以具有47个氨基酸，或该分离的多肽可以具有46个氨基 酸，或该分离的多肽可以具有45个氨基酸，或该分离的多肽可以具有 44个氨基酸，或该分离的多肽可以具有43个氨基酸，或该分离的多 肽可以具有42个氨基酸，或该分离的多肽可以具有41个氨基酸，或 该分离的多肽可以具有40个氨基酸，或该分离的多肽可以具有39个 氨基酸，或该分离的多肽可以具有38个氨基酸，或该分离的多肽可以 具有37个氨基酸，或该分离的多肽可以具有36个氨基酸，或该分离 的多肽可以具有35个氨基酸，或该分离的多肽可以具有34个氨基酸， 或该分离的多肽可以具有33个氨基酸，或该分离的多肽可以具有32 个氨基酸，或该分离的多肽可以具有31个氨基酸，或该分离的多肽可 以具有30个氨基酸，或该分离的多肽可以具有29个氨基酸，或该分 离的多肽可以具有28个氨基酸，或该分离的多肽可以具有27个氨基 酸，或该分离的多肽可以具有26个氨基酸，或该分离的多肽可以具有 25个氨基酸，或该分离的多肽可以具有24个氨基酸，或该分离的多 肽可以具有23个氨基酸，或该分离的多肽可以具有22个氨基酸，或 该分离的多肽可以具有21个氨基酸，或该分离的多肽可以具有20个 氨基酸，或该分离的多肽可以具有19个氨基酸，或该分离的多肽可以 具有18个氨基酸，或该分离的多肽可以具有17个氨基酸，或该分离 的多肽可以具有16个氨基酸，或该分离的多肽可以具有15个氨基酸， 或该分离的多肽可以具有14个氨基酸，或该分离的多肽可以具有13 个氨基酸，或该分离的多肽可以具有12个氨基酸，或该分离的多肽可 以具有11个氨基酸，或该分离的多肽可以具有10个氨基酸。可替代 地，该分离的多肽可以具有10个至50个之间的氨基酸，或该分离的 多肽可以具有11个至50个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有 12个至50个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有13个至50个 之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至50个之间的氨基酸， 或该分离的多肽可以具有13个至45个之间的氨基酸，或该分离的多 肽可以具有13个至40个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有13 个至35个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有13个至30个之间 的氨基酸，或该分离的多肽可以具有13个至25个之间的氨基酸，或 该分离的多肽可以具有13个至20个之间的氨基酸，或该分离的多肽 可以具有14个至50个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14 个至35个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至30个之间 的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至29个之间的氨基酸，或 该分离的多肽可以具有14个至28个之间的氨基酸，或该分离的多肽 可以具有14个至27个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14 个至26个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至25个之间 的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至24个之间的氨基酸，或 该分离的多肽可以具有14个至23个之间的氨基酸，或该分离的多肽 可以具有14个至22个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14 个至21个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至20个之 间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至19个之间的氨基酸， 或该分离的多肽可以具有14个至18个之间的氨基酸，或该分离的多 肽可以具有14个至17个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14 个至16个之间的氨基酸，或该分离的多肽可以具有14个至15个之间 的氨基酸。

本领域普通技术人员应当理解的是在此所述的肽或多肽中单独氨 基酸的多个方面可以被替代。可以通过使用BLASTP和TBLASTN程 序（它们使用BLAST（基础局部比对检索工具）2.0算法）计算出氨 基酸序列一致性。用于计算氨基酸序列相似性或一致性的技术是本领 域普通技术人员熟知的，并且BLAST算法的用途在ALTSCHUL等人 1990,《分子生物学期刊》（J Mol.Biol.）215:403-410以及ALTSCHUL 等人(1997), 《核酸研究》（Nucleic Acids Res.）25:3389-3402中进行 说明。

此外，本领域普通技术人员应当理解的是某些取代更可能导致保 留活性。例如，可以将氨基酸描述为例如极性、非极性、酸性、碱性、 芳香族或中性。极性氨基酸是在生物的或接近中性pH下可以通过氢 键与水相互作用的氨基酸。氨基酸的极性是在生物的或接近中性pH 下氢键合程度的指示物。极性氨基酸的实例包括丝氨酸、脯氨酸、苏 氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、 天冬氨酸、酪氨酸以及谷氨酸。非极性氨基酸的实例包括甘氨酸、丙 氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、以及色氨 酸。酸性氨基酸在中性pH下具有净负电荷。酸性氨基酸的实例包括 天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸在中性pH下具有净正电荷。碱性氨 基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。芳香族氨基酸通常是非 极性的，并且可以参与疏水性相互作用。芳香族氨基酸的实例包括苯 丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。酪氨酸还可以通过芳香族侧链上的羟基 参与氢键合。中性、脂肪族氨基酸通常地是非极性的以及疏水性的。 中性氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及甲硫 氨酸。可以通过多于一种说明性种类对氨基酸进行说明。享有共同说 明性种类的氨基酸可以在肽中彼此取代。

用于说明这些肽或多肽的命名法可以遵循常规实践其中氨基显示 在左侧并且羧基在每个氨基酸残基的右侧。在表示选择的本发明特定 实施方案的序列中，除非另外说明，氨基和羧基末端基团（虽然未具 体显示）应当理解为是处于在生理pH值下它们应当采取的形式。根 据表1，在氨基酸结构式中，相应于氨基酸俗名，每个残基通常可以 通过一个字母或三个字母标识来表示。

表1通常在天然发生的肽中发现的20种标准L-氨基酸的命名法 和缩写。

    全名     三字母缩写     单字母缩写     丙氨酸     Ala     A     半胱氨酸     Cys     C     天冬氨酸     Asp     D     谷氨酸     Glu     E     苯丙氨酸     Phe     F     甘氨酸     Gly     G     组氨酸     His     H     异亮氨酸     Ile     I     赖氨酸     Lys     K     亮氨酸     Leu     L     甲硫氨酸     Met     M     天冬酰胺     Asp     N     脯氨酸     Pro     P     谷氨酰胺     Gln     Q     精氨酸     Arg     R

    丝氨酸     Ser     S     苏氨酸     Thr     T     缬氨酸     Val     V     色氨酸     Trp     W     酪氨酸     Tyr     T

