一种用于短链RNA检测的欧米茄结构寡核苷酸引物及其应用

摘要

本发明公开了一种于短链RNA检测的欧米茄结构寡核苷酸引物，其从5’端至3’端依次为：20-30个碱基的PCR引物目标区、0-50碱基的可变编码区、欧米茄茎环、至少1个碱基的探针间隔区和4-11个碱基探针区，所述欧米茄茎环的茎的长度为4-12个配对的碱基，所述欧米茄茎环的环的长度为3-20个不配对的碱基，本发明的这种结构的引物可以避免链内启动和引物二聚体化，可以增加探针在3’末端目标杂交精确度，提高转录特异性和灵敏度，可以用较少的引物取得较高的RT效率和较好的特异性，同时在一个反应体系中可加入检测不同目标的多个引物，可以同时区分不同的检测目标而来的PCR产物，从而实现多通道高通量检测，大大提高了检测效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种引物，特别涉及一种检测短链RNA的引物及其应用。 

背景技术

短链RNA在很多生物学、生理和病理过程中起着重要的基因调节作用。短链RNA中微小RNA(miRNA)是数量最多的一类。由于它与它的同类物DNA, RNA相比很短，发现起来较困难，因此近些年才发现它的存在。1993年，lin-4是第一个被发现的22nt短链RNA，它通过对靶基因lin-4信使RNA（mRNA）调节，在实验中对线虫发育时间表的启动和细胞分化起抑制作用。直到7年后，类似结构和功能的短链RNA在人类细胞中有更多的发现，才认定lin-4不是孤立的，并将其归为基因调节子的一类分子，即微小RNA（miRNA）的成员。

miRNA后来被发现在调节胚胎发生、发育、血管形成、细胞生长、细胞凋亡等方面具有功能活性。在一系列的病变过程中，如癌症发生，免疫缺陷，病毒感染等也发挥作用。Lu等发现比起正常组织miRNA在肿瘤中总的是下调趋势。进而，用miRNA表达谱可以分辨出低分化的肿瘤分类，而用信使RNA表达谱分析同样的样本得不出准确的结果。这些发现凸显出miRNA表达谱用于癌症诊断的巨大潜力。最近Resotta基因公司上市了一系列的miRNA癌细胞诊断试剂盒，并宣称这些试剂盒可以准确检测转移性癌细胞的来源。

尽管miRNA的功能和作用机理仍然需要进一步的研究阐明，但基于学术研究和医学诊断原因，围绕这些小分子检测和应用的研究越来越多。最近发现在体液中miRNA由于分子链短和argonaute复合体保护的原因，比起它们的信使RNA配对物要稳定的多。关于将血清或血浆miRNA表达谱做为癌症预测、癌细胞鉴别和分型等诊断工具的可能性评估已有不少报道。

由于序列短，核苷酸变异小以及缺少内控参照，只有22个核苷酸组成的miRNA，用现在最通用的检测信使RNA（mRNA）的方法检测根本不合适，例如，定量反转录实时PCR（qRT-PCR）虽然已经被发展成检测信使RNA（mRNA）表达和表达谱的黄金标准。而发现miRNA的方法多采用短链RNA克隆筛选，表达谱检测方法包括深度测序（deep sequencing），液相或固相杂交（hybridization）或基于RT-PCR的微阵列芯片技术（RT-PCR based microarrays）。从技术的角度来看，miRNA RT-PCR已经在miRNA表达谱和检测的众多策略中脱颖而出成为最准确和最灵敏的方法。因此，微阵列芯片的数据通常采用单目标RT-PCR测定（RT-PCR single-plex assay）来复核评价其准确性。

反转录是在反转录酶催化下，以RNA为模板的cDNA合成反应。一个寡核苷酸链退火互补到RNA链上作为反应起始点，然后cDNA从5’端到3’端，按照与RNA模板碱基互补的原则一个碱基接着一个碱基合成下去。在匹配区域碱基互补，引物和RNA模板才能形成双链体，这是反转录反应启动（引发）的必要条件。一般为了提供足够的Tm和特异性，保证在引物和目标（而非其它RNA）RNA模板之间专一地形成更紧密和稳定的双链体，引物通常设计成20-30nt（碱基）的长度。短链RNA，尤其是miRNA是一类短链寡核苷酸，平均链长18-30nt。由于链太短它们不能被传统的引物引发合成cDNA。为改善短链寡核苷酸的Tm有几种修饰可以采取，例如，用LNA寡核苷酸（寡聚锁核酸），连接一个较长的通用寡核苷酸接头到目标RNA上；用polyA多聚酶延长miRNA，以及采用茎环结构的引物。

