一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法及其所用的培养基

摘要

本发明公开了一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法。即以当年生南方红豆杉的幼嫩叶片为外植体，消毒后接种于特定的诱导培养基中，在20-22℃条件下暗培养20天后，选取疏松、淡黄色的愈伤组织，转入特定的继代培养基中，在20-22℃条件下进行继代培养20天后即得到红豆杉叶片的愈伤组织。本发明的一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法，具有诱导率高、出愈时间短、生长速度快、污染率低等特点，并解决运用植物细胞培养技术对红豆杉愈伤组织进行大规模培养的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法及所用的培养基。

背景技术

紫杉醇(Taxo1)是从红豆杉科红豆杉属（Taxus spp.）植物的树皮中提取的一种天然抗癌紫杉烷类化合物，是目前世界公认的最好的广谱、强活性天然抗癌药。由于红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量较低，仅占树皮干质量的0.01% - 0.02%，枝叶干质量的十万分之一左右。因此随着全球对野生红豆杉资源保护措施的不断加强，利用野生资源生产紫杉醇已无可能，而现阶段人工种植的红豆杉资源量还远远不能满足紫杉醇生产的需求量。 

运用植物细胞培养技术对红豆杉愈伤组织进行大规模培养，获取人们需要的活性产物可望成为紫杉醇生产的重要途径。 

发明内容

本发明的目的之一为了解决上述的运用植物细胞培养技术对红豆杉愈伤组织进行大规模培养，获取人们需要的活性产物紫杉醇的问题而提供了一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法。 

本发明的目的之二是提供上述的一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法所用的诱导培养基和继代培养基。 

本发明的技术方案 

一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法，即以南方红豆杉的叶片为外植体，先后分别在诱导培养基和继代培养基中进行愈伤组织的诱导和继代培养后，最终得到红豆杉叶片愈伤组织。

上述的一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法，具体包括如下步骤： 

（1）、外植体的消毒

取当年生南方红豆杉的幼嫩叶片，经流水冲洗，然后依次用酒精、氯化汞消毒, 蒸馏水洗净后获得消毒的红豆杉外植体；

（2）、愈伤组织诱导培养

将步骤（1）所得的消毒的红豆杉外植体接种于诱导培养基上，控制温度为20-22℃条件下暗培养，20天后得到诱导培养后的愈伤组织；

所述的诱导培养基，按每升计算，

由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、1mg 吲哚乙酸（IBA）、0.25mg 6-苄基嘌呤（6-BA）、0.5mg 水解酪蛋白（CH）、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成；

或由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg  IBA、0.5mg CH 、20 g蔗糖、8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成；

或由1650mg NH₄NO₃、1900mg KNO₃、440mg CaCl₂·2H₂O、370mg MgSO₄·7H₂O、170mg KH₂PO₄、0.83mg KI、6.2 mgH₃BO₃、22.3mg、MnSO₄·4H₂O、8.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.25mg Na₂MnO₄·2H₂O、0.025mg CuSO₄·5H₂O、0.025mg CoCl₂·6H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O、 37.3mg Na₂-EDTA·2H₂O、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg IBA 、0.5mg CH 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成； 

（3）、愈伤组织继代培养

将步骤（2）所得的初代愈伤组织接种于继代培养基上，在20-22℃条件下暗培养，得到继代培养后的愈伤组织；

所述的继代培养基，按每升计算，

由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2 mg 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D） 、1 mg 6-BA 、20 g蔗糖、8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成；

或由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg 2,4-D 、0.5mg CH 、20 g蔗糖、8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成；

或由1650mg NH₄NO₃、1900mg KNO₃、440mg CaCl₂·2H₂O、370mg MgSO₄·7H₂O、170mg KH₂PO₄、0.83mg KI、6.2 mgH₃BO₃、22.3mg、MnSO₄·4H₂O、8.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.25mg Na₂MnO₄·2H₂O、0.025mg CuSO₄·5H₂O、0.025mg CoCl₂·6H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O、 37.3mg Na₂-EDTA·2H₂O、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2 mg 2,4-D 、1 mg 6-BA 、20 g蔗糖、8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成。

本发明的有益效果 

本发明以红豆杉叶片为外植体，由于采用了本发明所特有的诱导培养基和继代培养基，最终所得的愈伤组织诱导率为100%，生长速率为0.78g/L.d，出愈时间15d，因此具有诱导率高、出愈时间短、生长速度快、污染率低等特点。

另外，本发明的一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导和继代培养的方法，解决了运用植物细胞培养技术对红豆杉愈伤组织进行大规模培养的问题。 

具体实施方式

    下面通过具体的实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。 

实施例1

一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导方法，具体包括如下步骤：

（1）、外植体的消毒

取当年生南方红豆杉的幼嫩叶片，流水冲洗4h，依次用70％的酒精消毒30s、1％ 氯化汞消毒8min，无菌水冲洗干净；

（2）、愈伤组织诱导培养

将步骤（1）所得的消毒的红豆杉外置体用刀片将叶片划伤后接种于诱导培养基上，控制温度为20-22℃条件下暗培养20天后，得到诱导培养后的愈伤组织；

所述的诱导培养基，按每升计算，由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、1mg IBA、0.25mg 6-BA、0.5mg CH 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成；