氨基酸亲水性指数是指示一个氨基酸找出水性环境（负值）或疏 水性环境（正值）倾向的一个标度（KYTE & DOOLITTLE 1982.《分子 生物学期刊》(J Mol Biol ） 157:105-132）。标准氨基酸的亲水性指数包 括丙氨酸（1.8）、精氨酸（-4.5）、天冬酰胺（-3.5）、天冬氨酸（-3.5）、 半胱氨酸（2.5）、谷氨酰胺（-3.5）、谷氨酸（-3.5）、甘氨酸（-0.4）、 组氨酸（-3.2）、异亮氨酸（4.5）、亮氨酸（3.8）、赖氨酸（-3.9）、甲 硫氨酸（1.9）、苯丙氨酸（2.8）、脯氨酸（-1.6）、丝氨酸（-0.8）、苏 氨酸（-0.7）、色氨酸（-0.9）、酪氨酸（-1.3）、以及缬氨酸（4.2）。在 肽中具有类似亲水性指数的氨基酸可以彼此取代。

在此所述的肽或多肽中包含的氨基酸应当理解为是处于L-或D- 构型。在肽类和假肽类中，D-氨基酸可以取代L-氨基酸。这些肽或多 肽中包含的，并且特别地是在羧基端或氨基端的氨基酸可以通过甲基 化、酰胺化、乙酰化或用其他化学基团取代来修饰，这些化学基团可 以改变该肽的循环半衰期而对它们的生物活性没有不利影响。另外地， 在此所述的肽或多肽中可以存在或缺少二硫键。

非标准氨基酸可以出现在自然界中，并且可以或不可以被遗传地 编码。遗传地编码的非标准氨基酸的实例包括硒代半胱氨酸（有时在 UGA密码子处结合到一些蛋白中，该密码子正常地可以是一个终止密 码子），或焦赖氨酸（有时在UAG密码子处结合到一些蛋白中，该密 码子正常地可以是一个终止密码子）。不能遗传地编码的一些非标准氨 基酸可以从修饰已经结合到肽中的标准氨基酸得到，或例如可以是代 谢中间体或前体。非标准氨基酸的实例包括4-羟基脯氨酸、5-羟基赖 氨酸、6-N-甲基赖氨酸、γ-羧基谷氨酸、锁链素、硒代半胱氨酸、鸟 氨酸、瓜氨酸、羊毛硫氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸、肉 毒碱、肌氨酸、或N-甲酰基甲硫氨酸。标准的和非标准的氨基酸的合 成变异体也是已知的并且可以包括化学衍生的氨基酸、为了鉴别或跟 踪而标记的氨基酸、或在α碳上具有多种侧基的氨基酸。这类侧基的 实例是本领域已知的并且可以包括脂肪族、单个芳香族、多环芳香族、 杂环、异核、氨基、烷氨基、羧基、甲酰胺、羧基酯、胍、脒、羟基、 烷氧基、巯基、烷基巯基、或其他包含杂原子的侧链。其他合成的氨 基酸可以包括α-亚氨基酸、非α氨基酸例如β-氨基酸，脱羧基或脱氨基 酸。氨基酸的合成变异体可以使用本领域已知的一般性方法来合成， 或可以从商业供应商处购买，例如RSP氨基酸LLC^TM（Shirley,MA）。

如在此使用的“细胞毒性应激”是指包括一个宽范围的细胞应激， 包括响应于细胞环境中过多水平的细胞毒性氧化剂以及自由基的病理 学变化（例如，氧化应激）可以是免疫介导的，也可以包括刺激毒性 应激。

如在此使用的“刺激毒性应激”是失调（例如中风）以及其他神经 退行性疾病的一个重要组分。存在的证据是当刺激性神经递质谷氨酸 （谷氨酸受体）例如NMDA受体和AMPA受体被过度活化时，刺激 毒性应激的毒性作用可以通过导致细胞死亡的急性和延迟两种形式的 机理来起作用。兴奋毒素类例如NMDA以及结合到这些受体上的卡英 酸，以及病理学地高水平的谷氨酸，可以通过允许高水平的钙离子[2] （Ca2⁺）进入细胞中来引起刺激性毒性。Ca2⁺流入细胞中可以活化多 种酶，包括磷脂酶类、内切核酸酶类、以及蛋白酶类例如钙蛋白酶。 这些酶能够损坏细胞结构例如细胞骨架、细胞膜、以及DNA。刺激性 毒性可以涉及脊髓损伤、中风、创伤性脑损伤、以及中枢神经系统 （CNS）的神经退行性疾病例如多发性硬化症、阿耳茨海默病、肌萎 缩性侧索硬化（ALS）、帕金森病、酒精中毒或戒酒以及亨廷顿病。

如在此使用的“分离的”，是指包括已经基本上分离或纯化离开否 则它将与其结合（例如在体内）的其他组分（例如生物组分）的一种 物质（例如一种多核苷酸或多肽或肽），使得该分离的物质本身可以被 操纵或处理。因此术语“分离的”包括通过本领域已知的纯化方法纯化 的物质，以及通过在宿主体内重组表达制备的物质，以及化学合成的 物质。在一些实施方案中，当一种化合物与天然伴随它的组分分开时， 它是“分离的”，使得按重量计它是样品中总相关物质的至少60%，更 通常地75%或超过90%。因此，例如，化学合成或通过重组技术生产 的一种多肽可以是总体上基本不含有它的天然相关的组分。当多核苷 酸未直接邻近（即，共价地连接）它在从中得到本发明DNA的生物 体的天然发生的基因组中正常地邻近的编码序列时，它可以是基本上 纯的。例如一种分离的化合物可以通过从天然来源提取；通过表达对 多肽化合物进行编码的重组核酸分子；或通过化学合成而获得。可以 使用任何适当的方法例如柱层析法，凝胶电泳或HPLC来测量纯度。

术语“重组体”是指包括已经重组的事物，使得当参考核酸构建体 （例如，多核苷酸）制造时，该术语是指包括连接到一起或通过分子 生物学技术生产的核酸序列的一种分子。当参考蛋白或多肽或肽制造 时，术语“重组体”是指使用通过分子生物学技术产生的重组核酸构建 体表达的一种蛋白或多肽或肽分子。重组核酸构建体可以包括一种核 苷酸序列，该核苷酸序列被连接到，或被操纵以便连接到在自然状态 下它不连接到其上的、或在自然状态下它在不同位置处连接到其上的 一个核酸序列上。因此，重组核酸构建体指示该核酸分子已经使用基 因工程（即通过人为干预）进行操纵。例如可以通过转化将重组核酸 构建体引入到宿主细胞中。这类重组核酸构建体可以包括从相同宿主 细胞种类中或从不同宿主细胞种类中得到的序列，它们已经被分离并 且再引入到宿主种类的细胞中。由于宿主细胞的转化亦或由于随后的 重组事件，可以将重组核酸构建体序列整合到宿主细胞基因组中。

