检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒

摘要

本发明涉及检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒。具体而言，本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定血液样本中非对称二甲基精氨酸(ADMA)含量的试剂盒，其由鼠抗人ADMA单克隆抗体溶液、交联有ADMA-人血清白蛋白复合体的胶乳颗粒悬浮液和ADMA校准品组成。本发明的方法利用血液中游离ADMA与交联在胶乳颗粒表面的ADMA竞争结合ADMA单克隆抗体，使得交联ADMA的胶乳颗粒与ADMA单抗反应形成的浊度下降，通过浊度下降程度来检测ADMA含量。本发明试剂盒能应用于临床常用的生化分析仪器，操作简便、快速、特异性强，灵敏度和检测范围均能满足临床应用的要求。

说明书

技术领域

本发明提供了一种利用免疫比浊方法测定人血清、血浆样本中非 对称二甲基精氨酸含量的试剂盒，具体涉及利用人血清、血浆样本中 非对称二甲基精氨酸和交联有非对称二甲基精氨酸-人血清白蛋白复合 体的胶乳悬浮液竞争结合鼠抗非对称二甲基精氨酸单克隆抗体，通过 检测免疫浊度的下降，达到较高的灵敏度和较宽的检测范围，属于医 学免疫体外诊断领域。

背景技术

非对称二甲基精氨酸(asymmetric diethylarginine，ADMA)是一种 天然氨基酸，广泛存在于组织和细胞中。它能抑制一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase，NOS)的合成及由此而产生的生物学效应，阻 止内皮细胞一氧化氮(NO)的合成，导致血管内皮功能降低。血浆 ADMA浓度的变化与血管内皮功能损害、动脉粥样硬化、脑梗死、高 血压、高脂蛋白异常、糖尿病、肾功能衰竭等血管性病变的严重程度 密切相关，是目前临床研究的重点课题之一。可以说，血浆ADMA的 浓度是内皮功能不全和心血管疾病的危险因子。

ADMA在体内由精氨酸甲基转移酶生成，精氨酸甲基转移酶有两 种类型：I型甲基化组蛋白和核内RNA-结合蛋白生成NG-单甲基-L- 精氨酸(NG-monomethyl-L-arginine，L-NMMA)和ADMA；II型仅甲 基化髓磷脂主要蛋白产生L-NMMA和对称性二甲基精氨酸(symmetric dimethylarginine，SDMA)。L-NMMA和ADMA均能降低NOS的活性， 但前者血浆浓度大约是ADMA的1/20，因此，大多数研究都针对ADMA 的检测。SDMA在血浆中的浓度与ADMA相似，但对NOS没有效应。

测定血浆中ADMA的方法包括高效液相色谱、酶联免疫和免疫荧 光等。但是生物样品中ADMA的测定比较烦琐，因为存在精氨酸和 SDMA与ADMA在检测中表现交叉反应性。ADMA与精氨酸的不同 仅在于一个胍基氮上的两个甲基。此外，正常人血清中精氨酸的浓度 大约是ADMA浓度的100倍。SDMA比精氨酸更接近于ADMA，不 同之处仅在于一个甲基的位置。在正常人血清中，SDMA的浓度与 ADMA的浓度相当，大约为1uM。

不仅如此，上述检测ADMA的方法，都存在样品处理烦琐、手工 操作、耗时间长的特点。因此，发明一种特异性检测人血浆中ADMA， 同时能够应用到自动化仪器上的试剂盒成为非常之需。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于提供一种能够应用到全自动化生化 分析仪器上的非对称二甲基精氨酸检测试剂盒，能够快速、准确的检 测人血浆样本中的非对称二甲基精氨酸含量。

因此，本发明的第一方面涉及一种测定非对称二甲基精氨酸含量 的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，其特征在于，包括：

