多功能选择器阀、具有多功能选择器阀的全自动多功能液相色谱装置和用该装置分析样本的方法

摘要

本发明涉及一种可以用于在液相色谱装置中使用的多功能选择器阀，更具体地涉及一种具有多端口的多功能选择器阀，在多功能选择器阀的一部分上，所述多端口可以连接到样本隔离柱的两个端部，并且该多功能选择器阀包括：流体通过模式，导入的流体在没有通过样本隔离柱的情况下被排出；柱通过模式，导入的流体通过样本隔离柱被排出；以及流体闭塞模式，防止流体进入内部。而且，使用本发明的多功能选择器阀使得能够借助改变其流体移动通过而在反相液相色谱装置上根据需要实现在线胶溶功能、一维隔离功能和二维隔离功能。

说明书

技术领域

以下公开内容涉及一种多功能选择阀。更具体地，以下公开内容涉及这 样的多功能选择阀，其改变溶剂的流动，以使得除了一维分离、二维分离和 在线消解的功能之外，可以在反相液相色谱系统中执行磷酸肽提取的可选功 能。以下公开内容涉及包括多功能选择阀的全自动多功能液相色谱系统和用 于使用该液相色谱系统分析样本的方法。

背景技术

在线固相提取/毛细管反相液相色谱借助其分离的高效率，在研究蛋白质 组方面已经用作非常重要的技术系统。具体地，这允许生物物质的痕量的有 效分离，并使得由于被分析物固相相互作用的宽频谱而能够实现蛋白质的痕 量的高效识别。

作为用于分析蛋白质的方法，基于质谱法的方法已经用作蛋白质组研究 的标准分析平台。方法(诸如鸟枪法或自底向上法)的典型示例包括在通过 质谱仪进行分析之前将蛋白质水解成肽。这样的水解增加了生物样本的溶解 度并产生了可以电离且在质谱仪中容易检测到的肽段。

然而，前述方法不可避免地增加了样本的复杂性。例如，在最简单的蛋 白质组之一(酵母蛋白质组)的情况下，从约6,000个表达的蛋白质产生 300,000或更多个肽段。因此，为了克服在分析具有巨大复杂性的样本时的 欠采样问题，已经开发了包括在线/离线多维蛋白质识别技术的各种方法 (Link，A.J.，Eng，J.，Schieltz，D.M.，Carmack，E.，et al.，Nat.Biotechnol. 1999，17，676-682；Chen，E.I.，Hewel，J.，Felding-Habermann，B.，Yates，J.R. III，Mol.Cell.Proteomics 2006，5，53-56)。然而，仍需要液相色谱柱的效率和 灵敏度的改进。在此背景下，已知当分离柱的内径减小同时保持其长度时， 基于液相色谱/质谱法的分析的灵敏度可以快速增加(Kim，M.-S.，Choie，W. -S.，Shin，Y.S.，Yu，M.H.，Lee，S.-W.，Bull.Korean Chem.Soc.2004，25， 1833-1839)。

此外，在包含大量的清洁剂和盐的生物样本的情况下，在线脱盐操作是 在质谱法之前所需的必要过程。这是因为这样的杂质中断了要通过质谱仪分 析的肽样本的电离，导致了肽样本的质谱检测灵敏度的下降。因此，考虑到 时间节省和样本损失，在线脱盐比离线脱盐更适合。

同时，根据现有技术的反相液相色谱系统仅具有通过用固相提取柱使样 本脱盐和浓缩的一维分离功能。甚至在通过使用在线链接到反相液相色谱系 统的强阳离子交换色谱系统进行二维分离功能的二维反相液相色谱系统的 情况下，由于相互干扰而难以执行精确分析。另外，这样的系统必须需要多 个溶剂进给泵，由此其由于用于控制泵的多个阀而具有复杂结构。此外，还 具有在线消解功能和磷酸肽的在线富集的这样的二维在线反相液相色谱系 统之前从未报导或展示过。

发明内容

本公开的一个实施例针对于提供一种多功能选择阀，利用该多功能选择 阀反相液相色谱系统实现了：能够脱盐和样本浓缩的反相一维分离的功能； 能够通过将使用样本分离柱的一维分离与反相二维分离链接来增加分离效 率的二维分离功能的功能；能够通过在溶剂中生成高压力而将蛋白质消解成 肽的在线消解的功能；以及通过使用二氧化钛柱选择性地提取磷酸肽的功 能。