目前，市场上有几种用完全不同RT引物，检测miRNA的qRT-PCR试剂盒。公认度最高的是来自Applied Biosystems公司的miRNA 表达谱和检测试剂盒，其产品特点是采用独特的茎环RT引物设计，它是由Chen博士在Applied Biosystem建立的茎环结构引物包含一个ABI专用茎结构用于改善短链RNA的检测。茎环引物的碱基堆砌效应提高了完全配对结合的探针和目标RNA的热动力学稳定性，进而提高了RT反应的效率。检测的灵敏度比用线性引物高出100倍，本发明的实施例中，所述的“茎环引物”即采用该引物结构。虽然，对于茎环结构引物怎样改善提高反转录的特异性和效率知道的不是太多，但它的发明人宣称茎环结构的引物能通过核苷碱基的堆砌效应增加短探针的熔化温度（Tm）值，可选择性地促进短链RNA的反转录。值得注意的是，在本申请的实验中，用合成的没有链内引发位点的RNA作为模版，线性的引物其引发的效果即使没有比茎环引物的效果更好，也至少同样好。况且还没有更多的实验支持这样的作法会提高RT反应精确度。这就很难理解碱基堆砌效应如何提高反转录的效率。可能茎环引物对位于链内目标序列杂交（链内引发）的抑制，也是增加这些引物检测短链RNA效能的部分原因。

核糖核酸（RNA）可以作为模板通过反转录按照Watson-Crick 碱基配对的原则合成产生单链的DNA。这种反转录（RT）必需一小段寡核苷酸（引物）结合到模板上的互补位点，形成稳定的双链体以此作为合成的起始点。一旦双链体形成，只有几个碱基很短的寡聚核苷酸就足以有效地起始DNA聚合反应。在一定的反应体系中，RT反应的起始效率依赖于引物-RNA双链体的稳定性，而温度极大地影响着双链体稳定性。引物-RNA双链体的融化温度（Tm）是指一半引物-RNA双链体解离时的温度。引物的Tm值取决于引物的长度和引物-RNA之间形成双链体的组成。当与目标配对结合，长度20-30个碱基的一段寡核苷酸就能提供足够的热稳定性，满足形成RT反应起始点必需之引物-RNA双链体。较短的寡核苷酸作为引物要满足双链体稳定的要求就必须较低的温度。在较低的温度时，酶活性较低，DNA多聚反应的效率很低，而且由于潜在目标位点增多，DNA多聚反应的专一性也低。同时在较低温度时，多核苷酸折叠成超强的二级结构，造成RT的产物比起较高温度时的产物要短。 寡核苷酸的长短对RT引发效率的影响不大，几乎所有商业化的RT试剂盒都选择了随机的六聚物作为合成第一条DNA链的引物。在利用这种短的寡聚核苷酸作引物时，链内引发是最大的问题，而短链多核苷酸模板的二级结构并不会成为主要的问题。

避免链内引发，引物二聚体形成，提高末端引发精确度，是设计检测多目标短链RNA有效引物要解决的几个关键问题。长度20-30个碱基的寡核苷酸可引发合成特异目标片段，在37℃和以上温度启动PCR或RT提供足够的复杂度和热稳定性。但这种寡核苷酸太长，对于以微小RNA（miRNA）为模板的短链RNA反转录来说不合适。对于检测和分析miRNA来说其困难在于miRNA链的长度造成很大的热动力学挑战。较短的寡核苷酸可以作为引物在较低温度下并不会对引发启动效率产生不良影响，但是长度过短不可避免地会丧失复杂度。这种复杂度极大的丧失会导致在模板链的中间增加识别位点（链内引发位点），造成非特异的扩增。随着链内引发位点量的增多，竞争性消耗反应资源，造成总的RT效率和特异性极大降低。所以说短线性引物不可用是由于链内引发。miRNA复杂的生物起源涉及到miRNA原(pri-microRNA)，miRNA前体（pre-microRNA）和成熟miRNA等，使它的检测变得进一步复杂。除了链内引发，引物分辨引物-模板在3’末端错配的能力对RT 效率也是一个重要的因素。

如上所述，这些现有的技术都存在各自的局限性，妨碍了更广泛地应用。如LNA修饰增加了寡核苷酸的退火温度（Tm）但却妨碍了酶的活性。线性引物由于其低特异性和模板链内引发效应（而非从模板3’端引发）注定其不能用于短链RNA检测的引物。茎环引物由于茎环结构的帮助而倾向与目标RNA的3’末端结合，但其比起线性引物至少在启动效率方面并没有优势可言，而且很难实现多引物多通道同时测定。

随着miRNABase v18的发布，我们知道仅在人类就发现超过1500种不同的miRNA。miRNA表达谱越来越复杂，如果在实际应用中不引入较大的改变，用现在的基于茎环结构引物进行多目标检测，操作上越来越难以实现。基于寡聚核苷酸杂交进行的表达谱工作牺牲了灵敏度和精确度。表达谱的结果通常还要再用RT-PCR证实。RT-PCR方法为较少数量的miRNA检测提供了定量、灵敏的方法。但当检测涉及不断增多的miRNA表达谱时，这种方法显然难以处理。miRNA RT-PCR 正逐渐退后担当确认有效的角色。当前，面临miRNA研究的热潮，迫切需要一种准确、高通量的miRNA表达谱检测和分析新技术。 

发明内容

本发明的发明目的之一在于：针对上述存在的问题，提供一种能精确、多目标检测短链RNA的引物。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种用于短链RNA检测的欧米茄结构寡核苷酸引物，其从5’端至3’端依次为：PCR引物目标区、可变编码区、欧米茄茎环、探针间隔区和探针区，其中，所述PCR引物目标区的长度为20-30个碱基，所述可变编码区的长度为0- 50个碱基，所述欧米茄茎环的茎的长度为4-12对配对的碱基，所述配对的碱基为顺式结构方式，顺式结构方式是指欧米茄茎环的功能作用是由其结构所直接决定的，而非间接的通过别的方式进行；所述欧米茄茎环的环的长度为3-20个不配对的碱基，所述探针间隔区的长度为至少1个碱基，所述探针区的长度为4-11个碱基。