1)非对称二甲基精氨酸R1试剂；

2)非对称二甲基精氨酸R2试剂；

3)非对称二甲基精氨酸校准品；

所述非对称二甲基精氨酸R1试剂包括非对称二甲基精氨酸特异 性单克隆抗体、缓冲液、稳定剂、促凝剂和防腐剂；

所述非对称二甲基精氨酸R2试剂包括非对称二甲基精氨酸-惰性 蛋白复合体包被的胶乳颗粒、缓冲液、稳定剂和防腐剂；

所述非对称二甲基精氨酸校准品是由非对称二甲基精氨酸、缓冲 液、稳定剂和防腐剂组成。

优选地，所述非对称二甲基精氨酸-惰性蛋白复合体是通过偶联剂 将非对称二甲基精氨酸和惰性蛋白偶联后而获得。优选地，所述偶联 剂选自碳化二亚胺(EDAC)、戊二醛、二异氰酸化合物和二卤化二硝 基苯中的一种。

优选地，所述的惰性蛋白选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛 转铁蛋白、血蓝蛋白中的一种。

优选地，所述胶乳颗粒是一种核壳结构，乳核是聚苯乙烯聚合物， 乳壳由苯乙烯、丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸共聚物组成。

优选地，所述胶乳颗粒根据其表面所带的化学基团不同可以选自 羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基修饰的一种。

优选地，所述胶乳颗粒直径范围为50-250nm，使用浓度选自 0.05-0.5％。

优选地，所述非对称二甲基精氨酸-惰性蛋白复合体可以通过与胶 乳颗粒本身携带的化学基团通过化学键结合在胶乳颗粒表面，常用的 化学基团包括羧基、氨基、羟基、酰肼基、氯甲基等，本发明通过优 化的化学交联方法将非对称二甲基精氨酸-惰性蛋白复合特异性的结合 在胶乳颗粒表面的羧基上，所述优化的化学交联方法可以概括为“一 步双pH”法。

优选地，所述缓冲液选自3-[N，N-二(羟乙基)氨基]-2-羟基丙磺 酸-氢氧化钠缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、 三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液和巴比 妥缓冲液中的一种或两种以上，使用浓度选自10-200mM。

优选地，所述稳定剂选自0.1-5％浓度范围的牛血清白蛋白、0.5-1％ 浓度范围的氯化钠、2-50mM的EDTA、0.1-1％浓度范围的吐温-20、 1-10％浓度范围的丙三醇一种或两种以上。

优选地，所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、苯酚和乙基汞硫代硫 酸钠中的一种或两种以上，使用浓度选自0.02％-0.1％。

优选地，所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫 酸葡聚糖钠中的一种，使用浓度范围选自1-6％。

最优选地，所述的测定非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫 比浊法试剂盒由如下组分组成：

R1：0.2mg/mL ADMA单克隆抗体、0.9％氯化钠、5％PEG-6000、 0.2％BSA、20mM EDTA、0.1％叠氮化钠、50mM Tris-HCl缓冲液 pH7.2；

R2：非对称二甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体包被的聚苯乙烯胶 乳颗粒0.25％、50mM甘氨酸缓冲液pH8.0、0.9％氯化钠、0.8％BSA、 20mM EDTA、0.1％吐温20、0.1％叠氮化钠，其中所述聚苯乙烯胶 乳颗粒表面带有羧基、直径为150nm；

非对称二甲基精氨酸校准品：浓度分别为0、0.5、2、5、10、20umol/L 的非对称二甲基精氨酸、0.9％氯化钠、1％BSA、50mM EDTA、0.1％叠 氮化钠、50mM Tris-HCl缓冲液pH7.2。

换言之，本发明基于一个特异性针对ADMA的单克隆抗体和交联 有ADMA-人血清白蛋白的胶乳颗粒悬浮液，在特定的反应体系中发生 抗原抗体反应形成一定的浊度，能够被基于分光光度计的生化分析仪 检测到。而人血浆中如果有游离状态的ADMA存在，会与固定在胶乳 颗粒表面的ADMA竞争结合单克隆抗体，使浊度下降，通过测定反应 后体系浊度的降低程度来对ADMA进行定量分析。