本公开的另一实施例针对于提供一种全自动多功能液相色谱系统，其仅 使用一个溶剂进给泵并允许上述功能的自动化，以使得可以通过选择阀的简 单操作选择性地执行每个功能。

本公开的又一实施例针对于提供一种用于通过使用上述自动化多功能 液相色谱系统有效地分析样本的方法。

在一个普通方面，提供了一种具有多个端口的多功能选择阀，在多功能 选择阀的一部分处样本分离柱的两个端部可以连接到所述多个端口，多功能 选择阀包括：

流体通过模式，其中导入到多功能选择阀的流体不通过样本分离柱， 而是被排出；

柱通过模式，其中导入到多功能选择阀的流体通过样本分离柱，然后 被排出；以及

流体阻挡模式，其中防止流体导入。

根据一个实施例，多功能选择阀的多个端口可以包括进口端口、出口端 口、各自链接到样本分离柱的每个端部的第一样本分离柱连接端口和第二样 本分离柱连接端口、以及与其它端口选择性地流体连通的多个选择端口，以 实现上述模式。

根据另一实施例，在流体通过模式下，进口端口可以与出口端口流体连 通；在柱通过模式下，进口端口可以与第一样本分离柱连接端口流体连通， 并且出口端口可以与第二样本分离柱连接端口流体连通；并且在流体阻挡模 式下，进口端口和出口端口可以彼此流体中断。

根据另一实施例，多功能选择阀的多个可选端口可以包括第一、第二和 第三选择端口；在流体通过模式下，第二选择端口可以与第三选择端口流体 连通，并且第二样本分离柱连接端口可以与第一选择端口流体连通；在柱通 过模式下，第二选择端口可以与第三选择端口流体连通；并且在流体阻挡模 式下，第一样本分离柱连接端口可以与第二选择端口流体连通，第二样本分 离柱连接端口可以与第三选择端口流体连通，并且第一选择端口可以与出口 端口流体连通。

在另一普通方面，提供了一种具有多个端口的多功能选择阀，在多功能 选择阀的一部分处样本分离柱的两个端部可以连接到所述多个端口并且在 多功能选择阀的另一部分处二氧化钛柱的两个端部可以连接到所述多个端 口，多功能选择阀包括：

流体通过模式，其中导入到多功能选择阀的流体不通过样本分离柱和二 氧化钛柱；

柱通过模式，其中导入到多功能选择阀的流体通过样本分离柱，然后 被排出；

流体阻挡模式，其中防止流体导入；以及

二氧化钛柱通过模式，其中导入到多功能选择阀的流体通过二氧化钛 柱，然后被排出。

根据一个实施例，多功能选择阀的多个端口可以包括进口端口、出口端 口、各自链接到样本分离柱的每个端部的第一样本分离柱连接端口和第二样 本分离柱连接端口、各自链接到二氧化钛柱的每个端部的第一二氧化钛柱连 接端口和第二二氧化钛柱连接端口、以及与其它端口选择性地流体连通的多 个选择端口，以实现上述模式。

根据另一实施例，在流体通过模式下，进口端口可以与出口端口流体连 通；在柱通过模式下，进口端口可以与第一样本分离柱连接端口流体连通， 并且出口端口可以与第二样本分离柱连接端口流体连通；在流体阻挡模式 下，进口端口和出口端口可以彼此流体中断；并且在二氧化钛柱通过模式下， 进口端口可以与第一二氧化钛柱连接端口流体连通，并且出口端口可以与第 二二氧化钛柱连接端口流体连通。

根据又一实施例，多个选择端口可以包括第一、第二和第三选择端口； 在流体通过模式下，第一选择端口可以与第二二氧化钛柱连接端口流体连 通，并且第二选择端口可以与第三选择端口流体连通；在柱通过模式下，第 一选择端口可以与第二二氧化钛柱连接端口流体连通，并且第二选择端口可 以与第三选择端口流体连通；在流体阻挡模式下，可以封闭第一二氧化钛柱 连接端口；并且在二氧化钛柱通过模式下，第一选择端口可以与第一样本分 离柱连接端口流体连通，并且第三选择端口可以与第二样本分离柱连接端口 流体连通。

根据又一实施例，样本分离柱可以是强阳离子交换柱、弱阴离子交换柱、 亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱和强阳离子交换-弱阴离子交换混合柱中 的任一个。

