乳动脉衍生细胞及在组织修复和再生中的应用方法

摘要

本发明公开了分离的哺乳动物内乳动脉衍生细胞。此外，还公开了分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞的方法。所述细胞可用于组织工程技术，特别是用于血管组织工程。

说明书

相关专利申请

本专利申请为美国临时专利申请No.61/247,228的非临时提交。

技术领域

本发明主要涉及从哺乳动物内乳动脉分离的哺乳动物乳动脉衍生细 胞。本发明还涉及分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞的方法。将分离的内乳动 脉衍生细胞与支架进行组合即提供在组织工程装置中使用的方法。

背景技术

内乳动脉也称内胸动脉，布满于前胸壁和乳腺。内乳动脉与隐静脉移 植物相比，具有优异的长期开放性(patency)，被认为是进行冠状动脉旁路移 植术的首选主要血管。与冠状动脉和颈动脉相比，乳动脉对动脉粥样硬化有 高度耐抗性。与隐静脉相比内乳动脉的这一对移植物动脉粥样硬化的长期耐 抗性，已至少部分地被归因于其优异的内皮细胞功能。另外，内乳动脉对机 械损伤的响应也与冠状动脉不同。人冠状动脉通过促进细胞迁移和增殖来响 应球囊血管成形术，这导致在大约40％的病例中发生新血管内膜形成和再 狭窄。但是，与冠状动脉和隐静脉移植物不同，在经皮经腔血管成形术后在 内乳动脉移植物中没有发现再狭窄。因此，内乳动脉可能是血管祖细胞的有 价值的组织来源。

有大量文献记载，由软骨、骨和脂肪组成的异位组织能够在动脉的壁 内形成。这个现象被称为组织转化(metaplasia)，这提示多潜能祖细胞可存在 于动脉壁内。动脉壁内的成骨和成软骨分化在临床上被认为是血管钙化，这 个类型的矿化与心血管损伤的增加相关。血管钙化已知会增加主动脉硬度， 导致收缩期高血压、冠状动脉功能不全、左心室肥大、局部缺血和充血性心 力衰竭。事实上，大约85％的造成冠状动脉血栓症的斑块是钙化的。已提 出动脉壁内的祖细胞可能在斑块形成、钙化和动脉粥样硬化中起到作用。因 此，了解这些细胞如何促成血管病理以及修复，可能有助于改进心血管适应 症的疗法。

目前有许多实验室正在努力研究干细胞在血管生理学中的作用。已证 实成体器官含有参与器官维护和损伤后修复的干细胞。因此，从许多器官组 织类型(如果不是所有器官组织类型的话)分离出成体祖细胞，是可行的。 然后便可把这些组织特异性祖细胞开发用于组织特异性治疗的目的。

Zingin等人最近表明在成人血管壁中存在“生血管区”。在这个研究 中，从人内胸动脉分离出了推定的祖细胞。为了收获细胞，将动脉切碎并用 胰蛋白酶/EDTA在37℃下消化5分钟。过滤除去不消化的组织。将悬浮液 离心，所得的细胞沉淀重悬于内皮细胞生长培养基中并接种到包被来的胶原 或纤连蛋白的培养皿上。这些细胞显示了CD34的表达。还证实表达 KDR/Flk1和CD45的祖细胞存在于内乳动脉的血管壁内。这些资料提示在 内乳动脉的壁内存在祖细胞库。

鉴定并分离出可制造且能抵抗动脉粥样硬化的血管壁祖细胞，可能证 明是对细胞疗法和组织工程应用有利的。为尝试利用内乳动脉独特的抗粥样 硬化性质和机械性质，我们从人内乳动脉分离和表征了独特的祖细胞并评估 了它们在组织工程应用中的效用。

发明内容

我们公开了从哺乳动物内乳动脉分离的哺乳动物内乳动脉衍生细胞。 还提供了分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞的方法。对哺乳动物内乳动脉衍生 细胞进行了以下方面的表征：细胞形态、生长潜力、表面标志物表型、分泌 蛋白、基因表达、多潜能分化和体内促血管生成活性。这些细胞对于细胞和 组织的工程应用都具有效用。

附图说明

图1：形态学。将iMAC(内乳动脉衍生细胞)在包被胶原的组织培养 瓶上进行培养，在第2次传代(A)、第7次传代(B)和第23次传代(C)获取相 位对比图像。细胞显示均匀的成纤维细胞形态。

图2：生长动力学。将iMAC在包被胶原的瓶上培养81天。收获细 胞，每隔3-5天进行计数，确定群体倍增。培养物能够达到至少41.9次群体 倍增。

图3：毛细血管形成。将iMAC和人内乳动脉内皮细胞(EC)分别在包被 Matrigel的板上进行培养，观察毛细血管形成。将细胞在三种不同类型的培 养基中进行培养，包括iMAC生长培养基、内皮细胞生长培养基-2(EGM-2) 或平滑肌细胞分化培养基(SMC培养基)。在生长于iMAC生长培养基或 EGM-2中的iMAC培养物中观察到密集的毛细血管形成。图像是在100x放 大倍数下获取的。

图4：脂肪生成。将iMAC在脂肪生成诱导培养基中培养15天。在诱 导后5天、10天和15天，将培养物固定并用Oil Red-O染色。细胞内的脂 质小滴染成红色。左下小图中显示的第5天培养物的图像是在400x放大倍 数下获取的。所有其他图像是在200x放大倍数下获取的。

图5：细胞浸润/毛细血管密度。数据柱代表由细胞/毛细血管构成的面 积占所评估的总面积的平均百分数。N＝5或6。误差条代表平均值的标准误 差(SEM)。

图6：生长动力学。从被暴露于消化酶达30、60、90、120、150分钟 的内乳动脉分离细胞。然后将得自这些每一个时间点的细胞在组织培养板上 进行培养，直到细胞达到衰老。衰老是当细胞未能在生长区间(growth  interval)中达到一次群体倍增时确定的。确定了累积群体倍增数(PD)。

图7：内皮细胞分化：iMAC在用内皮细胞分化培养基处理后上调内皮 细胞标志物。表达(％)是指iMAC细胞培养物群体内表达受试的标志物的细 胞的百分数。在标准的iMAC细胞培养基中生长后表达受试的标志物的细胞 的百分数(白色柱)。在分化培养基中生长后表达受试的标志物的细胞的百 分数(黑色柱)。

图8：平滑肌细胞分化：在用平滑肌细胞分化培养基处理之前和之后， 平滑肌细胞标志物保持被表达。表达(％)指iMAC培养物群体内表达受试的 标志物的细胞的百分数。在标准的iMAC细胞培养基中生长后表达受试的标 志物的细胞的百分数(白色柱)。在分化培养基中生长后表达受试的标志物 的细胞的百分数(黑色柱)。

图9：心肌细胞分化：将iMAC在心肌细胞分化培养基中进行培养后， 心肌细胞标志物被上调。表达(％)指iMAC培养物群体内表达受试的标志物 的细胞的百分数。在标准的iMAC细胞培养基中生长后表达受试的标志物的 细胞的百分数(白色柱)。在分化培养基中生长后表达受试的标志物的细胞 的百分数(黑色柱)。

图10：接种iMAC的管状支架的组织学形状。将管状支架在内表面和 外表面上接种iMAC细胞，并在生物反应器室(bioreactor chamber)中培养10 天。此时，将支架用福尔马林固定并用苏木精和曙红染色。

图11：接种iMAC细胞的静电纺PCL支架的活/死染色。将静电纺管状 PCL支架接种iMAC细胞，并在生物反应器室中培养3天。将细胞通过在室 温下温育3小时进行模拟运输(mock-shipped)，然后返回标准的细胞培养 箱。在指定的时间，从支架切取小块，用活/死染液染色。

具体实施方式

应理解，本发明并不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物 系统，这些方法、试剂、化合物、组合物或生物系统当然是可以改变的。另 外应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施例的目的，并非旨在进 行限制。本说明书和所附权利要求书中用到的名词形式上为单数，但包括复 数指代，除非上下文清楚表明并非如此。