其中，实验及理论分析表明，PCR引物目标区之所以选择20-30个碱基，是因为20-30个碱基所构成的引物可以满足用于一般PCR所需要的热力学稳定性和所提供的碱基复杂性足以区分扩增特定的靶分子；同时，欧米茄茎环的环的长度之所以选择3-20个碱基，是因为3个碱基是形成茎环所需的最小碱基数，6-7个碱基所组成的环是最理想的，多于20个碱基会对茎环的形成带来负面影响。

其中一个例子如图1所示的引物，其碱基组成为SEQ.NO:1的序列，5’端到3’端，SEQ. ID NO:1

 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCTCTTTTTAGAGCCATCCTGTCAGT

引物的最5’端是为PCR扩增保留的正义链引物区，即PCR引物目标区；

与所述欧米茄茎环结构5’端上游相邻的区域叫做可变编码区，这个区域的核苷酸数量和种类，只要不影响茎环结构的保持，都可自由调整变化，用来控制终产物的长度和组成，给终产物一个对应的标签以此作为检测不同目标的引物标签（或者叫做代码）；具牢固茎环结构的欧米茄引物保证了编码区可以自由地变化而对引物的引发特性不产生结构性和功能性的影响。线性引物或其它设计的引物都可加入不同长度和组成的核苷酸，但额外核苷酸的加入不可避免对酶反应效率产生负面作用或引起整体结构改变。本发明利用一个牢固的欧米茄茎环将寡核苷酸引物结构上分成两个部分-探针部分和编码部分。结构上的分割允许在编码区加入核苷酸并不会对整体结构或探针杂交能力造成潜在的影响。在编码区增加额外碱基引起的结构张力可以被茎吸收缓冲，并不需要调整变化探针间隔和探针组成。这种长度标注的RT-PCR产物可以进一步用荧光质谱分析，且达到1个碱基的分辨率

所述欧米茄茎环的茎是4-12对配对的碱基的茎状结构，其形成的原理在于设计时在这个区域安排一小段连续的寡核苷酸，自身退火时与同条寡核苷酸链上相邻的一段区域，按照watson-crick碱基配对的原则配对形成局部的双链体（也成为茎），其功能是让引物-RNA双链体在目标RNA的3’端形成，而不是在目标RNA链内的匹配位点形成；

探针间隔区是欧米茄茎环结构和探针区之间的一小段寡核苷酸，它是本发明的欧米茄引物引发功能所必需，至少一个碱基的探针间隔区对酶活性的释放是必需的，最佳的探针间隔区长度根据所用结构中茎的长度、形状和大小不同而不同；

探针区由一小段寡核苷酸序列组成，该序列的设计按watson-crick碱基配对的原则，与目标RNA 3’端的序列互补配对；探针的长度影响灵敏度和链内引发效应。较长的探针可以获得较好的转录灵敏度。

为形成更稳定牢固的结构形式，茎序列和长度可以变化，以获得相同或更佳的效果。如表1 所示，一般来说，随着茎长碱基对增加，引物的结构就越稳定，提供的阻碍空间也变大。但通过对碱基成分的改变，可调节茎长和热力学稳定度之间的关系。例如改变碱基成分能让12对配对的碱基茎长的结构获得类似9 对配对的碱基茎长的热力学稳定性。在对等条件下可提供大得多的阻碍空间。例见表1。

此外，主干链上的修饰被证明可以增强结构稳定性。一个具体的体现是欧米茄茎上不同位置的核苷酸碱基被锁核酸替代，较少的配对碱基就可增强该结构。这种变化足以改变对链内或末端引发阻碍特性的表现。这方面，核糖核酸可以用来替代茎部位的脱氧核糖核酸得到相同或更好的效果。

探针序列直接与目标3’端反向互补，本性上是随意的。探针序列的组成是与特定的目标对应的。有其它几种改变探针的方法达到预期的效果。为提高或降低引发效率和引物二聚化，探针的核苷酸可以用修饰后的核苷酸代替，如锁（LNA）核酸或RNA。对于一个行家能手来说，这些修饰可灵活地运用，来提高整体的转录效率，特异性或克服二聚化以及其它由引物探针序列引起的杂信号。

作为优选：6对配对的碱基茎的RNA和9对配对的碱基茎的DNA是最经济的结构。

本发明的发明目的之二在于，提供上述引物的应用。

所采用的技术方案为：将至少两种引物组成混合物，所述至少两种引物的探针区的碱基序列不同。

作为优选：用于制备包含所述引物的试剂盒。

本发明进一步是关于任何包含欧米茄引物的试剂盒(套件)。本发明提及的任何欧米茄引物可以单独制成商业化产品或作为特定应用的试剂盒组件。

本发明进一步的具体体现是关于利用上述引物设计进行单目标反转录检测，进行短链RNA个体筛选分析，其应用包括但不局限于分子生物学研究，医学诊断，疾病预后和法医鉴定等领域。