在又一普通方面，提供了一种全自动多功能液相色谱系统，包括：

样本进口阀，被导入要分析的样本；

疏水阀，其与固相提取柱和反相液相色谱柱流体连通；

根据实施例的多功能选择阀，其布置在从样本进口阀引向疏水阀的流动 路径中；以及

连接阀，其将从样本进口阀排出的流体选择性地提供给多功能选择阀或 疏水阀。

根据一个实施例，液相色谱系统还可以包括：溶剂进给泵，其将溶剂提 供给样本进口阀或连接阀。T形溶剂划分管可以连接到溶剂进给泵以将溶剂 选择性地提供给样本进口阀或连接阀。

根据又一实施例，样本进口阀可以包括样本进口端口、样本出口端口、 经由样本存储环彼此链接的第一样本存储环连接端口和第二样本存储环连 接端口、溶剂进口端口、以及溶剂出口端口。此外，样本进口阀可以包括： 第一模式，其中样本进口端口与第一样本存储环连接端口流体连通，并且第 二样本存储环连接端口与样本出口端口流体连通；以及第二模式，其中第一 样本存储环连接端口与溶剂出口端口流体连通，并且第二样本存储环连接端 口与溶剂进口端口流体连通。

根据又一实施例，连接阀可以包括第一进口端口、第二进口端口、第一 连接端口、第二连接端口、第一出口端口和第二出口端口。此外，连接阀可 以包括：第一模式，其中第一进口端口、第一连接端口、第二连接端口和第 一出口端口以顺序的方式彼此流体连通；以及第二模式，其中第二进口端口、 第二连接端口、第一连接端口和第二出口端口以顺序的方式彼此流体连通。

根据又一实施例，连接阀可以包括在流体连通的端口之间形成的Z形流 动路径。

根据又一实施例，当多功能选择阀处于流体通过模式时，进行样本的一 维分离的功能；当多功能选择阀处于柱通过模式时，进行样本的二维分离的 功能；当多功能选择阀处于流体阻挡模式时，进行在线消解的功能；并且当 多功能选择阀处于二氧化钛柱通过模式时，进行提取磷酸肽的功能。

根据又一实施例，疏水阀可以包括与固相提取柱连通的固相提取柱连接 端口、与反相液相色谱柱连通的反相液相色谱柱连接端口、第一进口端口、 第二进口端口、经由样本传送环链接到固相提取柱连接端口的样本传送环连 接端口、以及出口端口。

根据又一实施例，疏水阀可以包括：第一模式，其中固相提取柱连接端 口与第一进口端口流体连通，并且样本传送环连接端口与出口端口流体连 通；以及第二模式，其中反相液相色谱柱连接端口与固相提取柱连接端口流 体连通，并且第二进口端口与样本传送环连接端口流体连通。

根据又一实施例，样本进口阀的溶剂出口端口可以与连接阀的第一进口 端口流体连通，连接阀的第一出口端口可以与多功能选择阀的进口端口流体 连通，多功能选择阀的出口端口可以与疏水阀的第一进口端口流体连通，并 且连接阀的第二出口端口可以与疏水阀的第二进口端口流体连通。