本发明同时解决了ADMA检测的特异性和自动化程度低的问题， 可以广泛推广应用。

具体而言，为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：通过 用偶联在惰性蛋白上的ADMA包被胶乳颗粒并悬浮在特定缓冲液中制 作R2试剂。其中用作包被的胶乳颗粒直径范围为100-200nm，浓度为 1-5mg/mL。由于ADMA分子量非常小，很难与胶乳颗粒结合。因此本 发明中用作包被的ADMA首先通过化学键偶联在惰性大分子蛋白上， 分子量较大的惰性蛋白可以更好的与胶乳颗粒结合，偶联有ADMA的 惰性蛋白浓度为0.1-1mg/mL。偶联有ADMA的惰性蛋白进一步通过优 化的化学交联方法包被在胶乳颗粒表面，所用的化学交联方法为“一 步双pH”法，即胶乳颗粒首先在低pH条件下被活化剂激活，再与高 pH溶液中的ADMA-惰性蛋白复合体混合，混合后的溶液pH为中性， 这种方法可以使得偶联有ADMA的惰性蛋白高效、特异的与胶乳颗粒 表面结合。所用作的悬浮缓冲液为含有稳定剂和防腐剂的甘氨酸 -NaOH缓冲液，浓度为20-100mM，pH范围为7-9。所用作的稳定剂 为牛血清白蛋白0.1-1％、氯化钠浓度为0.7-0.9％、乙二胺四乙酸浓度 为5-50mM、吐温20浓度为0.1-1％。所用防腐剂为叠氮钠0.05-0.1％。

通过在特定缓冲液中加入特异性针对ADMA的单克隆抗体来制作 R1试剂，特定缓冲液中要添加无机盐、促凝剂、蛋白质和防腐剂。其 中所选择的单克隆抗体为特异性针对ADMA的抗体，可以通过本领域 公认的杂交瘤方法制备，也可以购买商品化的产品，例如Abcam、 Mlilipore等。所选择的ADMA单克隆抗体首先要通过间接ELISA方 法检测，确认不会与SDMA、L-NMMA和精氨酸产生交叉反应。其中 要求缓冲液的缓冲能力为调节pH范围在7-9之间，可以选择各种缓冲 液，优选HEPES、甘氨酸、Tris等，与其他缓冲液相比，具有缓冲能 力强、溶解度高、很好的生物适应性和反应惰性。其中Tris-HCl能较 长时间控制恒定的pH范围，因此更优选Tirs-HCl，其浓度范围为 10-100mM，pH范围为7-8。促凝剂选择PEG-6000，可以加快免疫反 应速度，缩短检测时间，其终浓度为2-6％。蛋白质选择牛血清白蛋白， 终浓度为0.1-1％。氯化钠浓度为0.7-0.9％，叠氮钠浓度为0.05-0.1％。

通过在特定缓冲液中添加ADMA浓度分别为0、0.5、2、5、10、 20umol/L制作多点校准品，其中要求缓冲液的缓冲能力为调节pH范 围在7-9之间，可以选择各种缓冲液，优选HEPES、甘氨酸、Tris等， 与其他缓冲液相比，具有缓冲能力强、溶解度高、很好的生物适应性 和反应惰性。其中Tris-HCl能较长时间控制恒定的pH范围，因此更优 选Tirs-HCl，其浓度范围为10-200mM，pH范围为7-8。其中含有特定 的蛋白稳定剂如牛血清白蛋白浓度为0.1-1％，含有特定的防腐剂如叠 氮钠浓度为0.05-0.1％，含有特定的抗氧化剂如乙二胺四乙酸浓度为 5-50mM。