本发明另一个具体体现是关于利用上述引物进行多目标反转录检测，进行多目标短链RNA筛选和表达谱分析，其应用包括但不局限于分子生物学研究，医学诊断，疾病预后和法医鉴定等领域。

作为优选：将所述引物用于检测单个短链RNA或者同时检测多个短链RNA。

其原理如图2所示，用本发明的欧米茄引物进行RT-PCR过程中，第一步，为使欧米茄引物与RNA目标位点杂交,将引物与目标RNAs混合；引物探针区与RNA3’端和RNA链内的互补序列区都能配对结合；在RNA 3’端稳固地配对结合形成的双链体可以成为DNA反转录的引发点；而不完整或链内配对结合转化效率很低；最后，为做进一步探测，用目标专一的引物进行PCR，将特定产生的cDNA扩增;

即产生的DNA模板可以进一步用实时定量PCR做单个或同时多个扩增，PCR的产物可以用光谱分析，琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对单个或多个短链RNA进行检测；

产生的DNA模板可以进一步用荧光标记的引物进行PCR扩增，这些PCR产物可以用自动化的DNA测序仪进行DNA长度多态性分析，完成同时对多个短链RNA的检测，

作为优选：所述荧光染料包括但不局限于：6-Fam^TM , 5-Fam^TM, Vic^TM, Hex^TM, Tamra^TM,荧光黄， LiZ^TM, Ned^TM, Pet^TM,青色素3，青色素5，若丹明，德克萨斯红等（Applied Biosystem, Inc的产品商品名为6-Fam^TM , 5-Fam^TM, Vic^TM, Hex^TM, Tamra^TM, LiZ^TM, Ned^TM, Pet^TM）。

也可将已知合成的寡聚核苷酸加入到RNA样本中混合，作为设立内置对照的方法。示踪对照的模板可以由核糖核酸组成，也可以是脱氧核糖核酸组成。

进一步的：所述短链RNA为18-26个核苷酸组成的microRNA和mRNA降解片段，或者为非编码的短链RNA, 降解的 DNA 碎片片段。

本发明的一个具体描述是在单通道检测设置中，目标多聚核苷酸是一种microRNA（miRNA，微小RNA）,加入一种独特的欧米茄引物其探针序列与上述微小RNA 3’末端的序列反向互补配对。两段序列靠近，探针与微小RNA 3’端杂交形成稳定的双链体。然后反转录酶利用微小RNA的序列作为模板，延长核苷酸链，合成DNA。这一步产生单链DNA（ssDNA）。这条单链DNA包含欧米茄引物5’端的序列和微小RNA 3’端反向互补序列。可以进一步通过检测这一DNA来作为显示微小RNA在特定研究样品或样品混合物中的存在和定量的方法学基础。本发明另一些具体的描述是在多通道检测设置中，目标多核苷酸是一组微小RNAs。加入同样数目的欧米茄引物，它们具与各自对应目标微小RNA3’端反向互补的序列。多通道检测中，欧米茄引物是以长度编码或组成编码，为后面的检测提供标识来识别不同的目标。

在本文中“多聚核糖核酸”（“Polynucleotides”）一词指DNA多聚酶的可能底物包括但不局限于DNA，RNA，DNA-RNA杂合物，和修饰后的RNA和DNA等。“RNA”一词指核糖核酸但也包括其它类型的多聚核糖

优选之一，上述的目标多聚核苷酸是非编码短链RNA。非编码短链RNA包括存在于真核细胞中的短链核RNA(snRNA)、短链核仁RNA（snoRNA）和短链非编码RNA (ncRNA)。

优选之一，上述的目标多聚核苷酸是信使RNA（mRNA）和信使RNA断片。信使RNA 被3’端poly（A）和有些，如组蛋白信使RNA是修剪后的poly(U)丛保护。这些鲜明的特征都可以用欧米茄引物检测，并进一步发展成对样品中信使RNA定性和定量的方法。

本发明描述的上述结构引物与已有的引物和线性引物极大不同。不同之处包括：

1. 本发明的欧米茄引物以一个坚固的茎环为结构特征，这个结构可以阻碍酶的接近和维系结构的构造；

2. 本发明的探针间隔是解除酶活性空间阻碍，使酶与探针-目标双链体接近必需的条件；

3. 欧米茄引物阻碍的程度由欧米茄茎的长度和环的大小决定；

4. 本发明的欧米茄引物的结构影响目标位点引物-模板热力学参数；

5. 本发明的欧米茄引物不抑制酶的活性；

6. 本发明的欧米茄引物辨别3’端是否错配的机理在于酶接近的阻碍机制而非依赖增加Tm。

具体的，本发明的引物与线性引物不同之处在于它具有一个特征性的茎环结构作为整个引物结构的稳定器。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：具有本发明的这种结构的引物与线性引物相比，可以提供从RNA 3’端同等引发效能，同时又避免了链内启动和引物二聚体化。因此比起线性引物，在各种检测设置时使用的引物量大大减少；欧米茄引物可以通过防止目标链内引发、抑制引物二聚体形成以及增加探针在3’末端目标杂交精确度，提高转录特异性和灵敏度。在实际应用中，就可以用较少的引物取得较高的RT效率和较好的特异性，同时在一个反应体系中可加入检测不同目标的多个引物，由于引物标签的不同，可以同时区分不同的检测目标而来的PCR产物，从而实现多通道高通量检测，大大提高了检测效率。