除非另有规定，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明 所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然任何与本文所述的方 法和材料类似或等同的方法和材料都可用于实施本发明的试验，不过本文描 述的是优选的材料和方法。在描述本发明并对本发明提出权利要求时，将使 用到以下术语。

“本发明的细胞”指哺乳动物内乳动脉衍生细胞。“分化”是非特化 的(“未定向的”)细胞或特化程度较低的细胞获得特化细胞(例如血管细 胞)的特征的过程。“分化的细胞或分化诱导的细胞”是在细胞的谱系内已 达到更为特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用于分化 的过程时，指已在分化途径中进行到这样的地步的细胞，即在正常情况下， 它将继续分化成特定细胞类型或细胞类型亚群，并在正常情况下不能分化成 另一不同的细胞类型或者回复到分化程度较低的细胞类型。“谱系特异性标 志物”指与所关注的谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向 的细胞向所关注的谱系的分化。

本文所用的“内乳动脉衍生细胞”是从哺乳动物内乳动脉分离的细 胞。内乳动脉衍生细胞除了产生具有等同潜能的子细胞之外，还可产生诸如 脂肪细胞的细胞，或者可产生一种或多种类型的组织例如血管组织。这些细 胞从内乳动脉“分离”，这是指通过酶消化将细胞从周围组织分离。“经消 化的材料”指在用酶溶液处理后从哺乳动物内乳动脉分离的细胞和组织。这 个经消化的材料要么弃去要么直接接种到组织培养容器上。“经消化的材 料”内所含的细胞可贴附于组织培养容器，且可在培养中增殖。

“经调理的培养基”是其中已培养过特定细胞或细胞群体然后去除了 该特定细胞或细胞群体的培养基。虽然细胞在该培养基中进行培养，但它们 分泌出能给其他细胞提供营养支持的细胞因子。这种细胞因子包括但不限于 激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白质、抗体和颗粒。含有细胞因子的 培养基是经调理的培养基。

一般来说，“营养因子”定义为促进细胞的存活、生长、增殖、成 熟、分化和/或维持，或者刺激细胞的活性提高的物质。“营养支持”在本 文中用来指促进细胞的存活、生长、增殖、成熟、分化和/或维持，或者刺 激细胞的活性提高的能力。本发明的哺乳动物内乳动脉衍生细胞能产生营养 因子，包括但不限于生长因子、细胞因子和分化因子。“基因表达”指将基 因转录成RNA产物，并任选翻译成一种或多种多肽序列。

在一个实施例中，提供分离的哺乳动物内乳动脉衍生细胞。该细胞能 够在培养中自我更新和扩增，其中该细胞对于以下每种细胞表面标志物的表 达呈阳性：CD29、CD44、CD73、CD166和HLA-1，而对于以下每种细胞 表面标志物呈阴性：CD10、CD15、CD23、CD24、CD31、CD34、CD45、 CD62p、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、 CD141、CD146、VE-钙黏着蛋白、KDR/Flk-1和HLA-2。

在另一个实施例中，哺乳动物内乳动脉衍生细胞对于细胞表面标志物 HLA-1的表达呈阳性，而对于以下每种细胞表面标志物的表达呈阴性：CD 10、CD31、CD34、CD45、CD133、CD141和KDR/Flk-1。

在又另一个实施例中，哺乳动物内乳动脉衍生细胞另外对于CD29、 CD44、CD73、CD166的表达呈阳性，而另外对于CD15、CD23、CD24、 CD62p、CD80、CD86、CD104、CD105、CD117、CD138、CD146、VE-钙 黏着蛋白和HLA-2呈阴性。

在另一个实施例中，哺乳动物内乳动脉衍生细胞可分泌营养因子β2微 球蛋白、肌酸激酶-MB、ENA-78、内皮素-1、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、脂 肪酸结合蛋白、铁蛋白、碱性FGF、白细胞介素-6、白细胞介素-8、胰岛 素、MCP-1、PAI-1、干细胞因子、TIMP-1、VCAM-1和VEGF。该细胞不 分泌血管性血友病因子或PDGF-bb。

在又另一个实施例中，提供分离的哺乳动物内乳动脉衍生细胞，所述 细胞能够在培养中自我更新和扩增，其中该细胞对于以下物质的基因表达呈 阳性：CD13、细胞因子配体2、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、内皮糖蛋 白、内皮细胞PAS结构域蛋白1、成纤维细胞生长因子-2、成纤维细胞生长 因子受体-3、低氧诱导因子-1、基质金属蛋白酶-2、神经毡蛋白-1、胎盘生 长因子、尿激酶、血小板反应蛋白-2、TIMP抑制剂-1、TIMP抑制剂-3、 TNF-12a、1型肌钙蛋白T、VEGF-B和VEGF-C、含三联模体33 (TRIM33)、SRY(性决定区Y)-框11(SOX-11)、Notch同源物2(果蝇) (NOTCH-2)、富半胱氨酸跨膜BMP调节物1(CRIM-1)、同源异型框D9 (HOXD9)和POU 3类同源异型框3(POU3F3)。

在一个实施例中，我们提供分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞的方法。 该方法包括获得内乳动脉组织，在两个步骤中依序消化该动脉以获得经消化 的材料，从经消化的材料分离细胞，和将细胞在生长培养基中培养以提供内 乳动脉衍生细胞。第一消化步骤包括将该组织在金属蛋白酶、中性蛋白酶和 /或黏液溶解酶存在下温育一段时间，该段时间足以部分消化该动脉，从而 除去该动脉的外部碎片和内膜层。合适的酶包括但不限于胶原酶、分散酶和 透明质酸酶以及它们的组合。在一个实施例中，将该动脉在胶原酶和分散酶 中消化。在一个实施例中，在第一消化步骤中将该动脉在酶混合物中温育约 60分钟。然后将经部分消化的动脉从酶混合物移出，并在第二消化步骤中 放入新鲜的酶混合物中足够一段时间，以获得含有内乳动脉衍生细胞的经消 化的材料。在一个实施例中，在第二消化步骤中将该动脉在酶混合物中温育 约30分钟至约60分钟。在另一个实施例中，在第二消化步骤中将该动脉在 酶混合物中温育约60分钟。然后将从经消化的材料分离的细胞接种到包被 胶原的组织培养容器上，在生长培养基中在标准条件下进行培养。经过短暂 的培养周期后，对细胞进行形态学、表面标志物表达、基因表达、营养因子 分泌和多潜能分化方面的表征。

在另一个实施例中，我们提供心血管疾病的诊断性和预后性评估以及 药物发现的方法，该方法使用哺乳动物内乳动脉衍生细胞来表征对生物剂或 药理剂(biologic or pharmacologic agents)的细胞响应，该方法包括从统计学上 显著的个体群体分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞，培养扩增来自该统计学上 显著的个体群体的哺乳动物内乳动脉衍生细胞以建立哺乳动物内乳动脉衍生 细胞的多个细胞培养物，使哺乳动物内乳动脉衍生细胞培养物与一种或多种 生物剂或药理剂接触，鉴定对该一种或多种生物剂或药理剂的一种或多种细 胞响应，和将来自统计学上显著的群体中的各个体的哺乳动物内乳动脉衍生 细胞培养物的该一种或多种细胞响应进行比较。本发明的哺乳动物内乳动脉 衍生细胞可在体外用来筛选各种各样的化合物以确定药物剂(pharmaceutical  agents)、生长/调节因子和抗炎剂的有效性和细胞毒性。为此目的，将本发 明的细胞或者如上所述的组织培养物在体外维持并暴露于要试验的化合物。 细胞毒性化合物的活性可通过其损害或杀死培养中的细胞的能力来测量。这 可容易地通过活体染色技术进行评估。生长/调剂因子的作用可通过分析体 外活细胞数目来评估，例如通过总细胞计数和各分类细胞计数来评估。这可 使用标准的细胞学和/或组织学技术来完成，包括使用免疫组织化学技术， 其应用到能确定型特异性细胞抗原的抗体。