可以通过本领域已知的化学技术（例如通过使用溶液或固相合成 方法的自动合成）合成多肽或肽或肽类似物。自动化的肽合成仪是可 商购的并且使用本领域熟知的技术。多肽或肽以及肽类似物还可以使 用多种方法例如下面各项中说明的那些使用重组DNA技术来制备： 例如SAMBROOK J.和RUSSELL D.(2000)《分子克隆实验指南》 （Molecular Cloning:A Laboratory Manual）（第三版）（(Third Edition)） 冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory），冷泉港实验室出版社 （Cold Spring Harbor Laboratory Press），冷泉港（Cold Spring Harbor）， 纽约（N.Y.）或AUSUBEL等人《现代分子生物学实验技术》（Current  Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1994）。

如在此使用的“受试者”是指一种动物，例如一种鸟或一种哺乳动 物。具体的动物包括大鼠、小鼠、狗、猫、牛、绵羊、马、猪或灵长 类。受试者可以进一步是人类。受试者可以进一步是一种转基因动物。 受试者可以进一步是一种啮齿动物，例如一种小鼠或大鼠。

术语“NMDA”是指N-甲基-D-天冬氨酸，并且“NMDAR”是指一种 或多种NMDA受体。NMDAR是谷氨酸的一种亲离子型受体。NMDA 是NMDAR的一种选择特异性激动剂。NMDA受体的活化导致开放对 于阳离子是非选择性的一个离子通道。这允许Na⁺和少量的Ca2⁺离子 流入细胞中以及K⁺流出细胞。通过NMDAR的钙流被认为在突触可塑 性中（一种用于学习和记忆的细胞机理）起重要作用。NMDA受体形 成NR1和NR2亚基之间的一种异源二聚体。存在有多种NR1和NR2 亚型。NR1亚型是从不同交替剪接GRIN1（也称为 NMDAR1-EntrezGene ID:2902）而产生。NR2亚型是从四种基因产生 的-GRIN2A（NMDAR2A-EntrezGene ID:2903）、GRIN2B （NMDAR2B-EntrezGene ID:2904）、GRIN2C（NMDAR2C-EntrezGene  ID:2905）、以及GRIN2D（NMDAR2D-EntrezGene ID:2906）。NR3 A 和B亚基的相关基因家族对受体活性具有抑制作用。通过选择性剪接 NR1转录本以及差异性表达NR2亚基产生了具有不同脑分布和功能 特性的多种受体亚型。

术语‘PTEN’是指磷酸酶和张力蛋白同系物酶-这种蛋白的人类形 式是EntrezGene ID:5728的产物，并且它可以具有相应于GenPept登 录号：P60484.1的氨基酸序列组成。其他非人类同系物使用已知的方 法被容易地鉴别（例如BLAST搜索），并且被认为是在本发明的范围 内。PTEN蛋白作为磷酸酶起作用用来将磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸酯 （PtdIns(3,4,5)P3或PIP3）脱磷酸。PTEN特异性地催化PIP3中肌醇 环的3`磷酸的脱磷酸化作用，导致了磷酸氢盐产物PIP2 （PtdIns(4,5)P2）。这种脱磷酸化作用是重要的因为它导致了AKT信 号途径的抑制。

代表性的PTEN氨基酸序列示于下面表2中（AAC08699.1 GI:2197039），其中SEQ ID NO:1加下划线。

表2PTEN氨基酸序列（SEQ ID NO:7）

在此所述的肽或多肽中包含的氨基酸应当理解为是处于L-或D- 构型。D-氨基酸可以取代L-氨基酸。在此所述的这些肽或多肽中包含 的，并且特别地是在羧基端或氨基端的氨基酸可以通过甲基化、酰胺 化、乙酰化或用其他化学基团取代来修饰，这些化学基团可以改变该 肽或多肽的循环半衰期而对它们的生物活性没有不利影响。另外地， 可以存在或缺少二硫键。

非标准氨基酸可以出现在自然界中，并且可以或不可以被遗传地 编码。遗传地编码的非标准氨基酸的实例包括硒代半胱氨酸（有时在 UGA密码子处结合到一些蛋白中，该密码子正常地可以是一个终止密 码子），或焦赖氨酸（有时在UAG密码子处结合到一些蛋白中，该密 码子正常地可以是一个终止密码子）。不能遗传地编码的一些非标准氨 基酸可以从修饰已经结合到肽中的标准氨基酸得到，或例如可以是代 谢中间体或前体。非标准氨基酸的实例包括4-羟基脯氨酸、5-羟基赖 氨酸、6-N-甲基赖氨酸、γ-羧基谷氨酸、锁链素、硒代半胱氨酸、鸟 氨酸、瓜氨酸、羊毛硫氨酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、γ-氨基丁酸、肉 毒碱、肌氨酸、或N-甲酰基甲硫氨酸。标准的和非标准的氨基酸的合 成变异体也是已知的并且可以包括化学衍生的氨基酸、为了鉴别或跟 踪而标记的氨基酸、或在α碳上具有多种侧基的氨基酸。这类侧基的 实例是本领域已知的并且可以包括脂肪族、单个芳香族、多环芳香族、 杂环、异核、氨基、烷氨基、羧基、甲酰胺、羧基酯、胍、脒、羟基、 烷氧基、巯基、烷基巯基、或其他包含杂原子的侧链。其他合成的氨 基酸可以包括β-亚氨基酸、非θ氨基酸例如θ-氨基酸，脱羧基或脱氨 基酸。氨基酸的合成变异体可以使用本领域已知的一般性方法来合成， 或可以从商业供应商处购买，例如RSP氨基酸LLC（Shirley，MA）。

如在此使用的术语“药物”是指可以施用到受试者体内并且能够在 受试者体内产生作用的一种组合物。该作用可以是化学的、生物的或 物理的，并且受试者可以是人类，或非人类动物，例如啮齿动物或转 基因小鼠，或狗、猫、牛、绵羊、马、仓鼠、豚鼠、兔或猪。该药物 可以单独地或与一种药学上可接受的赋形剂结合地包括在此所述的肽 或多肽。