本发明提供用于测量在人血浆、血清样品中的非对称二甲基精氨 酸免疫比浊测定方法，其特征在于，通过将含有非对称二甲基精氨酸 的人血浆、血清样本，与胶乳颗粒包被的非对称二甲基精氨酸竞争结 合特异性针对ADMA的单克隆抗体，导致浊度下降，下降的程度与人 血浆、血清中的非对称二甲基精氨酸含量成正比，采用全自动生化分 析仪器可以计算出人血浆、血清样本中非对称二甲基精氨酸的含量。

本发明与现有技术相比，具有如下特点：

1)能够应用在自动生化分析仪器上，检测速度快；

2)检测特异性强，不与L-NMMA、SDMA和精氨酸产生交叉反 应，与HPLC方法具有很高的相关性；

3)检测灵敏度和检测范围达到其他正在临床应用的试剂盒同等水 平，能够满足临床应用需要。

附图说明

图1为本发明所制备试剂盒的线性图。

图2为本发明所制备试剂盒与HPLC方法试剂盒检测临床样本比 对的相关性。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术 人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修 改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料 如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1：制备偶联非对称二甲基精氨酸的人血清白蛋白

将10mg人血清白蛋白用1mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释 后，加入非对称二甲基精氨酸，再加入50mg EDAC，在4℃反应24 小时，再用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.8)在4℃条件下透析24小时， 制作成偶联ADMA的人血清白蛋白(非对称二甲基精氨酸-人血清白 蛋白复合体)。

实施例2：制备非对称二甲基精氨酸R2试剂

表面带有羧基、直径150nm的聚苯乙烯胶乳溶液(浓度10％)(购 自Merck)0.5mL，加入4.5mL的0.05M MES缓冲液(pH6.0)，然后 加入5mg EDAC，在37℃反应1小时。再将0.5mg偶联有ADMA的人 血清白蛋白用5mL 0.05M硼酸盐缓冲液(pH9.2)稀释后，立即加入到 上述胶乳溶液中，在37℃反应6小时。最后加入1mL 0.1M的甘氨酸 缓冲液(pH8.5)搅拌1h来终止反应，离心去掉上清，用20mL 50mM 的甘氨酸缓冲液(pH8.0)洗涤3次，50mM的甘氨酸缓冲液中含有0.9％ 氯化钠、20mM EDTA、0.8％BSA、0.1％吐温20、0.1％叠氮化钠，最 后再以同样20mL的甘氨酸缓冲液分散成乳白色胶乳悬浮液，为R2试 剂，最终R2试剂中非对称二甲基精氨酸-人血清白蛋白复合体包被的 聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为0.25％。

实施例3：制备非对称二甲基精氨酸R1试剂

在50mM pH7.2的Tris-HCl缓冲液中，添加0.2mg/mL的ADMA 单克隆抗体(购自Abcam)，同时添加氯化钠0.9％、PEG-60005％、 BSA 0.2％、EDTA20mM、叠氮化钠0.1％，搅拌均匀为R1试剂。

实施例4：制备非对称二甲基精氨酸校准品

在50mM pH7.2的Tris-HCl缓冲液中，加入浓度分别为0、0.5、2、 5、10、20umol/L的非对称二甲基精氨酸，另外添加氯化钠0.9％、BSA 1％、EDTA 50mM、叠氮化钠0.1％，搅拌均匀为非对称二甲基精氨酸 多点校准品。

实施例5：非对称二甲基精氨酸剂盒的性能检测

1.检测试剂盒的用法：

以日立7180生化分析仪为例：测定波长570nm，首先加入R1试 剂150uL，37℃反应30秒后加入ADMA校准品10uL，再反应60秒后 加入R2试剂50uL，测定反应第10秒、70秒的吸光度值(A1、A2)， 计算吸光度差值ΔA＝A2-A1，每管重复测定2次，将各校准品管2次 测得的吸光度差值ΔA为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作“浓度- 吸光度差值”校准曲线，取待测样本，同法测定样本的吸光度差值， 代入校准曲线，即可计算出待测样本中ADMA的含量。