本发明的细胞和组织可用作模型系统以供研究生理或病理条件。本发 明的细胞和组织也可用来研究细胞因子、生长因子(例如炎性介质，例如 IL小TNF和前列腺素)的作用机制。另外，可对细胞毒性剂和/或药物剂 进行筛选，找出那些对于特定患者最有效的细胞毒性剂和/或药物剂，如那 些能逆转、减轻或预防动脉粥样硬化和其他心血管病理状况的细胞毒性剂和 /或药物剂。然后可使用被证明体外有效的药物剂来对该患者进行治疗处 理。

在另一个实施例中，可将iMAC与可接受的基质(例如药物可接受的 基质)联合给药。该基质可以是可生物降解的。该基质还可提供另外的遗传 材料、细胞因子、生长因子或其他因子以促进细胞的生长和分化。也可将细 胞进行包囊后再给药。经包囊的细胞可包含在聚合物胶囊内。用来制备本文 所述的载体装置、支架或基质的聚合物是可生物降解的和生物相容性的。可 生物降解的聚合物当暴露于润湿的身体组织时容易分解成小片段。这些片段 随后会被身体吸收或排泄。更具体地讲，由于可生物降解的片段被身体吸收 或排泄，使得体内不会永久性保留痕量或残余片段，因此不会引起永久性的 慢性异物反应。包含数量提高的哺乳动物内乳动脉衍生细胞的本发明扩增细 胞制品，可用来构建组织工程装置，如生物人工血管或其他心血管装置。可 将细胞与由天然或合成的聚合物组成的支架进行组合，或者接种到所述支架 上。然后可将这些装置植入到患病或受伤的动物或人患者体内。哺乳动物内 乳动脉衍生细胞还可应用在用于促进新血管形成、细胞存活和组织修复的装 置内。组织工程/器官重建领域的一个重要挑战是如何将治疗装置充分地血 管化。任何构建物要具有价值，就必须把它做成含有微血管组分的方式。这 些毛细血管会确保该构建物具有足够的营养物供应、适当的气体交换和废物 移除。iMAC具有促血管生成活性，故对于组织工程应用可具有价值。

基因疗法的另一种应用容许以通常被认为危险的高浓度使用药物，这 是通过将耐药性基因转移到正常的哺乳动物内乳动脉衍生细胞中以给所述细 胞提供耐药性而容许的。具体而言，有可能通过转移对于抗癌药物具有耐药 性的基因，例如转移多耐药性基因到包含哺乳动物内乳动脉衍生细胞的扩增 细胞制品中，来高浓度使用抗癌药物进行治疗。也可通过在合适的启动子控 制下将编码目标蛋白的基因转移到哺乳动物内乳动脉衍生细胞中，来诱导和 表达缺陷蛋白。可对该蛋白质的表达进行控制以获得与通过体内天然表达所 获得的活性相同的活性。也有可能将编码核酶的基因、反义核酸或类似物或 者另一种合适的基因插入到哺乳动物内乳动脉衍生细胞中，以控制特定基因 产物在细胞中的表达或者抑制对疾病的易感性。例如，可使哺乳动物内乳动 脉衍生细胞发生基因修饰以表达反义核酸或核酶，这可防止病原体在目标器 官中的生长，包括但不限于HIV、HTLV-I和HTLV-II。

本发明涉及用于鉴定这样的物剂(agent)的方法，所述物剂能影响具有形 成哺乳动物内乳动脉衍生细胞的潜能的细胞的增殖、分化或存活。这种物剂 的实例有小分子、抗体和胞外蛋白。可对鉴定到的物剂进行剖析(profiled)并 评估其在动物中的安全性和功效。在另一个方面，本发明设想到通过使具有 形成哺乳动物内乳动脉衍生细胞的潜能的细胞与通过前述方法鉴定的(一种 或多种)物剂接触，来影响所述细胞的增殖、分化或存活的方法。可将鉴定 到的物剂配制成药物制剂。

优选的是，分化的细胞是衍自正在进行治疗的患者，以避免免疫排 斥。但是，在自体同源细胞不可得的情况中，可能有用的是将分化的细胞包 囊在这样的胶囊中，该胶囊可透过该细胞所需的营养物和氧气以及该细胞分 泌的治疗因子，而不可透过免疫体液因子和细胞。优选地，包囊材料具有低 变态反应性，容易且稳定地安置在目标组织中，给植入的结构提供额外的保 护。

通过按照本领域知道的任何方法对分化的细胞进行遗传修饰，也可提 供保护而免于免疫排斥。自体抗体和CTL抗性细胞可用诸如在美国专利第 5,286,632号、第5,320,962号和第5,342,761号以及在WO1990/11354、 WO1992/03917、WO1993/04169和WO1995/17911中公开的那些方法来产 生。作为另外一种选择，通过将这些细胞在自体抗体或IDD相关CTL或用 IDD特异性自体抗体激活的CTL的存在下进行培养，来实现抗性转分化细 胞的选择。由于这些技术，产生出了对通过抗体或T淋巴细胞依赖性机制 导致的破坏的抵抗性提高了的细胞。这种细胞可如本文所公开被植入到适当 组织中的适当宿主中，并对自体免疫过程导致的破坏的抵抗性提高。

同样，可任选地通过迭代法(iterative process)将分化的细胞的人白血病 抗原(HLA)谱进行修饰，在迭代法中，将分化的细胞暴露于正常的同种异基 因淋巴细胞，并选出存活的细胞。作为另外一种选择，使用定点诱变方法来 从分化的细胞的表面去除HLA标志物，并将由此产生的经修饰的分化细胞 植入到需要这种植入的受体哺乳动物中。

本发明的哺乳动物内乳动脉衍生细胞可进行冻存并维持或保存在“细 胞库”中。本发明的细胞的冻存可按照已知的方法进行。例如，但非限制性 地，可将细胞悬浮在“冷冻介质”中，所述冷冻介质例如是这样的培养基， 其还包含0-95％的FBS和0-10％的二甲亚砜(DMSO)冷冻保护剂，含有或不 含5-10％的甘油，密度例如为约0.5-10×10⁶个细胞/毫升。作为另外一种选 择，可使用其他冷冻保护剂，如碳水化合物，包括但不限于葡萄糖、蔗糖、 麦芽糖和海藻糖。可将细胞分配到玻璃或塑料安瓿或其他容器中，然后将这 些容器密封并转移到控速冻存机的冷冻室。最佳的冷冻速度可依经验确定。 例如可使用速率可编程的冻存机，其可通过熔化热每分钟产生-1至-10℃的 温度变化。一旦安瓿达到了-180℃，将它们转移到液氮保存区。冻存的细胞 可保存多年的时间，不过应至少每5年检查它们的存活力保持状况。本发明 的冻存细胞构成细胞库，可按需取其部分进行解冻“提取”然后加以使用。 解冻通常应快速进行，例如通过将安瓿从液氮转移到37℃水浴来进行。应 立即将安瓿的解冻内容物在无菌条件下转移到含有适当的培养基(如用 10％FBS调理的DMEM)的培养容器。作为另外一种选择，可以按类似方 式冻存完整的内乳动脉或者被切成片段或剁成碎片的内乳动脉。然后可从解 冻的完整动脉、动脉片段或剁碎动脉碎片分离哺乳动物内乳动脉衍生细胞。

在又一个实施例中，本发明的哺乳动物内乳动脉衍生细胞可在体外进 行培养以高收率地产生经调理的培养基或细胞裂解物。例如，这种能天然产 生所关注的特定生物产物(例如生长因子、调节因子或肽激素)或者已被遗 传工程改造以生产生物产物的细胞，可用例如三维细胞培养系统进行克隆扩 增。如果细胞将生物产物分泌到营养物培养基中，则可用标准的分离技术容 易地将产物从用过的或经调理的培养基分离，所述分离技术例如差异蛋白沉 淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、电泳和HPLC等等。可使用一种“生物 反应器”以利用流动方法来给例如体外三维培养物供料。简要地说，随着新 鲜培养基经过三维培养物，生物产物被洗出培养物，然后可如上所述从流出 物分离出来。作为另外一种选择，所关注的生物产物可保留在细胞内，因 此，它的收集可能要求将细胞进行裂解。然后可使用以上所列的技术中的任 一种或多种来纯化产物。