附图说明

图1是其中一种欧米茄引物的结构，其中，A：PCR引物目标区或者叫做PCR正义链引物区；B：可变编码区；C：探针间隔区；D：探针区；E：欧米茄茎环；

图2是本发明的欧米茄引物进行miRNA RT-PCR扩增过程示意图；

图3是RNA寡聚链和DNA寡聚链稳定性比较；

图4是本发明的欧米茄引物茎长与探针间隔区的功能实验结果图；

其中，4 nt 板：4对碱基对茎长的欧米茄引物；5 nt 板：5对碱基对茎长的欧米茄引物；6 nt 板：6对碱基对茎长的欧米茄引物；7 nt 板：7对碱基对茎长的欧米茄引物；8 nt 板：8对碱基对茎长的欧米茄引物。条带1.按照文献设计的茎环引物作为对照；条带 2.线性引物；条带 3.无探针间隔的欧米茄引物；条带 4.有1个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 5.有2个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 6.有3个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 7.有4个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 8.有5个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 9.有6个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 10.有7个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 11.有8个碱基探针间隔的欧米茄引物；条带 12.灭菌水作为阴性对照；

图5是探针区长度对反转录效率和链内引发影响的对比图；

图中，A：茎环引物作为反转录引物，B：线性引物作为反转录引物,C：欧米茄引物作为反转录引物；模板的稀释度为1: 3x10⁶/μl； 2: 3x10⁵/μl；3: 1x10⁴/μl；4: 3x10³/μl；5: 水作为阴性对照；

图6是茎环引物，线性引物和欧米茄引物3’末端引发效率和精确度比较结果图；

其中，A：茎环引物作为反转录引物，B：线性引物作为反转录引物,C：欧米茄引物作为反转录引物。模板的稀释度为1: 3x10⁶/μl； 2: 3x10⁵/μl；3: 1x10⁴/μl；4: 3x10³/μl；5: 水作为阴性对照。

图7是欧米茄引物RT-PCR产物片段大小的荧光分析结果图；

图8是二聚化实验结果图；

其中，条带 1：探针区9个碱基的茎环引物；条带 2：探针区9个碱基的线性引物；条带 3：探针区9个碱基，6 对碱基茎长的欧米茄引物；条带 4：探针区10个碱基的茎环引物条带 5：探针区10个碱基的线性引物； 条带 6：探针区10个碱基，6 碱基茎长的欧米茄引物； 7：H₂O 对照.；条带 8：探针区9个碱基的茎环引物； 条带 9：探针区9个碱基的线性引物；条带 10：探针区9个碱基，8对碱基茎长的欧米茄引物； 条带 11：探针区10个碱基的茎环引物；条带 12：探针区10个碱基的线性引物； 条带 13：探针区10个碱基，8 对碱基茎长的欧米茄引物； 条带 14：H₂O 对照。

图9 是单细胞水平检测H1299细胞株RNU44 RNA实验结果图

板1：从10个细胞提取的RNA用10μl反转录（RT）反应体系，RT反应产物用水稀释10倍，取1μl用30μlPCR反应体系扩增。

板2：从1个细胞提取的RNA用10μl反转录（RT）反应体系，RT反应产物用水稀释10倍，取1μl用30μlPCR反应体系扩增。

 

表 1. 不同茎结构的吉布斯自由能分布。对不同茎长度自由能的计算采用mFold程序⁽¹⁰⁾。茎长从4-12对碱基，分别以RNA和DNA两种形式比较。这表明随着茎长碱基对增加，引物的结构就越稳定。人类组蛋白信使RNA的6碱基茎环用作参考。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：RNA寡聚链和DNA寡聚链稳定性比较实验

如图3所示，6对配对的碱基茎的RNA和9对配对碱基茎的DNA是最经济的结构。RNA和DNA的主干链有所不同，对维持二级结构的能量贡献也不相同。随着茎区配对核苷酸增加，吉布斯自由能下降。但是每个添加的碱基对结构稳定的贡献依据它的位置不同而有所不同，例如，4对碱基的凸茎RNA添加一个碱基对，自由能下降 -0.9 kcal/mole（大卡/摩尔），5个碱基的凸茎RNA添加一个碱基对，自由能量下降 -3.6 kcal/mole。6对碱基对的凸茎RNA是最经济的结构，它以最少的核苷酸得到自由能最大收获。6对碱基对的凸茎结构是最常见的RNA结构元素，如组蛋白信使RNA的3’端这种结构代替了polyA尾巴,防止由3’端到5’端的外切核苷酸衰退。miRNA基础配对也仅必需6对核苷酸，它是一个完整螺旋的基本核苷酸数。而对于DNA，8对碱基对或9对碱基对的凸茎才能提供与RNA对应物相当的自由能。

实施例2：本发明的欧米茄引物的探针间隔区的功能实验

设计合成的TPL6其链内一段序列与其3’端序列一样，作为模板。

 