如在此使用的术语“抗体”是指响应于外源物质（抗原）产生的免 疫系统蛋白，也称为免疫球蛋白。抗体典型的包含两个重链以及两个 轻链，这些链被连接。这些链结构上的可变性提供了抗原特异性（即 允许单个抗体识别特异性抗原）。术语抗体可以包括多克隆和单克隆抗 体、嵌合的、单链、或人源化抗体，以及Fab或F(ab)2片段，包括Fab 或其他免疫球蛋白表达文库的产物。制造这类抗体或片段的方法是本 领域已知的并且可以在例如HARLOW，E和LANE D.《抗体实验指南》 （Antibodies:A Laboratory Manual.）1988。冷泉港实验室出版社（Cold  Spring Harbor Laboratory Press）中找到。根据本发明一些实施方案的 抗体还可以是细胞内的抗体，有时称为细胞内抗体（intrabody）。用于 设计，制造和/或使用这类抗体的方法已经在本领域中进行说明，例如 （Lecerf等人2001；Hudson和Souriau 2003）。选择或鉴别特异性肽 类用作表位来生产蛋白、或蛋白亚型之间进行区别的抗体可以使用序 列比较来完成-本领域普通技术人员能够鉴别可以用于生产具有希望 选择性的抗体的适当肽或蛋白序列。多克隆抗体是从不同B细胞系得 到的抗体。在某些实施方案中，提供了对抗一种多肽而产生或结合到 其上的抗体，该多肽具有基本上类似于SEQ ID NO:1的氨基酸组成。

PTEN在神经元中以及在神经病症或疾病中的作用

在此披露了神经元细胞中PTEN的以前未知的多个方面，并且因 此提供了新型组合物以及用于预防和/或治疗数种神经病症或疾病的 方法。PTEN被报道在癌症方面具有作用。在这些研究中，定位在氨 基酸序列位置13和289处的两个赖氨酸残基（K13和K289）已经被 鉴定为泛素化位点，它们在蛋白质的核转位中起作用。已经证明这两 个位点之一的突变足以引起PTEN的核转位的高度显著的减少。至今， 对于神经元细胞中PTEN核转位中泛素化的作用还没有进行研究。如 在此说明的，与前面研究的细胞类型相比较，在这类神经元细胞中神 经元细胞中PTEN的转位中泛素化的作用是不同的。

如在此显示的，NMDA受体（NMDAR）的活化增强了培养的神 经元中PTEN的核转位，并且降低了核PIP3（它是核PTEN的底物） 的水平。PTEN的磷酸酶活性显示对于基于NMDA的刺激性毒性是显 著的—敲除这种磷酸酶活性改善了用NMDA处理之后细胞的存活。当 在K13亦或K289位点处阻断泛素化作用时，发现的是通过突变亦或 使用干扰肽仅阻断K13位点引起PTEN的核转位的降低以及神经元细 胞存活的改善。这个结果是意想不到的并且与文献不同，其中传授的 是K13亦或K289泛素化位点的破坏足以防止PTEN的核转位。使用 公认的局部缺血中风模型施用到大鼠体内的K13干扰肽证明显著地改 善了中风后效应，包括减少梗死体积，提高葡萄糖代谢活性，以及提 高长期运动恢复。

在本发明的某些方面中，提供了具有基本上类似于SEQ ID NO:1 （KEIVSRNKRRYQED）或SEQ ID NO: 2 （KEIVSRNKRRYQED-YGRKKRRQRRR）的氨基酸构成的一种多肽 组合物。

下面实例是出于说明性目的来提供的，并且不旨在以此状态进行 限制。

方法

皮层神经元的原代培养

如前面说明的（Mielke和Wang 2005）从18日龄斯普拉格-道利 大鼠胚胎中制备大鼠皮层或海马神经元的分离的培养物。为了得到富 集神经元的混合培养物，在体外3天（DIV）将尿苷（10μM）和5- 氟-2′-脱氧尿苷（10μM）添加到培养基中并且维持48小时用来在将培 养物返回到正常培养基中之前抑制非神经元细胞增殖。将成熟的神经 元（12-14 DIV）用于实验。

实验性体外刺激性毒性损伤

为了诱导刺激性毒性，将12-14 DIV培养的神经元清洗并且转移 到包含下面各项（in mM）的无Mg2+的细胞外溶液（ECS）：25 HEPES 酸、140 NaCl、33葡萄糖、5.4 KCl、以及1.3 CaCl₂，具有pH 7.35以 及摩尔渗透压浓度320-330 mOsm。使ECS经受NMDA-诱导的刺激性 毒性（在室温下20μM NMDA、10μM甘氨酸、60min）或如正文中 说明的任何其他实验条件。然后用正常ECS将细胞洗涤两次，并且返 回到最初生长条件直至另外的测定。

核提取物分离

如制造商的推荐使用Panomics^TM核提取试剂盒（Panomics^TM；目 录号AY2002）从对照以及NMDA-处理的细胞培养物（108个细胞） 中分离核提取物。

蛋白质印迹

对于蛋白质印迹，将来自各处理条件的10μg核提取物或40μg 全细胞溶解产物（通过1%SDS、1mM EGTA、1mM EDTA、1mM DTT、 2mM原钒酸钠、以及处于PBS中的蛋白酶抑制剂混合物来溶解）用 SDS-PAGE来分离，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）薄膜上，并且用相 关抗体进行探查。对于连续反复探查相同印迹，将薄膜用最初的一抗 和二抗来切条，并且用另一种靶抗体进行免疫印迹。使用增强的化学 发光检测（Amersham^TM）将印迹显影。使用NIH ImageJ^TM软件对条带 强度进行定量并且针对每个样品泳道中核标志物或β-微管蛋白的数量 进行归一化。

神经元死亡的评估

用Cyto Tox^TM 96检测试剂盒（Promega^TM,Madison,WI）处理之 后20小时通过测量乳酸脱氢酶（LDH）释放对坏死性神经元死亡进行 定量。使用分光光度法酶标板对吸光度读数进行测量。通过将用赫斯 特-33342^TM染色的神经元的细胞核缩合以及碎裂显影来确定凋亡性神 经元死亡。用莱卡DMIRE2^TM荧光显微镜拍摄图像。具有缩合的或碎 片化的染色质的细胞被认为是细胞凋亡。这些观察通过在每个视场中 对凋亡的以及总神经元进行双盲计数来定量并且表达为百分比凋亡。 根据制造厂商的说明书进行数据分析。数据表达为凋亡相对于对照的 差别并且表达为百分比。