实例1

细胞分离优化

进行初步实验以确定组织消化所需的最佳时间。从美国国家疾病研究 交流会(National Disease Research Interchange(NDRI)，Philadelphia，PA)获 得了五厘米长的一段人内乳动脉。将动脉修整并在Dulbecco改进的Eagle培 养基(DMEM-低葡萄糖；Invitrogen，Carlsbad，CA)或磷酸缓冲盐水(PBS； Invitrogen)中洗涤以除去血液和碎片。然后将整个动脉转移到50毫米圆锥 管。

然后将该组织在含有0.25单位/毫升胶原酶(Serva Electrophoresis，德 国海德尔堡)和2.5单位/毫升分散酶(Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis IN)的酶混合物中消化不同的时间段。然后将酶混合物与内皮细 胞生长培养基-2(EGM-2)(Lonza，Walkersville，MD)进行组合。将含有该组 织、EGM-2和消化酶的圆锥管在225rpm轨道式振荡器中在37℃下温育递增 的时间段(30、60、90、120、150分钟)。在每个时间段结束时，从所得 的经消化的材料分离细胞。然后将经部分消化的动脉转移到含有新鲜酶和 EGM-2的混合物的50mL圆锥管，在剩余的时间段中进一步在37℃下消 化。在每个时间段结束时，将所得的消化物在150×g下离心5分钟，抽吸 上清液。将沉淀重悬在20毫升的EGM-2中。然后使细胞悬浮液滤过70微 米尼龙BD FALCON细胞过滤器(BD Biosciences，San Jose，CA)。然后将滤液 重悬在EGM-2(总体积50毫升)中，在150×g下离心5分钟。抽吸上清 液，将细胞重悬在另一15毫升的新鲜EGM-2中，接种到包被50ug/cm²大 鼠尾I型胶原(Inamed，Freemont，CA)的组织培养瓶中。然后将细胞在37℃和 5％CO₂下进行培养。然后评估生长潜力。将分离的细胞以5000个细胞/cm²的密度接种到包被I型大鼠尾胶原、在EGM-2中的T75瓶上，并在5％二氧 化碳中在37℃下进行培养。细胞每3-5天传代一次。在每次传代，用 TypleLE(Invitrogen)收获细胞，计数并用Guava仪器(Guava Technologies， Hayward，CA)测量存活力。然后计算群体倍增数[ln(最终细胞收率/接种的细 胞数的初始数目)/ln2]。

数据显示可通过依序消化内乳动脉从该动脉分离细胞。从30或60分 钟时间段获得的细胞生长不良(图6)。从90分钟时间段分离的细胞证实 具有最大生长潜力。我们因此确定，动脉必须最初消化约六十分钟，以除去 外部碎片和动脉的内膜层。在最初的60分钟消化后，然后必须将动脉转移 到新鲜的酶混合物进一步消化30-60分钟，以获得具有最大生长潜力的细 胞。这个依序消化方法使得可以分离位于动脉的外膜层/中间层内的细胞， 同时排除任何来自动脉内膜层的细胞和来自收获动脉后残余的任何外部碎片 的细胞。

实例2

人内乳动脉衍生细胞的分离

接着将最佳的消化时间段(实例1中所述)应用于分离内乳动脉衍生 细胞。从美国国家疾病研究交流会(National Disease Research Interchange (NDRI)，Philadelphia，PA)获得了五厘米长的一段人内乳动脉。将动脉修整 并在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM-低葡萄糖；Invitrogen，Carlsbad， CA)或磷酸缓冲盐水(PBS；Invitrogen)中洗涤以除去血液和碎片。然后将整 个动脉转移到50毫米圆锥管。

然后将组织在含有0.25单位/毫升胶原酶(Serva Electrophoresis，德国 海德尔堡)和2.5单位/毫升分散酶(Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis IN)的酶混合物中进行消化。然后将酶混合物与含有10％胎牛血 清(FBS)的iMAC生长培养基(Advanced DMEM/F 12(Gibco)，L-谷氨酰胺 (Gibco)青霉素(50单位/毫升)和链霉素(50ug/mL，Gibco))进行组合。将含 有该组织、iMAC生长培养基和消化酶的圆锥管在225rpm轨道式振荡器中 在37℃下温育1小时。然后将经部分消化的动脉转移到含有新鲜酶和iMAC 生长培养基的混合物的50mL圆锥管，在37℃下再消化1小时。然后将经消 化的动脉从50mL圆锥管移除并弃去。然后将所得的消化物在150×g下离 心5分钟，抽吸上清液。将沉淀重悬在20毫升的iMAC生长培养基中。然 后使细胞悬浮液滤过70微米尼龙BD FALCON细胞过滤器(BD Biosciences， San Jose，CA)。然后将滤液重悬在iMAC生长培养基(总体积50毫升) 中，在150×g下离心5分钟。抽吸上清液，将细胞重悬在另一15毫升的新 鲜iMAC生长培养基中，接种到包被50ug/cm²大鼠尾I型胶原(Inamed， Freemont，CA)的组织培养瓶中。然后将细胞在37℃和5％CO₂下进行培养。 将细胞培养2-10次传代，然后使用标准的冻存方法以1-2e⁶个细胞/mL冷冻 保护剂溶液(DMEM/F12，10％FBS)进行冻存。

实例3

人内乳动脉衍生细胞形态

将如实例2中所述分离的新鲜iMAC以5000个细胞/cm²的密度接种到 包被I型大鼠尾胶原、在iMAC生长培养基中的T75瓶上，并在5％二氧化 碳中在37℃下进行培养。细胞每3-5天传代一次。在每次传代，用TypleLE (Gibco)收获细胞，计数并用Guava仪器(Guava Technologies，Hayward，CA)测 量存活力。对于形态学评估，通过光学显微镜术对iMAC进行评定并用 Nikon显微镜和LCD数码相机观察细胞的形态学特征。

通过光学显微镜术对iMAC进行评定并用Nikon显微镜和LCD数码相 机观察细胞的形态学特征(图1)。iMAC的培养物始终显示成纤维细胞形 态。在后期传代(第23次传代)中形态稳定。

实例4

人内乳动脉衍生细胞生长潜力

将如实例2中所述分离的新鲜iMAC以5000个细胞/cm²的密度接种到 包被I型大鼠尾胶原、在iMAC生长培养基中的T75瓶上，并在5％二氧化 碳中在37℃下进行培养。细胞每3-5天传代一次。在每次传代，用TypleLE (Gibco)收获细胞，计数并用Guava仪器(Guava Technologies，Hayward，CA)测 量存活力。然后计算群体倍增数[ln(最终细胞收率/接种的细胞数的初始数 目)/ln2]。分析iMAC的培养物在培养中生长的能力(图2，表1)。将细胞 群体连续传代几个月，直到达到衰老。衰老是当细胞未能在研究的时间段中 达到大于一次群体倍增时确定的。在培养中86天之后，数据显示在包被胶 原的瓶上在iMAC生长培养基中生长的iMAC可增殖到至少第25次传代为 止并达到41.9次群体倍增。平均倍增时间是48小时/倍增，从一根5cm长 的内乳动脉可获得大于10E¹⁸个细胞。

表1：生长动力学。将iMAC在包被胶原的瓶上培养81天。收获细 胞，每隔3-5天进行计数并确定群体倍增和存活力。

实例5

人内乳动脉衍生细胞体外毛细血管形成

对于毛细血管形成，在第7次传代，将如实例2中所述分离的经冻存 的iMAC解冻，以5000个细胞/cm²的密度接种到包被Matrigel的24孔板 (BD Matrigel Matrix Cellware，BD Biosciences)上，在iMAC生长培养基、内 皮细胞生长培养基-2(Lonza)或平滑肌分化培养基(Lonza)中在5％二氧化碳中 在37℃下培养3天。在培养中1-5天之后，通过光学显微镜术评估毛细血管 的长出情况。