TPL6序列（互补链）：SEQ ID NO:2

用8对碱基对茎长的欧米茄引物来模拟RT反应，斜体字的核苷酸用来做探针间隔区。

用1x TE缓冲液溶解RT引物，浓度为50 μM。加1 μl引物到500 μl H2O稀释，每个RT反应用1 μl稀释后的引物。 用灭菌水对TPL6进行10倍系列稀释，稀释度10⁷ – 10¹²作为模板。 5 μl RT反应体系由1x PCR缓冲液, 0.1xTE, 50 nM 欧米茄引物, 0.05 u/μl Taq DNA 多聚酶和不同稀释度的TPL6模板组成。RT反应的条件是：37℃反应 10 分钟， 20℃反应1分钟和37℃反应10秒交替重复60次，37℃反应30分钟，42℃反应20 分钟，然后保存在4℃。上述反应完后，每管加入25 μl含有PCR正义引物和反义引物的PCR反应主液，最终体积30 μl，组成成分是1x PCR 缓冲液, 0.05 u/μl Taq DNA 多聚酶, 50 μM 每种 PCR 引物。PCR扩增反应条件是：95℃反应4分钟， 95℃反应15秒-61℃反应30秒-72℃反应20秒交替重复30次，95℃反应15秒-61℃反应2 分钟-72℃反应1 分钟交替重复5次，72℃反应10分钟，然后保存在4℃。 PCR产物跑3%的琼脂糖凝胶电泳，条件是1x TB缓冲液，电压100 v跑80分钟，完后照相。结果见图4.

4-8对碱基对不同茎长的欧米茄引物按上述操作进行实验，测试它们的茎长、探针间隔对引发效能的影响。结果总结见图4，合成的TPL1作为Taq DNA 多聚酶的模板模拟反转录反应。对不同茎长的欧米茄引物比较，用Taq DNA 多聚酶延长引物完成DNA合成，随后进行PCR扩增。

一个优化后的6-12个碱基欧米茄茎可以阻碍酶靠近凸茎附近的引物-模版双链体，正如图4证明的，比起相应的线性引物欧米茄引物的DNA多聚反应效率降低。将配对识别的位点一个碱基一个碱基向远离欧米茄茎移动，多聚酶得以接近反应位点，随着探针间隔的延长酶的活性提高。在图4中，忽略链内引发现象，不同长度欧米加茎的引物以线性引物为对照，其引发的多聚反应急剧降低，而随着探针间隔的延长多聚反应改善。这意味着抑制作用发生在欧米茄茎中心区，而探针间隔对空间的扩展可以抵消这种抑制作用。茎的长度越长，抵消酶接近性抑制所需要的探针间隔核苷酸就越多。例如酶活性被8对碱基对的茎完全抑制，但加上5个或更多碱基的探针间隔，酶活性就得以恢复。这表明茎的酶接近阻碍作用被探针到茎结构的距离远近所影响。因此可以推测，探针间隔区加入越多的核苷酸，欧米茄引物的表现就越像它对应的线性引物。

引发检测短链RNA最重要的一项要求就是避免链内引发的发生。随着探针间隔区的过度延长，欧米茄引物除了引物二聚体形成阻抑的特性外，将获得线性引物所有的引发特性。但在一个较窄的范围，比起3’末端的位点，欧米茄茎结构表现出对链内位点更多的抑制作用。欧米茄茎阻碍的范围取决于茎的长度和环的大小尺寸。总之，较长的茎覆盖更大范围的阻碍空间，提供更好的阻碍作用。延长探针间隔，使探针与茎环之间的距离更远将增加引物的链内引发能力，使引物更像是一个线性化的引物。不表现出链内引发的最大探针间隔区碱基数加上探针长度被视为欧米茄茎结构的有效阻碍范围。阻碍范围被用来衡量不同欧米茄茎的链内引发的抑制作用。图4中，8对碱基茎的欧米茄引物的阻碍范围是12个碱基，计算方法是6个碱基的探针间隔区加上6个碱基的探针长度。在这个引物的探针间隔区增加1个碱基就可能出现链内引发现象。这个结果表明链内位点和3’末端位点抑制作用的解除是以不同的程度进行。这种现象的可能解释是探针-目标双链体的稳定性受目标位点位置的影响。

我们认为阻碍酶接近是欧米加引物工作的原理之一。另外欧米茄茎也是引物-模板在3’端位点和链内位点之间产生差异引发的原因。欧米茄茎环对其附近核苷酸的空间构象有很大的影响。由于没有额外的核苷酸处在欧米茄茎构象影响范围，对于3’末端的配对不会有问题。而链内位点非配对的3’端伸进欧米茄茎的构象袋子里，使得在RNAs链中间形成双链体很困难。这种构像的扭曲可以改变欧米茄茎对链内位点和3’端位点的阻碍范围。