体内局部缺血/再灌注脑模型以及PTEN肽注射

成年雄性斯普拉-道来大鼠（重200g）用于这项研究中。根据机 构的指导使用灭菌/无菌技术来进行所有手术操作。使用水合氯醛（0.4 g/kg IP）将大鼠麻醉并且经受脑缺血。通过前面说明的方法（Shyu等 人2005）实现右大脑中动脉（MCA）和双侧颈总动脉（CCA）的结扎。 用非损伤性动脉夹夹住CCA。用l0-0尼龙缝线结扎右侧MCA。局部 缺血90分钟之后，将MCA上的缝线以及CCA上的动脉夹移开以便 允许再灌注。使用热敏电阻探针（Hewlett-Packard^TM 21090A型号探针， Hewlett-Packard Company^TM，安多佛市，马萨诸塞州）对核心体温进 行监测，并且在麻醉期间用加热垫维持在37°C。在从麻醉中恢复之后， 使用热灯将大鼠体温维持在37°C。将实验大鼠再分成在MCA结扎后 2或6小时以8.4mg/kg的剂量通过股静脉接受不同类型干扰肽持续连 续三天的五个组，所有这些肽都融合到TAT蛋白转导结构域上 （PTEN-K13（SEQ ID NO:2）2小时或6小时，PTEN-K13R（SEQ ID  NO:3），PTEN-K289（SEQ ID NO:4），以及运载体对照）。

神经行为测量

在中风后第28天对行为评估进行测量。这些测量包括(a)身体 不对称性以及(b)自发活动性（Shyu等人2004）以及如前面说明的 带有变更的握力（Shyu等人2004）。对基线测试计分进行记录用于将 在脑缺血之后取得的那些归一化。通过前面说明的方法（Shyu等人 2004）实现右大脑中动脉（MCA）和双侧颈总动脉（CCA）的结扎并 且如前面说明的（Shyu等人2004）进行定量地评估。最初地，通过用 它们的尾部悬挂它们的身体针对侧向移动对动物进行检查。在二十次 连续试验中对初始头部摆动对侧至局部缺血侧的频率进行计数，并且 如下进行归一化：%恢复=[1-(二十次试验中侧向摆动-10)/10× 100%。自发活动性：使大鼠经受VersaMax动物活性^TM监测（Accuscan  Instruments^TM）持续约2小时用于行为记录。该VersaMax动物活性^TM监测包含间隔开87cm的16个水平的以及8个垂直的红外传感器。垂 直传感器位于离开该室顶部10cm。运动活动被计数为该室中通过大 鼠移动破坏的柱的数量。定义在制造厂商菜单选项中的三个垂直参数 是在夜间在2小时内计算的：(i)垂直活动，(ii)垂直时间，以及(iii) 垂直移动的数量。使用Grip Strength Meter^TM（TSE-Systems^TM）对握 力进行分析；在每个前肢上分别测量出握力增加的百分比并且计算为 来自侧向对侧至局部缺血的20次拉伸的平均强度与工作侧之间的比 率（Shyu等人2004）。另外，还计算出治疗后握力与基线的比率并且 这些改变表示为基线值的百分比。

使用磁共振成像（MRI）测量梗死尺寸

在3.0T下在一个成像系统（R4，GE^TM）中在麻醉下在大鼠上进 行MRI。在6至8个头部图像切片中对脑部进行扫描，每个2mm厚 无任何间隙。通过使用旋转回声技术（重复时间，4000ms；回声时间， 105ms）得到T2-加权成像（T2WI）脉冲序列并且针对每个动物在脑 缺血后第7天连续地进行捕获。为了测量右侧皮层中的梗死区，我们 将右侧皮层中未梗死的区从左半球总皮层区中减去（Shyu等人004）。 一个切片一个切片地手动地绘出梗死区，并且然后通过内部体积分析 软件（Voxtool^TM,General Electric^TM）计算出该体积。

[18F]氟-2-脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影（FDG-PET）检查

为了评估脑组织的代谢活性和突触密度，使用[18F]氟-2-脱氧葡 萄糖（FDG）的微PET^TM扫描对实验大鼠进行检查用来测量在前面说 明的实验方案下（Matsumura等人2003）相对代谢活性。简言之，18F 是在台湾的中国医药大学及医院的回旋加速器中通过18O(p,n)18F核 反应生产的，并且18F-FDG是如前面说明的（Hamacher等人1986） 用自动化18F-FDG合成系统（Nihon Kokan^TM）合成的。用高分辨率 小动物PET（微PET^TM，啮齿动物R4^TM，Concorde微系统^TM）扫描仪 来收集数据。系统参数已经在前面由Carmichael等人（Carmichael等 人2004）说明。在每次处理一周之后，将动物用水合氯醛（0.4g/kg， ip）来麻醉，固定在定制的定向性头部支架中，并且定位在微PET扫 描仪中。然后，给予这些动物静脉弹丸注射溶于0.5mL盐水中的 18F-FDG（200-250μCi/大鼠）。使用3-D采集实验方案同时开始数据 采集并且连续60分钟。通过交互数据语言^TM（IDL）版本5.5（研究 系统^TM）以及ASIPro^TM版本3.2（Concorde Microsystems^TM）软件显示 和分析从微PET获得的图像数据。使用基于后部的3维迭代算法 （Kornblum等人2000）重构FDG-PET图像并且重叠在MR模板上用 来证实解剖学位置（Brownell等人1998）。如通过视觉检查未损伤侧 所估计的，用于纹状体和皮层测量的冠状缝切面表示离开前囟从0至 +1mm的脑部区域，并且丘脑测量表示离开前囟从-2至-3mm脑部区 域。如前面说明的（带有变更）（Carmichael等人2004），纹状体的感 兴趣的区域（ROI）中相对代谢活性表达为百分比缺陷。