图4显示在Matrigel上在iMAC生长培养基或内皮细胞生长培养基-2内 培养的iMAC分化成了毛细血管样结构的致密网络。iMAC没有在平滑肌细 胞分化培养基内分化。还在包被Matrigel的板上培养了人胸动脉衍生的内皮 细胞(Cell Applications，Inc.San Diego，CA)。这些细胞未能分化成毛细血管结 构，这表明毛细血管分化是iMAC所独有的。

实例6

人内乳动脉衍生细胞脂肪生成

对于脂肪生成分化，将如实例2中所述分离的第7次传代的经冻存的 iMAC解冻，以5000个细胞/cm²的密度接种到没有进行包被的或包被I型大 鼠尾胶原的12孔板上，在iMAC生长培养基中在5％二氧化碳中在37℃下 进行培养。当细胞达到几乎铺满时，用脂肪生成诱导培养基(Lonza)代替 iMAC生长培养基，再培养15-20天，每隔2-4天更换培养基。为确定脂肪 生成分化的程度，将细胞用10％福尔马林固定，用Oil-Red-O(Sigma)染色， 并在诱导后第5、10和15天获取图像。

iMAC的培养物显示显著的脂肪细胞分化。图5显示在脂肪生成诱导培 养基内培养的iMAC产生了许多呈Oil Red-O染色阳性的细胞。在诱导五天 之后，存在的Oil Red-O阳性细胞极少。但是，在十天之后，Oil Red-O阳性 细胞的数目增加。在十五天之后，培养物内的大多数细胞分化成了脂肪细 胞。

实例7

人内乳动脉衍生细胞表面标志物表型

对如实例2中所述分离的新鲜iMAC进行流式细胞术分析。将细胞在 包被I型胶原的T75瓶上在生长培养基中在37℃和5％二氧化碳下扩增至第 七次传代。将贴壁细胞在PBS中洗涤，并用TypleLE(Gibco)脱下。收获细 胞，离心并以1×10⁷个细胞/mL的浓度重悬在3％(v/v)FBS的PBS溶液中。 向100微升的细胞悬浮液加入每种特异性抗体，将混合物在暗处4℃下温育 30-60分钟。在诱导之后，用PBS洗涤细胞，离心除去多余的抗体。将细胞 重悬在300微升PBS中，通过流式细胞术进行分析。流式细胞术分析是用 Guava仪器进行。所用的抗体在表2中显示。

表2：用于表征iMAC的细胞表面标志物的抗体。

  抗体   制造商   目录号   CD34   BD Pharmingen   555821   CD44   BD Pharmingen   555478   CD45R   BD Pharmingen   555489   CD117   BD Pharmingen   340529   CD141   BD Pharmingen   559781   CD31   BD Pharmingen   555446   CD133   Miltenyi Biotech   120-001-243   SSEA4   R&D Systems   FAB1435P   CD105   SantaCruz Biotech   SC-21787   CD104   BD Pharmingen   555720   CD166   BD Pharmingen   559263   CD29   BD Pharmingen   555442   IgG-FITC   BD Pharmingen   555748   IgG-PE   BD Pharmingen   555749   CD34   BD Pharmingen   555821   CD44   BD Pharmingen   555478   CD45R   BD Pharmingen   555489   CD117   BD Pharmingen   340529   CD141   BD Pharmingen   559781   CD31   BD Pharmingen   555446   CD49c   BD Pharmingen   556025   CD73   BD Pharmingen   550257   CD90   BD Pharmingen   555596   HLA-I   BD Pharmingen   555553   HLA-II   BD Pharmingen   555558   CD133   Miltenyi Biotech   120-001-243   SSEA4   R&D Systems   FAB1435P   CD105   SantaCruz Biotech   SC-21787   CD104   BD Pharmingen   555720

  CD166   BD Pharmingen   559263   CD29   BD Pharmingen   555442   CD24   BD Pharmingen   555428   CD56   AbCAM   MEM188   CD138   BD Pharmingen   550805   E-钙黏着蛋白   BD Pharmingen   612130   IgG-FITC   BD Pharmingen   555748   IgG-PE   BD Pharmingen   555749

表3：

通过流式细胞术(表3)表征iMAC。iMAC的第七次传代培养物显示 对于CD29、CD44、CD73、CD166和HLA-1呈阳性染色，而对于CD10、 CD15、CD23、CD24、CD31、CD34、CD45、CD62p、CD80、CD86、 CD104、CD105、CD117、CD133、CD138、CD141、VE-钙黏着蛋白、 KDR/Flk-1和HLA-2呈阴性染色。表3将观察到的iMAC表面标志物表型与 已知的细胞类型的表面标志物表型进行比较。

  细胞类型   抗体   细胞类型表达   iMAC表达   内皮细胞祖细胞   CD34   阳性   阴性   CD133   阳性   阴性   CD45   阳性   阴性   内皮细胞   VE钙黏着蛋白   阳性   阴性   KDR/Flk1   阳性   阴性   CD31   阳性   阴性   CD104   阳性   阴性   平滑肌细胞   CD141   阳性   阴性   间充质干细胞   CD10   阳性   阴性   CD29   阳性   阳性   CD44   阳性   阳性   CD73   阳性   阳性   CD105   阳性   阴性   CD166   阳性   阳性   其他   CD15   阳性   阴性   CD23   阳性   阴性   CD24   阳性   阴性   CD62p   阳性   阴性   CD73   阳性   阳性   CD80   阳性   阴性

  CD86   阳性   阴性   CD117   阳性   阴性   CD138   阳性   阴性   HLA 1   阳性   阳性   HLA 2   阳性   阴性

表3：细胞表面标志物表型。用表1中所述的抗体通过流式细胞术对 iMAC进行表征。按照特定细胞类型(表中“细胞类型”)的已知表面标志 物对标志物进行分组(organized)。特定细胞类型所表达的表面标志物(表中 “细胞类型表达”)。表达受试的表面标志物的iMAC(表中“阳性”)。 阳性染色是通过将试验抗体染色谱(profile)与阴性对照抗体染色进行比较来 确定。超过75％的细胞染色则认为是阳性。不表达受试的表面标志物的 iMAC(表中“阴性”)。如果与阴性对照抗体相比不到25％的细胞呈阳性 则认为是染色阴性。

实例8

人内乳动脉衍生细胞基因表达

将如实例2中所述分离了的细胞以5000个细胞/cm²的密度接种到包被I 型胶原、在iMAC生长培养基中的T75瓶上，并在5％二氧化碳中在37℃下 进行培养。细胞每3-5天传代一次。在第10次传代，用RNA提取试剂盒 (Qiagen，Valencia，CA)按照生产商说明书直接在瓶上裂解几乎铺满的培养 物。然后提取总RNA，用人血管生成寡核苷酸阵列(Angiogenesis Oligo  Arrays)(SA Biosciences，Frederick，MD)和Affymetrix人外显子ST1.0微阵列按 照生产商说明书评估基因表达。

用低聚杂交阵列表征iMAC的基因表达谱。数据显示，iMAC表达118 种受试的血管生成相关基因中的19种，包括：CD13、趋化因子配体2、肝 配蛋白A2、肝配蛋白A3、内皮糖蛋白、内皮细胞PAS结构域蛋白1、成纤 维细胞生长因子-2、成纤维细胞生长因子受体-3、低氧诱导因子-1、基质金 属蛋白酶-2、神经毡蛋白-1、胎盘生长因子、尿激酶、血小板反应蛋白-2、 TIMP抑制剂-1、TIMP抑制剂-3、TNF-12a、肌钙蛋白T type-1、VEGF-B和 VEGF-C。