实施例3 探针区长度对反转录效率和链内引发影响的对比实验

使用的探针类型是：

A: 茎环引物   + 下列每个板所示的探针

B: 线性引物   + 下列每个板所示的探针

C: 欧米茄引物   + 下列每个板所示的探针

板1-5所用TLP5模板序列是（互补链）：

引物探针序列如下：

板1.  AGT

板2.  AGTC

板3.  AGTCA

板4.  AGTCAG

板5.  AGTCAGT

板6所用模板TLP1-没有链内位点，序列是（互补链）：

探针序列是：

板6.  AGTCAGT

引物用1xTE溶解浓度50 μM，95℃ 10”变性，65℃保持5’，然后冷却至室温。加1 μl引物到500 μl H2O稀释，每个RT反应用1 μl稀释后的引物。用灭菌水对TPL5进行10倍系列稀释，稀释度10⁷ – 10¹²作为模板。 5 μl RT反应体系由1x PCR缓冲液, 0.1xTE, 50 nM 欧米茄引物, 0.05 u/μl Taq DNA 多聚酶和不同稀释度的TPL5模板组成。RT反应的条件是：37℃ 10 分钟， 20℃ 1分钟和37℃ 10秒交替重复60次，37℃ 30分钟，42℃ 20 分钟，然后保存在4℃。上述反应完后，每管加入25 μl含有PCR正义引物和反义引物的PCR反应主液，最终体积30 μl，组成成分是1x PCR 缓冲液, 0.05 u/μl Taq DNA 多聚酶, 50 μM 每种 PCR primer。 PCR扩增反应条件是：95℃ 4分钟， 95℃ 15秒-61℃ 30秒-72℃ 20秒交替重复30次，95℃ 15秒-61℃ 2 分钟-72℃ 1 分钟交替重复5次，72℃ 10分钟，然后保存在4℃。PCR产物跑3%的琼脂糖凝胶电泳，条件是1x TB缓冲液，电压100 v跑80分钟，完后照相。

3-7个碱基长度探针的欧米茄引物按上述操作进行实验，测试它们的茎长、探针间隔对引发效能的影响。结果总结见图5。

探针的长度影响灵敏度和链内引发效应。较长的探针可以获得较好的转录灵敏度。正如图5结果所示，随着探针长度变长，由链内引发RT产生的PCR产物减少。在板6中，当使用没有链内引发位点的模板时，效率会增加。相比之下，由于链内引发位点的存在线性引物的打分就很差。

RT引物在RNA目标3’末端的引发精确度是RT 引物整体可用的关键。图6中，欧米茄引物扩增配对的目标非常好 ，比板3中悬臂错配的引物或板1中截短错配的引物，要好100倍。板3中，线性引物不能区分由悬臂引起的不同。也不奇怪线性引物对截短错配的扩增很低。关于这一点，茎环引物类似线性引物。表明欧米茄引物的优势在于辨别正确的末端，这种性能是多通道检测应用所需要的最重要特征。

实施例4 茎环引物，线性引物和欧米茄引物3’末端引发效率和精确度比较实验

合成的带链内目标识别序列（下列序列中的粗体）的TPL5作为模板，茎环引物、线性引物和欧米茄引物之间从3’端和链内目标序列转录引发的性能和精确度比较。TPL5模板在3’端和链中间都有9个一样的碱基序列，预计都可与引物的探针区配对识别所用引物类型如下：

A: 茎环引物   + 下列每个板所示的探针 

B: 线性引物   +下列每个板所示的探针

C: 欧米茄引物 +下列每个板所示的探针

板 1 – 5所用模板序列是（互补链）：

每个板所用引物的探针序列如下：

板 1.     CAGTCA

板 2.      AGTCAG

板 3.       GTCAGT

板 4.        TCAGTT

板 5.         CAGTTA

引物用1xTE溶解浓度50 μM，95℃ 10”变性，65℃保持5’，然后冷却至室温。 加1 μl引物到500 μl H2O稀释，每个RT反应用1 μl稀释后的引物。用灭菌水对TPL5进行10倍系列稀释，稀释度10⁷ – 10¹²作为模板。5 μl RT反应体系由1x PCR缓冲液, 0.1xTE, 50 nM 欧米茄引物, 0.05 u/μl Taq DNA 多聚酶和不同稀释度的TPL5模板组成。RT反应的条件是：37℃ 10 分钟， 20℃ 1分钟和37℃ 10秒交替重复60次，37℃ 30分钟，42℃ 20 分钟，然后保存在4℃。上述反应完后，每管加入25μl含有PCR正义引物和反义引物的PCR反应主液，最终体积30 ul，组成成分是1x PCR 缓冲液, 0.05 u/μl Taq DNA 多聚酶, 50μM 每种 PCR primer。 PCR扩增反应条件是：95℃ 4分钟， 95℃ 15秒-61℃ 30秒-72℃ 20秒交替重复30次，95℃ 15秒-61℃ 2 分钟-72℃ 1 分钟交替重复5次，72℃ 10分钟，然后保存在4℃。PCR产物跑3%的琼脂糖凝胶电泳，条件是1x TB缓冲液，电压100 v跑80分钟，完后照相。

3-10个碱基长度的探针按上述操作进行实验，测试它们的茎长、探针间隔对引发效能的影响。结果总结见图6，结果表明，欧米茄引物可以分辨目标3’末端的配对和错配，用于板1的杂交探针和靶分子有一个碱基的空位，欧米茄引物可测到1x10⁴个分子，相较于板2中完全配对的欧米茄引物，引发效率降低至少10倍。线性引物和茎环引物对空位配对的区别可达100倍。板3是靶分子突出错配，欧米茄引物的区别能力达100倍。而线性引物和茎环引物均不能区分突出错配。突出错配越多，引物识别能力的差别越大。尽管线性引物和茎环引物对碱基空位错配的识别能力约高于欧米茄引物，但欧米茄引物的综合识别能力明显优于前二者。