统计分析

本研究中所有测量都是在盲态下进行的。结果表达为平均值 +SEM。对行为记分进行评估用于归一化。使用学生t检验来评估运载 体-对照与处理组之间平均值差异。通过无参数的ANOVA （Kruskal-Wallis检验）对缺少正态分布的数据进行分析。P<0.05的 数值被认为是显著的。

iPS方法

在体外人iPS细胞分化成NPC（iPS-NPC）：

使用多级分化实验方案（带有一些变更）（Kumagai G等人PLoS  ONE(2009)4(11):e7706）将来自京都大学以及日本RIKEN生物来源 中心细胞库的iPS-MEF-Ng-20D-17（Okita K.等人《自然》（Nature）(2007) 448(7151):313-17）引入到iPS-NPC中。简言之，将在辐照的饲养细胞 上展开的MEF人类iPS细胞传代，并且然后转移到非粘附性培养皿中， 在那里它们易于形成球状胚状体（EB）。可以从处于DMEM-F12、N2 添加物（1%；Invitrogen）、以及20ng/mL FGF-2（R&D Systems^TM， 德国）的培养基中的EB中分离并且繁殖神经上皮样细胞的多个簇。 这些细胞显示典型的神经祖细胞（NPC）形态并且均匀地表达神经干 细胞标志物蛋白GFAP（1:200，Chemicon^TM）、巢蛋白（1:300， Chemicon^TM）、以及Tuj-1（1:500，Chemicon^TM）。

iPS-NPC的脑内移植

在移植之前，如前面说明的（Shyu WC等人《临床研究期刊》（J Clin  Invest）(2008)118(1):133-148）在37°C下使用1μg/mL双苯酰亚胺（赫 斯特^TM 33342；西格玛^TM）将iPS-NPS标记1小时。然后将标记的细 胞收集起来并且在PBS中洗涤三次。使用细胞计数器对iPS-NPC进行 计数用来确保足够细胞数量用于移植。脑缺血后一周，使用水合氯醛 （0.4g/kg，ip）将成年雄性斯普拉-道来大鼠（体重>300g）麻醉并 且通过26号哈密顿注射器用约3-5μL PBS悬浮液中1×10⁶个细胞脑 功能区定位地注射到右侧MCA附近3个皮层区中，硬膜下3.0至5.0 mm。对照动物仅施用PBS。这些位点的近似坐标是前囟前面1.0至2.0 mm，以及中线侧向3.5至4.0mm，前囟后面0.5至1.5mm以及中线 侧向4.0至4.5mm，以及前囟后面3.0至4.0mm以及中线侧向4.5至 5.0mm。在每次注射之后将针保持就位持续5分钟并且将一片骨蜡应 用到颅骨缺损处用力防止注射溶液的泄漏。

肽治疗：

在移植之后，给予iPS-NPC植入组之一每日一次通过股静脉静脉 注射PTENK13（8.4mg/kg）或盐水持续7天。从脑缺血后的那天开始 每日给予每个实验大鼠FK506注射剂的免疫抑制剂（2μg/g i.p., Prograf^TM,Fujisawa Healthcare^TM）。

ALS小鼠方法

大约8月龄的并且具有不明显病理学症状的表达G3 7R SOD1的 转基因小鼠（G37R）用指定的代码进行双盲并且分成12只小鼠的三 个组（6只雄性和6只雌性），这些小鼠在12小时光周期下在局部动 物设施中维持在纯C57BL6背景上，随意进食和饮水。通过PCR对所 有小鼠进行基因分型。如本研究中说明的动物的使用是根据加拿大动 物关爱委员会实验动物关爱和使用的指导来执行的。将两种肽，K13 的活性的PTEN肽以及K突变成R的对照肽以16mg/kg的剂量一周 （K13K-R）腹膜内注射3次。

定期地监测并且记录体重以及神经得分例如HLR得分和旋转杆 功能。当在该侧上移动时当小鼠在20s内不能站起时确定终点和存活 日期。根据英国哥伦比亚大学实验动物关爱和使用的指导将残疾的小 鼠麻醉并且处死。使用Kaplan-Meier曲线以及时序检验对所有收集的 数据进行统计分析。

实例1-NMDAR活化增强了PTEN核转位

LDH测定和核染色两者的结果显示NMDA处理（20uM，1小时） 在培养的海马神经元中引起显著的细胞死亡（图1a和1b）。NMDAR 活化增强了培养的神经元中PTEN核转位，通过内源性PTEN的免疫 印迹以及亚细胞部分的蛋白质印迹两者来确定。针对对应的亚细胞标 志物蛋白通过探查每个部分来证实不同细胞部分的纯度（图1c-e）。 NMDA处理降低了核PIP3的水平，PIP3是核PTEN的底物（图1f）。 PTEN的两个突变体过表达于培养的海马神经元中。一个是磷酸酶死 亡突变体PTENC124S-GFP，并且另一个是野生型PTEN-GFP，同时它 们两者都与核定位信号（NLS）相融合。PTENC 124S-GFP组中显著地 较低的死亡率（图1g和1h）证明核PTEN的磷酸酶活性在NMDAR 介导的激发毒性中是极其重要的。

实例2-用干扰肽-K13阻断PTEN核转位拯救了NMDAR介导的 刺激性毒性。

基于细胞系（PC3和298T）研究的前面研究显示两个赖氨酸残基 K13和K289是PTEN上的主要的单泛素化位点并且对于PTEN核输 入是重要的。然而，神经元PTEN是否采用相同机理尚未知晓。因此， 对应地构建两个PTEN突变体，PTENK13R-GFP和PTENK289R-GFP， 并且转染到培养的海马神经元中。结果显示PTENK13R-GFP突变体显 示主要地细胞质定位，而PTENK289R-GFP突变体和野生型PTEN-GFP 两者显示在细胞质和核区室之间平均分布。因此我们得出结论，与 K289位点相比较，K13位点对于神经元中PTEN核转位有可能更重要 （图2a和2b）。合成对应地位于K13和K289位点侧翼的两个肽，并 且融合到一个TAT蛋白转导结构域上，其中肽-K289（SEQ ID NO:4） 作为肽-K13（SEQ ID NO:1）的对照起作用。内源性PTEN免疫染色 的结果显示肽-K13（10uM）（它阻断了PTEN单泛素化作用）阻止了 PTEN核转位，而肽-K289（10uM）则不能（图2c和2d）。来自培养 的神经元的核部分的蛋白质印迹结果显示肽-K13（它阻断了PTEN单 泛素化作用）阻止了PTEN核转位，而肽-K289则不能（图2e和2f）。 肽-K13（它阻断了PTEN核转位）显著地防止了NMDAR介导的细胞 死亡（通过细胞核染色和LDH测定两者来确定）（图2g和2h）。