（3）、愈伤组织继代培养

将步骤（2）所得的初代愈伤组织接种于继代培养基上，在20-22℃条件下暗培养20天后，得到继代培养后的愈伤组织；

所述的继代培养基，按每升计算，由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg 2,4-D 、0.5mg CH 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成。

实施例2

一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导方法，具体包括如下步骤：

（1）、外植体的消毒

取当年生南方红豆杉的幼嫩叶片，流水冲洗4h，依次用70％的酒精消毒30s、1％ 氯化汞消毒8min，无菌水冲洗干净；

（2）、愈伤组织诱导培养

将步骤（1）所得的消毒的红豆杉外植体用刀片将叶片划伤后接种于诱导培养基上，控制温度为20-22℃条件下暗培养20天后，得到诱导培养后的愈伤组织；

所述的诱导培养基，按每升计算，由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg  IBA、0.5mg CH 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成，pH5.8；

（3）、愈伤组织继代培养

将步骤（2）所得的初代愈伤组织接种于继代培养基上，在20-22℃条件下暗培养20天后，得到继代培养后的愈伤组织；

所述的继代培养基，按每升计算，由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2 mg 2,4-D 、1 mg 6-BA 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成。

实施例3

一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导方法，具体包括如下步骤：

（1）、外植体的消毒

取当年生南方红豆杉的幼嫩叶片，流水冲洗4h，依次用70％的酒精消毒30s、1％ 氯化汞消毒8min，无菌水冲洗干净；

（2）、愈伤组织诱导培养

将步骤（1）所得的消毒的红豆杉外植体用刀片将叶片划伤后接种于诱导培养基上，控制温度为20-22℃条件下暗培养20天，得到诱导培养后的愈伤组织； 

所述的诱导培养基按每升计算，由1650mg NH₄NO₃、1900mg KNO₃、440mg CaCl₂·2H₂O、370mg MgSO₄·7H₂O、170mg KH₂PO₄、0.83mg KI、6.2 mgH₃BO₃、22.3mg、MnSO₄·4H₂O、8.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.25mg Na₂MnO₄·2H₂O、0.025mg CuSO₄·5H₂O、0.025mg CoCl₂·6H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O、 37.3mg Na₂-EDTA·2H₂O、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg IBA 、0.5mg CH 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成；

（3）、愈伤组织继代培养

将步骤（2）所得的初代愈伤组织接种于继代培养基上，在20-22℃条件下暗培养20天后，得到继代培养后的愈伤组织；

所述的继代培养基，按每升计算，由1650mg NH₄NO₃、1900mg KNO₃、440mg CaCl₂·2H₂O、370mg MgSO₄·7H₂O、170mg KH₂PO₄、0.83mg KI、6.2 mgH₃BO₃、22.3mg、MnSO₄·4H₂O、8.6mg ZnSO₄·7H₂O、0.25mg Na₂MnO₄·2H₂O、0.025mg CuSO₄·5H₂O、0.025mg CoCl₂·6H₂O、27.8mg FeSO₄·7H₂O、 37.3mg Na₂-EDTA·2H₂O、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2 mg 2,4-D 、1 mg 6-BA 、20 g蔗糖、8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成。

将上述各实施例中步骤（2）经诱导培养20天后所得到的诱导培养后的愈伤组织进行诱导率和出愈时间的统计，结果见表1。 

表1、实施例1-3所得的诱导培养后的愈伤组织的诱导率、出愈时间和污染率情况

培养基诱导率出愈时间污染率实施例1100%152.4%实施例295%185.8%实施例385%152.9%

从表1中可以看出以实施例1的所用的诱导培养基，最终结果所得的诱导率最高，出愈时间最短、污染率最低。

统计上述各实施例中步骤（3）经继代培养20天后所得到的继代培养后的愈伤组织的生长率，结果见表2。 

表2、实施例1-3所得的继代培养后的愈伤组织的生长率情况

培养基生长速率 （g / L.d）实施例10.56实施例20.78实施例30.32

从表2中可以看出，实施例1经继代培养基后，最终结果所得的生长速率最快。

综上所述，本发明的一种红豆杉叶片愈伤组织的诱导方法，最佳诱导培养基配方，按每升计算，由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、1mg IBA、0.25mg 6-BA、0.5mg CH 、20 g蔗糖、 8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成； 

最佳继代培养基配方，按每升计算，由400mg NH₄N0₃、556mg Ca(NO₃)₂.4H₂O、990 mg K₂SO₄、96 mg CaCl₂.2H₂O、170 mg KH₂PO₄、0.25 mg Na₂MoO₄.2H₂O、370 mg MgSO₄.7H₂O、22.4mg MnSO₄.H₂O、8.6mg ZnSO₄.7H₂O、0.25mg CuSO₄.5H₂O、27.8 mg FeSO₄.7H₂O、37.3 mg Na₂-EDTA、100 mg肌醇、1.0mg维生素B1、0.5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、2mg 2,4-D 、0.5mg CH 、20 g蔗糖、8g琼脂、2g活性炭和余量的水组成。 

上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。