实施例5 本发明的欧米茄引物RT-PCR产物片段大小的荧光分析：

用合成的具有链内目标序列的上述的TPL5作为模板，比较欧米茄引物从3’端和链内目标序列转录引发的性能。荧光标记PCR引物，扩增产生的产物用Abi Prizm 310 Genetic Analyzer（基因分析仪）测定。对链内启动和末端启动产生的PCR产物片段大小分离和定量分析。结果如图7所示，表明在做多样品测定时，片段大小的分辨率可达到1个碱基。

实施例6 引物二聚化对比实验

比较6个碱基茎的欧米茄引物和8个碱基茎的欧米茄引物对二聚体化的抑制能力。不加入模板但将引物放入DNA多聚酶反应体系。结果如图8所示：6对碱基茎的欧米茄引物扩增的二聚体用箭头A标示；条带10和条带13中没有引物二聚体扩张带，即8对碱基茎的欧米茄没有引物二聚体扩增带，表明引物二聚体化能被8对碱基茎欧米茄引物的茎环抑制。线性引物扩增二聚体用箭头B标示，表明与欧米茄引物具有相同的探针区的线性引物，相同条件下出现了二聚体，扩增的欧米茄引物单聚体用箭头C标示；可以看出，本发明的牢固的茎环结构可防止引物二聚体化。

实施例7 单细胞水平检测H1299细胞株中RNU44 RNA

测试的引物如下：

1. LS143，茎环引物（对照），SEQ ID NO:16

CTAGAATACCTCGTGGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAG AGTCAGTTAG              

2. LS16，8对碱基茎-4个碱基的探针间隔-6个碱基的探针，  SEQ ID NO:17

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTC-GTCAGT     

3. LS61，8对碱基茎-5个碱基的探针间隔-6个碱基的探针，SEQ ID NO:18

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-GTCAGT     

4. LS62，8对碱基茎-6个碱基的探针间隔-6个碱基的探针，SEQ ID NO:19

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCCT-GTCAGT

5. LS64，8对碱基茎-8个碱基的探针间隔-6个碱基的探针，SEQ ID NO:20 

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCCTAT-GTCAGT   

6. LS63，8对碱基茎-6个碱基的探针间隔-7个碱基的探针，SEQ ID NO:21

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCCT-AGTCAGT     

7. LS139，8对碱基茎-5个碱基的探针间隔-7个碱基的探针，SEQ ID NO:22

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGT     

8. LS140，8对碱基茎-5个碱基的探针间隔-8个碱基的探针，SEQ ID NO:23

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGTT    

9. LS141，8对碱基茎-5个碱基的探针间隔-9个碱基的探针，SEQ ID NO:24

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGTTA   

10.LS142，8对碱基茎-5个碱基的探针间隔-10个碱基的探针，SEQ ID NO:25

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGTTAG  

11.LS147，8对碱基茎-5个碱基的探针间隔-10个碱基的探针，SEQ ID NO:26

GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACgCTTTTTTTAGcGTGCC-ATTCC-AGTCAGTTAG 

12.H₂O

欧米茄引物反转录引发的效能用H1299细胞株单细胞提取的总RNA进行比较。

H1299细胞用RPMI+10% FBS培养液培养。细胞用Trypsin-EDTA液处理收集，在PBS液中计数。然后细胞在37℃用含0.4 u/μl  proteinase K和2 u/μl  Rnase Inhibitor的细胞裂解液裂解20分钟。 Protenase K在75℃灭活10分钟。相当于10个细胞、1个细胞、0.1个细胞、0.01个细胞、0.001个细胞量的总RNA作为检测RNU44的模板。上述RT引物用50 μM in 1xTE溶解，95℃变性10秒钟，65℃保持5分钟，然后冷却到室温。 每种引物取1μl 用500 μl H2O稀释，取1 μl稀释后的引物加入到每个10ul的RT反应体系中。RT反应的条件是：37℃ 10 分钟， 20℃ 1分钟和37℃ 10秒交替重复60次，37℃ 30分钟，42℃ 20 分钟，然后保存在4℃。取1μl RT反应的产物加入到30ul的含PCR正义和反义引物的反应体系中，Taq DNA polymerase最终浓度为0.05 u/μl 每种PCR引物浓度为50 μM。 PCR扩增反应的条件是： 95℃ 4分钟， 95℃ 15秒-61℃ 30秒-72℃ 20秒交替重复30次，95℃ 15秒-61℃ 2 分钟-72℃ 1 分钟交替重复5次，72℃ 10分钟，然后保存在4℃。PCR产物用3% agarose 胶，用1x TB 缓冲液，电泳条件为100 v，80 min.。最后观察照相。

每个RT引物都扩增出专一的RNU44单条带。除了约60bp的引物单聚体，欧米茄引物没有引物二聚体和非特异信号的出现。相反，在stem loop对照和水对照出现引物二聚体和非特异信号。用优化后的欧米茄RT引物，可以成功检测来自0.5-0.00005个细胞RNA中的RNU44 RNA。如图9所示，8对碱基茎加上6个碱基的探针间隔加上6个碱基探针的欧米茄引物给出最好的分辨率。从H1299细胞中扩增RNU44 RNA的结果与用合成的模拟模板所做的结果是吻合的。