实例3-在脑缺血之后施用PTEN肽减少了梗死体积（MRI）并且 改善了葡萄糖代谢活性（FDG-PET）

为了选择PTEN肽的最有效治疗，将用不同类型的肽治疗（静脉 注射8.4mg/kg）的斯普拉-道来大鼠（约200g）分成5组，(1)局部 缺血发生后2小时给予肽-K13（SEQ ID NO:2），(2)局部缺血发生之 后6小时给予肽-K13，(3)局部缺血发生之后2小时给予肽-K13R(SEQ  ID NO:3），(4)局部缺血发生之后2小时给予肽-K289（SEQ ID NO: 4），以及(5)局部缺血发生之后2小时给予盐水。每组n=10。在脑 缺血之后第七天（图3a），与其他组相比较，在肽-K13-治疗的大鼠体 内（2小时和6小时组）通过MRI评估的梗死体积显著地减少。为了 证实静脉PTEN肽给药是否能够增强代谢活性，治疗后一周通过 FDG-PET对皮层葡萄糖代谢作用进行检查。微PET图像（图3b）显 示在肽-K13-治疗组（2小时和6小时）的右侧皮质上FDG摄入显著 增加，它显著地好于肽-K13R-、肽-K289-以及盐水-治疗的大鼠中的情 况。

实例4-在脑缺血之后静脉内注射PTEN干扰肽改善了移动行为性 能。

在肽-K13-（2小时和6小时）、肽-K13R-（2小时）、肽-K289-（2 小时）以及盐水-（2小时）治疗的大鼠（n=10/组）中使用身体不对 称性、自发活动测试以及握力测量对神经缺陷恢复进行评估。与用肽 -K13R、或肽-K289、或盐水处理的大鼠相比较，在身体摆动试验中肽 -K13-治疗的大鼠（2小时和6小时）显示多得多的恢复（图4a）。与 其他组相比较，在接收肽-K13治疗（2小时和6小时）的大鼠体内在 脑缺血之后自发活动性（包括在垂直活动性、垂直时间、以及垂直移 动数量方面的测量）是显著地更好的（图4b-d）。另外，比较局部缺 血之前和局部缺血后28天前肢握力，肽-K13-治疗组（2小时和6小 时）具有比所有其他组好得多的强度比率（图4e）。

实例5-PTEN肽以剂量依赖方式减少了梗死体积

以不同的静脉注射剂量施用TAT-PTEN-K13（SEQ ID NO:2）是 将下面各项施用给斯普拉-道来大鼠（约200g-8/组）的四个组（局部 缺血发生后6小时给予）：(1)10mg/kg(2)1.0mg/kg(3)0.1mg/kg(4) 盐水（对照）。图5显示了与对照相比较使用10mg/kg和1.0mg/kg梗 死体积减少大于50%。

表3

治疗组中平均值的差别大于随机预期；具有统计显著差异（P=< 0.001）。用α=0.050:1.000对完成的检验乘方。全配对多重比较步骤 （Holm-Sidak方法）:全部显著性水平=0.05.

实例6-在ALS的转基因动物模型中Tat-K13 PTEN肽改善了性别 依赖性存活率并且改善了行为结果。

Tat-K13 PTEN肽延长了存活期并且改善了雌性ALS小鼠的行为 结果。图6A显示了与突变的Tat-K13_K-R PTEN以及盐水对照相比较， 给予Tat-K13 PTEN肽的雌性小鼠中统计显著地增加。然而，在雄性小 鼠中，使用Tat-K13 PTEN肽未见到统计显著改善（参见图6B）。在疾 病的多种动物模型中观察到性别特异性作用。

实例7-Tat-K13促进了大鼠局部脑缺血之后脑内地移植到梗死区 中iPS-NPC的存活。

当在移植之前给到接受动物体内或在它们移植之前与干细胞一起 孵化时，分离的多肽Tat-K13增加了移植到脑中干细胞的存活。临床 使用干细胞移植的最大挑战之一是移植细胞的低存活率。

干细胞移植被认为是用于治疗各种神经退行性失调的一种吸引人 的细胞替代疗法。然而，实验结果证明仅有非常小部分的移植的干细 胞能够存活以移植持续移植后一周（Gojo S,《实验细胞研究》（Exp  Cell Res）2003;288:51-9；Müller-Ehmsen J,《分子细胞心脏病学期刊》 （J Mol Cell Cardiol）(2006)41:876-84）。如图7中证明的，在移植之 后通过全身使用Tat-K13阻断PTEN核转位显著地增加了移植到经受 中风的大鼠局部缺血区中（如上说明的通过单侧结扎MAO产生的局 部脑缺血）的移植的人诱导的多能干细胞衍生的神经祖细胞 （iPS-NPC）的存活率。在移植之后7天完成的凋亡标志物TUNEL的 免疫荧光共区域化证明与盐处理的大鼠（iPS-NPC）相比较，Tat-K13 治疗的大鼠（iPS-NPCs+PTENK13）含有显著地更少的TUNEL阳性移 植的iPS-NPSc（n=每组6只）。这些结果强烈地表明PTENK13具有 干细胞存活促进活性，由此具有重要的治疗应用用于促进干细胞替代 治疗来治疗多种神经退行性障碍，例如范围是中风、亨廷顿病、ALS、 帕金森病以及非神经元退行性疾病。

虽然在此披露了本发明的多种实施方案，根据本领域普通技术人 员共同的一般性知识在本发明的范围内可以做出许多适应和变更。这 类变更包括用已知的等效物取代本发明的任何方面用来以基本上相同 途径实现相同结果。数值范围包括定义该范围的数字。短语“包含”在 此用作开放端术语，基本上等效于词语“包括，但不限于”，并且短语“包 含了”具有对应含义。如在此使用的，除非上下文另外明确指出，否则 单数形式的“一”、“一个”以及“该”包括复数指示物。因此，例如提及“一 个事物”包括多于一个这样的事物。在此引用参考文件不是承认这类参 考文件是本发明的在先技术。本申请书中引用的任何一种或多种在先 文件以及全部出版物，包括但不限于专利以及专利申请，通过引用结 合在此其程度如同每个单独的出版物被明确地并且单独地指明通过引 用结合在此并且其程度如同完全在此提出。本发明包括基本上如在此 之前所述的所有实施方案以及变体并且参考实例和附图。另外，在此 引用参考文件不是承认这类参考文件是本发明的在先技术，它也不构 成对于这些文件的内容或日期的任何承认。