另外，用Affymetrix人外显子1.0微阵列通过微阵列分析评估iMAC的 培养物。表4显示前500个被表达得最多的转录物。有几个发育上调节的基 因被高度表达，包括：含三联模体33(TRIM33)、SRY(性决定区Y)-框 11(SOX-11)、Notch同源物2(果蝇)(NOTCH-2)、富半胱氨酸跨膜BMP 调节物1(CRIM-1)、同源异型框D9(HOXD9)和3类POU同源异型框3 (POU3F3)(表5)。

  UniGene   说明   Hs.311640   核糖体蛋白S27a   Hs.525622   V-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1   Hs.1239   丙氨酰(膜)氨基肽酶，CD13   Hs.303649   趋化因子(C-C模体)配体2   Hs.532655   肝配蛋白-A2   Hs.516656   肝配蛋白-A3   Hs.76753   内皮糖蛋白(Osler-Rendu-Weber综合征1)   Hs.468410   内皮细胞PAS结构域蛋白1   Hs.284244   成纤维细胞生长因子2(碱性)   Hs.1420   成纤维细胞生长因子受体3   Hs.509554   低氧诱导因子1   Hs.512234   白细胞介素6(干扰素，β2)   Hs.479756   激酶插入结构域受体   Hs.513617   基质金属肽酶2   Hs.131704   神经毡蛋白1   Hs.252820   胎盘生长因子   Hs.77274   纤溶酶原激活物，尿激酶   Hs.371147   血小板反应蛋白2   Hs.522632   TIMP金属肽酶抑制剂1   Hs.652397   TIMP金属肽酶抑制剂3   Hs.355899   肿瘤坏死因子受体超家族，成员12A   Hs.631558   1型肌钙蛋白T(骨骼，慢)   Hs.78781   血管内皮细胞生长因子B   Hs.435215   血管内皮细胞生长因子C

表4：血管生成相关基因表达。iMAC的培养物通过低聚杂交阵列进行 评估，然后用生产商提供的软件进行评估。获得全局背景值，然后将它从所 鉴定的杂交信号获得的值中扣除。本文所示的基因被iMAC以高于背景值的 水平表达。

  探针组代号   样品1   样品2   样品3   基因符号   mRNA-登录号   平均值   标准偏差   2429144   14.42   14.47   14.51   TRIM33   NM_015906   14.5   0.05   2467968   13.90   13.90   14.10   SOX11   NM_003108   14.0   0.11

 2431202   13.57   13.63   13.66   NOTCH2   NM_024408   13.6   0.05  2477142   13.19   13.25   13.18   CRIM1   NM_016441   13.2   0.04  2516866   12.80   12.91   12.91   HOXD9   NM_014213   12.9   0.07  2497821   12.41   12.59   12.37   POU3F3   NM_006236   12.5   0.12

表5：微阵列基因表达分析。用Affymetrix微阵列外显子ST1.0微阵列 评估iMAC的第10次传代培养物。显示了500个最高度表达的基因。以三 次重复(表中“样品1”、“样品2”和“样品3”)测量iMAC。相对基因 表达由荧光强度单位表示。将全局非特异性背景荧光从每个特异性杂交信号 中扣除。三次重复测量的平均荧光强度(表中“平均值”)。标准偏差(表 中“标准偏差”)。

实例9

人内乳动脉衍生细胞营养因子分析

将如实例2中所述分离的新鲜iMAC培养至第7次传代，然后以5000 个细胞/cm²的密度接种到包被I型胶原的六孔板上，在iMAC生长培养基 中，并在37℃和5％二氧化碳下培养。然后将用过的培养基更换成无血清培 养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco)、青霉素(50单位/毫升)和链霉素 (50ug/mL))，再培养20小时。以14,000×g离心5分钟收集经调理的无血 清培养基，并在-20℃保存。然后用HumanMAP v1.6Immunoplex免疫测定法 (Rules-Based Medicine，Austin，TX)分析样品。在三个独立的iMAC培养物上 进行营养因子分析，并归一化到从未经调理的无血清培养基获得的值。

在iMAC的培养物上分析九十种不同的生长因子和细胞因子的分泌 (表6、7)。结果显示iMAC分泌高水平的β2微球蛋白、癌抗原19-9、肌 酸激酶-MB、ENA-78、内皮素-1、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、脂肪酸结合蛋 白、铁蛋白、碱性FGF、白细胞介素-6、白细胞介素-8、胰岛素、MCP-1、 PAI-1、干细胞因子、TIMP-1、VCAM-1和VEGF。iMAC不分泌血管性血 友病因子。

表6：营养因子分泌谱。对来源于iMAC的培养物的无血清培养基评估 生长因子和细胞因子分泌。将三个独立的培养物(表中“iMAC 1”、 “iMAC 2”、“iMAC 3”)所示的因子数量归一化到细胞数目，并以每20 小时每一百万个细胞分泌的因子数量表示。测定法检测限(表中“最小可检 测剂量”)。未经调理的培养基(表中“无细胞对照”)。

表6：营养因子分泌谱(续)。对来源于iMAC的培养物的无血清培养 基评估生长因子和细胞因子分泌。将三个独立的培养物(表中“iMAC 1”、“iMAC 2”、“iMAC 3”)所示的因子数量归一化到细胞数目，并 以每20小时每一百万个细胞分泌的因子数量表示。测定法检测限(表中 “最小可检测剂量”)。未经调理的培养基(表中“无细胞对照”)。

  分泌的蛋白质   β2微球蛋白   癌抗原19-9   肌酸激酶-MB

  ENA-78   内皮素-1   嗜伊红粒细胞趋化蛋白   脂肪酸结合蛋白   铁蛋白   碱性FGF   IL-6   IL-8   胰岛素   MCP-1   PAI-1   干细胞因子   TIMP-1   VCAM-1   VEGF

表7：分泌的因子。对来源于iMAC的培养物的无血清培养基评估生长 因子和细胞因子分泌。显示了分泌的蛋白质。这些是以超过该无细胞对照未 经调理培养基和测定法检测限的量分泌的因子。

实例10

人内乳动脉衍生细胞体内血管生成活性

组织工程/器官重建领域的一个重要挑战是如何将治疗装置充分地血管 化。任何构建物要具有价值，就必须把它做成含有微血管组分的方式。这些 毛细血管会确保该构建物具有足够的营养物供应、适当的气体交换和废物移 除。能增强新血管形成的细胞的鉴定将具有重大价值。

我们最近从人内乳动脉分离了称为内乳动脉衍生细胞的细胞。这些细 胞可具有重要的促血管生成的性质。在这个研究中，用Matrigel血管生成测 定法来评估iMAC的促血管生成活性。Matrigel血管生成测定法已成为许多 涉及体内血管生成试验的研究的首选方法。在这个测定法中，将血管生成诱 导化合物如bFGF引入到冷液态Matrigel中。然后在皮下注射之后，Matrigel 溶液固化并容许能诱导血管形成的宿主细胞随后渗入。通过检查被染色以增 强血管的可见性和容许检测选定的切片的血管密度的组织学制品，实现对 Matrigel块(plug)中的血管生成反应的评估。

  组编号   动物数目   植入物数目   试验材料   1   3   6   单独Matrigel   2   3   6   Matrigel+iMAC   3   3   6   Matrigel+bFGF

表8：实验设计。

在移植当天，将第7次传代的iMAC(如实例2中所述制备)在37℃ 下解冻，培养至亚铺满，收获并重悬在磷酸盐缓冲盐水(无Ca2+、Mg2+) 中。将约400mL的冰冷的生长因子减少了的(growth factor-reduced)Matrigel 基质(Gibco目录号12760-021)与100ul的含有1×10⁶个iMAC的PBS进行 预混合。另外，含有50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的Matrigel作 为阳性对照进行试验，其按照与荷载细胞的Matrigel试验物品相似的方式制 备。将稀释于Matrigel中的细胞或bFGF保持在湿冰上直到移植之时为止。 对SCID小鼠的所有操作都必须在通风橱下进行。将小鼠逐个进行称重，用 吸入麻醉法(5.0％异氟烷)通过箱引发技术(chamber induction technique)进 行引发，在手术过程中将动物以1.5-2.5％的异氟烷维持。在引发麻醉之后， 用电动动物剪刀将动物从背颈区到背腰骶区的整个背部剪掉毛发。然后将该 区域用二乙酸氯己定擦洗，用酒精淋洗，干燥，涂上含1％有效碘的碘伏水 溶液。给眼睛施加眼用软膏，以防止麻醉期间该组织干燥。将经麻醉和手术 准备的动物放在所需的横卧体位。用23G针将500ul的Matrigel细胞悬浮液 皮下注射到小鼠的左右背表面中。