2.重复性检测：

以生理盐水稀释人血清样本，配制浓度分别为0.1、0.5、1、2umol/L 的样本，用上述非对称二甲基精氨酸R1、非对称二甲基精氨酸R2和 非对称二甲基精氨酸校准品组成的试剂盒，与A公司的ELISA试剂h 盒比较重复性能。A公司的试剂基本分析原理是，先使用酰基化试剂 将样本中的ADMA酰基化，然后加入酶标板，与结合在固相上的 ADMA竞争性结合ADMA多克隆抗体，采用不同水平的标准品与酶标 记抗体竞争结合，然后显色读出吸光度，制作标准曲线。样品与标准 品同样步骤操作后，在标准曲线上得到相应ADMA浓度。本发明试剂 盒按照1所述的方法测定10次，计算不同ADMA含量样本检测的变 异系数，与A公司商品化的ELISA试剂盒比较结果如下表1和2所示：

表1本发明试剂盒的检测重复性：

  0.1uM   0.5uM   1uM   2uM   1   0.14   0.52   1.01   2.12   2   0.13   0.47   1.02   2.18   3   0.18   0.48   1.11   2.07   4   0.14   0.49   1.07   2.09   5   0.15   0.45   1.08   2.08   6   0.12   0.46   1.04   2.1   7   0.17   0.49   0.98   2.12   8   0.19   0.55   1.01   2.04   9   0.12   0.58   1.02   2.08   10   0.17   0.47   1.07   2.09   平均值   0.151   0.496   1.041   2.097   SD   0.025144   0.0416867   0.0401248   0.0374314   CV   16.7％   8.4％   3.9％   1.8％

表2、A公司的ELISA试剂盒的检测重复性：

  0.1uM   0.5uM   1uM   2uM   1   0.08   0.50   1.08   2.09   2   0.07   0.54   1.05   2.18   3   0.19   0.45   1.11   2.07   4   0.14   0.44   1.07   2.11   5   0.11   0.51   0.97   2.08   6   0.12   0.43   1.04   2.02   7   0.17   0.48   0.98   2.12   8   0.14   0.52   1.04   2.02   9   0.11   0.55   1.07   2.08   10   0.15   0.42   1.03   2.09   平均值   0.128   0.484   1.044   2.086   SD   0.0376534   0.0469515   0.0432563   0.0467143   CV   29.42％   9.70％   4.14％   2.24％

从上表1和2可以看出，本发明试剂盒的重复性比A公司的ELISA 试剂盒好，更有利于临床诊断的应用。

3.线性检测：

筛选非对称二甲基精氨酸浓度约为20umol/L的样本，用生理盐水 做10个不同比例的稀释，按照1所述的方法检测各浓度，每浓度重复 测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行回收率分析，结果偏 差均小于10％，证明线性能达到20umol/L，结果见表3和图1。

表3本发明试剂盒的线性

  稀释比例   理论浓度[um/L]   测量浓度[um/L]   回收率[％]   0/10   0.0   0.0   1/10   2.00   2.07   101.0％   2/10   4.00   4.12   104.0％   3/10   6.00   6.04   103.3％   4/10   8.00   8.08   101.3％   5/10   10.00   10.13   104.2％   6/10   12.00   12.07   101.7％   7/10   14.00   14.11   100.6％   8/10   16.00   16.08   99.8％   9/10   18.00   18.13   100.2％   10/10   20.00   20.02   104.0％

4.本发明试剂盒与HPLC检测临床样本的相关性比较

用本发明的试剂盒与HPLC对34例病人样本同时进行检测，检测 结果见图2，以HPLC方法检测的样本ADMA结果为横坐标，以本发 明试剂盒检测的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为 Y＝0.9965X+0.018，相关系数r＝0.999，经过统计学处理结果表明，本 发明方法同HPLC方法检测临床样本测值相关性良好，表明本发明试 剂盒的检测特异性强。