非正式序列表

SEQ ID NO:1

说明-PTEN K13干扰肽（加下划线的14个氨基酸）、蛋白转导结 构域以及在位置8氨基酸处（它相应于SEQ ID NO:7的位置13）K13 泛素化位点。

KEIVSRNKRRYQED

SEQ ID NO:2

说明-结合到TAT蛋白转导结构域(aa 15-25）上的PTEN K13干 扰肽（加下划线的aa 1-14）。K13残基是该序列中第八个氨基酸。

KEIVSRNKRRYQED-YGRKKRRQRRR

SEQ ID NO:3

说明-PTEN K13R干扰肽（加下划线的aa 1-14），其中K13泛素 化位点（第八个氨基酸）被修饰成精氨酸（R）残基并且结合到TAT 蛋白转导结构域（aa 15-25）上。

KEIVSRNRRRYQED-YGRKKRRQRRR

SEQ ID NO:4

说明-融合到PTEN K289干扰肽（加下划线的aa 12-23）上的TAT 蛋白转导结构域（aa 11）。K289残基是该序列中第18个氨基酸。

YGRKKRRQRRR-PEETSEKVENGS

SEQ ID NO:5

KEIVSRNKRRYQED-dat部分

SEQ ID NO:6

dat部分-KEIVSRNKRRYQED

dat部分=递送和靶向部分

SEQ ID NO:7

MTAIIKEIVSRNKRRYQEDGFDLDLTYIYPNIIAMGFPAERLEGV YRNNIDDVVRFLDSKHKNHYKIYNLCAERHYDTAKFNCRVAQYPF EDHNPPQLELIKPFCEDLDQWLSEDDNHVAAIHCKAGKGRTGVMIC AYLLHRGKFLKAQEALDFYGEVRTRDKKGVTIPSQRRYVYYYSYL LKNHLDYRPVALLFHKMMFETIPMFSGGTCNPQFVVCQLKVKIYSS NSGPTRREDKFMYFEFPQPLPVCGDIKVEFFHKQNKMLKKDKMFH FWVNTFFIPGPEETSEKVENGSLCDQEIDSICSIERADNDKEYLVLTL TKNDLDKANKDKANRYFSPNFKVKLYFTKTVEEPSNPEASSSTSVT PDVSDNEPDHYRYSDTTD SDPENEPFDEDQHTQITKV

参考文献：

Baker,S.J.(2007)."PTEN enters the nuclear age."Cell 128(1):25-8.

Brownell,A.L.,E.Livni,et al.(1998)."In vivo PET imaging in rat  of dopamine terminals reveals functional neural transplants."Ann Neurol43(3):387-90.

Carmichael,S.T.,K.Tatsukawa,et al.(2004)."Evolution of  diaschisis in a focal stroke model."Stroke 35(3):758-63.

Hamacher,K.,H.H.Coenen,et al.(1986)."Efficient stereospecific  synthesis of no-carrier-added 2-[18F]-fluoro-2-deoxy-D-glucose using  aminopolyether supported nucleophilic substitution."J Nucl Med 27(2): 235-8.

Hudson,P.J.and C.Souriau (2003)."Engineered antibodies."_Nat  Med 9(1):129-34.

Kornblum,H.I.,D.M.Araujo,et al.(2000)."In vivo imaging of  neuronal activation and plasticity in the rat brain by high resolution  positron emission tomography(microPET)."Nat Biotechnol 18(6): 655-60.

Lecerf，J.M.,T.L.Shirley,et al.(2001)."Human single-chain Fv  intrabodies counteract in situ huntingtin aggregation in cellular models of  Huntington′s disease."Proc Natl Acad Sci U S A 98(8):4764-9.

Li,J.,C.Yen,et al.(1997)."PTEN,a putative protein tyrosine  phosphatase gene mutated in human brain,breast,and prostate cancer." Science 275(5308):1943-7.

Lian,Z.and A.Di Cristofano(2005)."Class reunion:PTEN joins the  nuclear crew."Oncogene 24(50):7394-400.

Matsumura,A.,S.Mizokawa,et al.(2003)."Assessment of  microPET performance in analyzing the rat brain under different types of  anesthesia:comparison between quantitative data obtained with microPET  and ex vivo autoradiography."Neuroimage 20(4):2040-50.

Mielke,J.G.and Y.T.Wang(2005)."Insulin exerts neuroprotection  by counteracting the decrease in cell-surface GABA receptors following  oxygen-glucose deprivation in cultured cortical neurons."J Neurochem92(1):103-13.

Ning,K.,L.Pei,et al.(2004)."Dual neuroprotective signaling  mediated by downregulating two distinct phosphatase activities of PTEN." J Neurosci 24(16):4052-60.

Shen,W.H.,A.S.Balajee,et al.(2007)."Essential role for nuclear  PTEN in maintaining chromosomal integrity."Cell 128(1):157-70.

Shyu,W.C.,S.Z.Lin,et al.(2005)."Overexpression of PrPC by  adenovirus-mediated gene targeting reduces ischemic injury in a stroke rat  model."J Neurosci 25 (39):8967-77.

Shyu,W.C.,S.Z.Lin,et al.(2004)."Functional recovery of stroke  rats induced by granulocyte colony-stimulating factor-stimulated stem  cells."Circulation 110(13):1847-54.

Steck,P.A.,M.A.Pershouse,et al.(1997)."Identification of a  candidate tumour suppressor gene,MMAC1,at chromosome 10q23.3 that  is mutated in multiple advanced cancers."Nat Genet 15(4):356-62.

Trotman,L.C.,X.Wang,et al.(2007)."Ubiquitination regulates  PTEN nuclear import and tumor suppression."Cell 128(1):141-56.

Wang,X.,Y.Shi,et al.(2008)."Crucial role of the C-terminus of  PTEN in antagonizing NEDD4-1-mediated PTEN ubiquitination and  degradation."Biochem J 414(2):221-9.

Wang,X.,L.C.Trotman,et al.(2007)."NEDD4-1 is a  proto-oncogenic ubiquitin ligase for PTEN."Cell 128(1):129-39.