在植入后第10天以组织学方法评估Matrigel支架内的毛细血管密度。 对在研究过程中死亡或者在垂死状况下被处以安乐死的任何动物进行肉眼检 查。小鼠是在它们的指定时间间隔通过吸入CO2处以安乐死。记录植入部 位的肉眼观察结果。将皮下植入部位连同它们的覆盖皮肤切除。将皮下植入 部位连同它们的覆盖皮肤对切。将一半组织保存在10％缓冲福尔马林固定 剂中以进行石蜡包埋。将固定的样本送到Paragon Bioservices(Baltimore MD) 进行组织学处理。作出组织学切片，用H&E染色。另外，用人特异性抗波 形蛋白抗体(Dako)和抗血管性血友病因子抗体对切片进行染色。由Paragon 的技术人员以盲检方式对毛细血管密度/细胞向内生长情况进行定量。简言 之，从每个Matrigel植入物获得五个图像。然后，测定新形成的细胞/毛细 血管所占据的面积与Matrigel中预先确定的框(predefined frame)的总面积之 百分比(表9)。

测定了所有Matrigel外植体的细胞性(cellularity)程度。如图5和表9中 所示，在组1单独Matrigel植入物内观察到极少的细胞或毛细血管(占总 Matrigel面积的4％)。但是，与组1相比，接种iMAC的Matrigel刺激了细 胞浸润和毛细血管形成。细胞和毛细血管占据接种iMAC的Matrigel植入物 的11％+/-2％。细胞和毛细血管占据bFGF阳性对照Matrigel植入物的7％ +/-1.9％。

数据表明iMAC能促进细胞浸润和刺激血管生成及Matrigel支架内微血 管系统的形成。因此，这些细胞通过提供增强新血管形成和提高可植入生物 装置的总体存活力的手段，可在组织工程/器官重建应用中具有价值。

表9：细胞浸润/毛细血管密度：每个外植体获取五个显微视野的图 像，估计细胞和毛细血管所占据的面积，以占总面积的分数记录。(由细胞 /毛细血管组成的面积/总评估面积)。评估人员不知道组的分配方案。有关 处理组的说明参见表1。Matrigel外植体没有检测(NA)。所示的数据在图5 中进行图示总结。

实例11

人内乳动脉衍生细胞内皮细胞和平滑肌细胞分化

已证实iMAC当在Matrigel上培养时可分化成毛细血管样细胞(参见实 例5)。进行了进一步的研究以表征iMAC内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细 胞分化。将经冻存的第17次传代的iMAC解冻并接种到组织培养塑料上， 在内皮细胞分化培养基(DMEM+10％FBS+50ng/mlVEGF)中培养七天。然 后通过流式细胞术对细胞进行几种不同内皮细胞特异性标志物的表达的评 估，所述标志物包括CD144、CD309、CD34、CD31和血管性血友病因 子。结果表明，当在内皮细胞分化培养基中培养时，大约20％的培养的 iMAC上调了CD144、CD309、CD31和CD34的表达(图7)。

还解冻了第17次传代的iMAC，接种到组织培养塑料上，在平滑肌分 化培养基(MesenPRO RS，Invitrogen)中培养七天，然后通过流式细胞术评估 三种不同平滑肌细胞特异性标志SMA、SM22和钙调理蛋白。结果表明 iMAC在标准的iMAC生长条件下表达了所有这三种平滑肌细胞标志物。当 在平滑肌细胞分化培养基中培养时，表达模式不变(图8)。

还将第17次传代的iMAC在心肌细胞分化培养基(DMEM/F12+10％ FBS+10uM 5-氮杂胞苷)中培养七天，然后通过流式细胞术评估isL1和肌 节α肌动蛋白(SA)的表达。数据表明超过80％的iMAC上调了isL1。相比之 下，在用心肌细胞分化培养基处理之前和之后都有100％的iMAC表达SA (图9)。

这些数据表明，iMAC可分化成内皮细胞以及心肌细胞。因此，这些细 胞可在心血管组织工程应用中具有效用。

实例12

人内乳动脉衍生细胞骨生成分化

对于骨生成分化，将如实例2中所述分离的新鲜的第7次传代的iMAC 以5000个细胞/cm²的密度接种到不经包被的12孔板上，在iMAC生长培养 基中在5％二氧化碳中37℃下进行培养。当细胞达到几乎铺满时，用骨生成 诱导培养基(10-8M地塞米松，Sigma；0.2mM抗坏血酸，Sigma和10mM β 甘油磷酸酶，Sigma)代替iMAC生长培养基，再培养21天，每隔2-4天更 换培养基。为确定骨生成分化的程度，将细胞用70％冰冷乙醇固定1小时。 将培养物用水淋洗，然后用1mL的40mM茜素红(pH 4.1；Sigma)在旋转下染 色10分钟。用PBS淋洗培养物以减少非特异性染色。然后在诱导后第5、 10和21天获取染色的培养物的图像。人体间充质干细胞(hMSC)(Lonza)用 作阳性对照。

在暴露于骨生成诱导培养基21天之后，iMAC没有显示出矿物质沉 积，因此没有显示骨生成分化能力。然而，hMSC显示极强的矿物质沉积。

实例13

用于血管组织工程的人内乳动脉衍生细胞

为试图利用内乳动脉的独特抗动脉粥样硬化特性和机械特性，我们将 分离新鲜的iMAC并评估它们在血管和其他心血管组织工程应用中的效用。

iMAC将被接种到由天然或合成的聚合物构成的中空管状支架上，用旋 转壁式(RWV)生物反应器(Synthecon，Inc.)或灌注式生物反应器(Tissue  Growth Technologies，Inc.)进行培养。管状支架的一端要用显微动脉瘤夹 (Roboz Surgical Instrument Co.，Inc.)封闭，管腔将充以细胞悬浮液(2500个 细胞/cm²)。另一端用另一夹子封闭，含有细胞悬浮液的移植物被放在 RWV生物反应器中24小时，以让细胞初始接种到支架的内表面上。作为另 外一种选择，IMA细胞要通过将其加到浸泡管状支架的培养基而被接种到 移植物的外表面上。在初始的24小时接种时间之后，夹子要被除去，并将 移植物在生物反应器内再培养4-7天。在另一些实验中，接种的管状支架将 要用灌注式生物反应器(Tissue Growth Technologies，Inc.)在生理脉动流和压 力下进行培养。在培养周期之后，要使用以上所述的方法以及组织学方法， 对接种细胞的构建体的细胞贴附、存活力、增殖和表型做评估。

另外，将要示明iMAC的抗动脉粥样硬化性质。iMAC和人主动脉平滑 肌细胞(对照细胞系)要在12孔板中进行培养。在铺满时，细胞将被转换 到钙化培养基(含有2mM无机磷酸盐的生长培养基)达14天之久。每隔2 天，该培养基将要被新鲜培养基更换。作为另外一种选择，iMAC将要与平 滑肌细胞一起在钙化培养基中进行共培养。然后细胞要用0.6NHCl去钙化 24小时。HCl上清液的钙含量将通过邻甲酚酞络合剂方法(Calcium Kit； Sigma)进行比色测定。去钙化之后，细胞将要用磷酸缓冲盐水洗涤三次，然 后用0.1N NaOH、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶解。蛋白质含量将要用BCA 蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)进行测量。细胞层的钙含量将要被归 一化至蛋白质含量。利用iMAC进行组织工程改造的血管移植物可更能抵抗 动脉粥样硬化。IMAC还可使移植物弹性改进。虽然内乳动脉已被成功应用 于旁路移植术，但它在手术解剖过程中易受损害。这无疑将会导致移植失 败。由iMAC组成的经组织工程改造的血管移植物可证明是传统血管移植材 料的优异替代品。

实例14

将50/50对二氧杂环己酮-乙交酯共聚物PDO/PLGA静电纺管状支架用 乙醇预润湿，在室温下在0.02N乙酸中用大鼠尾I型胶原(BD Biosciences， Bedford MA)按照生产商说明书包被1小时，然后用磷酸缓冲盐水(PBS)淋 洗。然后将如实例2中所述分离的iMAC细胞以4×10⁶个细胞/ml的浓度静 态接种到包被胶原的管的外部上，接种方法是用吸管将25ul的细胞悬浮液 慢慢转移到管的每一侧上，之后在室温下温育30分钟。然后将接种的管缝 合到生物反应器室倒钩(Tissue Growth Technologies，Minnetonka，MN)上，生 物反应器室充有iMAC生长培养基。通过用注射器加入1×10⁶个细胞/ml的 iMAC细胞悬浮液对内腔进行接种。然后将生物反应器室内经接种的管在放 置在37℃细胞培养箱里的细胞培养瓶辊上进行0.5rpm旋转培养。培养5天 和10天之后，从生物反应器室中取出管，用10％福尔马林固定，并用苏木 精和曙红(H&E)染色以进行组织学分析。

组织学分析结果揭示，iMAC在静电纺管状支架上贴附和增殖良好，并 有一些积集在支架空间中。图10显示接种了细胞的管的组织学截面，表明 细胞贴附和生长到管表面的内部和外部上的多个层中。还可观察到细胞迁移 到静电纺管状支架的内层中。

实例15

按以下方式制备静电纺PCL支架。配制150mg/mL的PCL(Lakeshore  Biomaterials)于1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFP，TCI America Inc.)溶剂中的溶 液，在振动板上置于暗环境中过夜，以确保所有PCL溶解并形成均匀溶 液。然后将该聚合物溶液(3ml)抽取到塑料Beckton Dickinson注射器(3ml) 中，放在KD Scientific注射器泵(型号100)中，以5.5ml/h的速率进行注 配。用高压电源(Spellman CZE 1000R；Spellman High Voltage Electronics  Corporation)将+22kV的电压施加于固定到该含溶液的注射器的18号针头钝 端。将溶液电纺到距离针尖8英寸放置并以约400rpm的速率旋转的直径为 2mm的圆柱形接地轴柄上，以制备无规取向纤维的支架。轴柄的平移距离 为18cm，平移速度为18cm/s。在进行电纺之前，用一小段铝箔包裹轴柄， 以助于移出管。完成了电纺时，将轴柄浸入100％乙醇中，使箔衬滑离轴柄 并小心地从管的内部移除。

将经灭菌的PCL静电纺管状支架用100％乙醇预润湿，用0.02N乙酸洗 涤并按照生产商说明书包被1型大鼠尾胶原(BD Biosciences，Bedford，MA)一 小时。然后将移植物用iMAC生长培养基洗涤两次，缝合到生物反应器室 (Tissue Growth Technologies，Minnetinka，MN)的倒钩上。外室充以iMAC培 养基，用1.2×10⁶个细胞/ml的细胞悬浮液接种移植物的内表面。用注射剂给 内室充以细胞悬浮液，然后将内室盖住并放到放置在37℃细胞培养箱里的 细胞培养瓶辊上过夜。第二天，用新鲜培养基更换内室中的培养基，并移除 任何未贴附的细胞。再过一天再次更换内室中的培养基。在接种之后第三 天，将管从生物反应器室的倒钩切下，用10ml的无血清Advanced DMEM/F12培养基洗涤两次，然后转移到5ml冻存管以便运输(shipment)。 一个样品用活/死染液(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照生产商的方案进行分析。 将该样品切成两半，一半在3小时室温模拟运输之后进行分析，另一半在同 样的模拟运输并另外在5ml冻存管中在细胞培养箱中37℃温育过夜之后进 行分析。

其余的样品植入到Lewis大鼠的主动脉中。简单来说，手术移除一段肾 下主动脉，用接种了细胞的管状支架替代。然后监测大鼠4个星期。然后通 过CT血管造影术评估移植物的开放性(patency)，通过超声成像定期测量移 植物内径。植入后四个星期，将动物处以安乐死，切取移植物，通过组织学 染色进行检查。

图11显示活/死测定结果，表明iMAC在PCL电纺管移植物上贴附和 增殖良好，并在培养3天、3小时室温模拟运输和另外在细胞培养箱中37℃ 温育过夜之后保持存活。可见的死细胞极少，而活细胞没有显示任何预示受 胁迫细胞或垂死细胞的形态改变。

对植入到Lewis大鼠主动脉中的iMACD接种支架的直径的超声测量表 明，在植入之后直到4个星期移植物都保持开放(patent)，内径变化极小。 CT血管造影术结果也表明移植物保持开放。在4星期时间点切取移植物之 后用苏木精和曙红进行的组织学染色表明无血栓形成迹象，并表明有细胞进 入支架中的迹象。这些结果提示，iMAC细胞可用于针对血管组织的损害进 行修复和再生。

实例16

可再现地从第二供体分离的人内乳动脉衍生细胞

用实例2中描述的方法从新鲜取自新的人供体的乳动脉中分离出 iMAC。对这一新批次的IMAC进行流式细胞术分析。将细胞在包被I型大 鼠尾胶原的T75瓶上在iMAC生长培养基中在37℃和5％二氧化碳下扩增至 第八次传代。将贴壁细胞在PBS中洗涤并用TypleLE脱下。收获细胞，离 心并以5×10⁵个细胞/mL的浓度重悬在3％(v/v)FBS的PBS溶液中。将特异 性抗体加到100微升的细胞悬浮液，所得混合物在暗处4℃下温育30-60分 钟。温育之后，用PBS洗涤细胞两次，离心除去过量的抗体。将细胞重悬 在300微升PBS中，通过流式细胞术进行分析。流式细胞术分析是用Guava 仪器进行。所用的抗体在表10中显示。

表10：用来表征iMAC细胞表面标志物表型的抗体。

iMAC的第8次传代培养物对CD29、CD44、CD73、CD166和HLA-1 呈阳性染色。iMAC对CD10、CD15、CD23、CD24、CD31、CD34、 CD45RA、CD62p、CD80、CD86、CD104、CD133、CD138、CD141、 CD146和HLAII呈阴性染色。

结果(表11)表明，iMAC可从获自不同供体的人内乳动脉分离并仍 保持一致和可再现的表型。实例2中描述的iMAC得自一名51岁女性，而 本实例中描述的iMAC是从一名56岁男性分离得到。很明显，虽然iMAC 会表达一些与间充质干细胞共有的标志物，但CD10不被iMAC表达。另 外，平滑肌细胞标志物CD141也不被iMAC表达。iMAC不表达通常由内 皮细胞或造血细胞表达的标志物。这些数据与实例7中描述的我们之前的发 现相一致。

有必要进行进一步的评估以表征这个供体的生长性能和分化潜力。但 是，基于这些结果，预期这些细胞特征将与过去的发现保持不变。本文描述 的数据提示，iMAC可以可再现地从不同的人内乳动脉中分离。这可提高在 广泛的临床应用中使用iMAC的潜力。

表11：细胞表面标志物表型。用表10中描述的抗体通过流式细胞术表 征iMAC。按照特定细胞类型(表中“细胞类型”)的已知表面标志物对标 志物进行分组(organized)。特定细胞类型所表达的表面标志物(表中“细胞 类型表达”)。表达受试的表面标志物的iMAC(表中“阳性”)。阳性染 色是通过将试验抗体染色谱(profile)与阴性对照抗体染色进行比较来确定。

超过75％的细胞染色则认为是阳性。不表达受试的表面标志物的iMAC (表中“阴性”)。如果与阴性对照抗体相比不到25％的细胞呈阳性则认 为染色阴性。