根据又一实施例，注入到固相提取柱的样本的方向可以与朝向反相液相 色谱柱洗脱的样本的方向相反。

根据又一实施例，溶剂选择阀可以被布置在溶剂进给泵中以提供第一溶 剂、或第一溶剂与第二溶剂的混合溶剂。

在又一普通方面，提供了一种用于通过使用根据实施例的全自动多功能 液相色谱系统分析样本的方法，该方法包括：

(a)将要分析的样本注入到样本进口阀；

(b)按照使得样本进口阀与多功能选择阀流体连通的模式来设置连 接阀，并且将多功能选择阀设置为流体通过模式；

(c)将样本的第一溶剂导入样本进口阀，使得第一溶剂注入到疏水 阀的固相提取柱；以及

(d)改变连接阀的模式以使得样本进口阀与疏水阀流体连通，并且 将第一溶剂与第二溶剂的混合溶剂导入样本进口阀以使得混合溶剂注入 到疏水阀的固相提取柱。

根据一个实施例，在步骤(d)中通过固相提取柱的混合溶剂进一步通 过反相液相色谱柱以使得分析样本。

根据另一实施例，该方法还可以包括：在步骤(c)期间将多功能选择 阀的模式改变为柱通过模式。

根据又一实施例，该方法还可以包括：在将多功能选择阀的模式改变为 柱通过模式之后，将多功能选择阀的模式改变为二氧化钛柱通过模式。

在又一普通方面，提供了一种用于通过使用根据实施例的全自动多功能 液相色谱系统分析样本的方法，该方法包括：

(a)将要分析的样本注入到样本进口阀；

(b)按照使得样本进口阀与多功能选择阀流体连通的模式来设置连 接阀，并且将多功能选择阀设置为流体阻挡模式；

(c)将样本的第一溶剂导入样本进口阀，使得第一溶剂具有增加的 压力；以及

(d)将多功能选择阀的模式改变为流体通过模式并且将第一溶剂注 入到疏水阀的固相提取柱；以及

(e)改变连接阀的模式以使得样本进口阀与疏水阀流体连通，并且 将第一溶剂与第二溶剂的混合溶剂导入样本进口阀以使得混合溶剂注入 到疏水阀的固相提取柱。

根据一个实施例，在步骤(e)中通过固相提取柱的混合溶剂进一步通 过反相液相色谱柱以使得分析样本。

根据另一实施例，该方法还可以包括：在步骤(d)期间将多功能选择 阀的模式改变为柱通过模式。

根据又一实施例，该方法还可以包括：在将多功能选择阀的模式改变为 柱通过模式之后，将多功能选择阀的模式改变为二氧化钛柱通过模式。

根据实施例的多功能选择阀改变溶剂的流动路径，并由此允许反相液相 色谱系统实现以下功能：能够脱盐和样本浓缩的一维分离的功能；能够通过 将使用样本分离柱的一维分离与反相二维分离链接来增加分离效率的二维 分离功能的功能；以及能够通过在溶剂中生成高压力而将蛋白质消解成肽的 在线消解的功能。此外，反相液相色谱系统可以实现通过使用二氧化钛柱选 择性地提取磷酸肽的功能。

此外，根据实施例的全自动多功能液相色谱系统可以在仅使用一个溶剂 进给泵的情况下执行一维分离的功能、二维分离的功能、在线消解功能和提 取磷酸肽的功能。

此外，根据实施例的用于分析样本的方法可以使用上述全自动多功能液 相色谱系统，根据需要通过将一维分离的功能、二维分离的功能、在线消解 功能和提取磷酸肽的功能相互组合来有效地执行样本的分析。

根据以下详细的描述和权利要求，其它特征和方面将会明显。

附图说明

根据结合附图的以下详细描述，公开的示例性实施例的以上和其它方 面、特征和优点将会更明显，在附图中：

图1a是示出了根据实施例的多功能选择阀的不同模式的示意图；

图1b是示出了根据另一实施例的多功能选择阀的不同模式的示意图；

图2a是示出了在样本注入到根据实施例的全自动多功能液相色谱系统 期间每个阀的配置的示意图；

图2b是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行在线 消解期间每个阀的配置的示意图；

图2c是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行一维 分离期间每个阀的配置的示意图；

图2d是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行二维 分离期间每个阀的配置的示意图；

图2e是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行磷酸 肽的提取期间每个阀的配置的示意图；

图2f是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行样本 分析期间每个阀的配置的示意图；

图3a和图3b示出了在通过使用根据实施例的全自动多功能液相色谱系 统分别进行烯醇酶肽的一维分离和二维分离之后获得的色谱；

图4a和图4b示出了在通过使用根据实施例的全自动多功能液相色谱系 统分别进行酵母肽的二维分离和一维分离之后获得的色谱；以及

图5a和图5b示出了在通过使用根据实施例的全自动多功能液相色谱系 统分别进行β-酪蛋白肽的一维分离和磷酸肽提取之后获得的色谱。

具体实施方式

根据下文提到的、参照附图的实施例的以下描述，本公开的优点、特征 和方面将变得明显。然而，本公开可以以不同形式实施并且不应理解为限于 这里提到的实施例。而是，提供这些实施例以使得本公开将会透彻和完整， 并且将向本领域普通技术人员全面地传达本公开的范围。这里使用的术语仅 用于描述具体实施例的目的，而并非意在限制示例性实施例。如这里使用的， 单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在同样包括复数形式，除非上下文另 有清楚地指示。还应理解，本说明书中所使用的术语“包括”和/或“包含” 指定所阐述的特征、整体、步骤、操作、元件、和/或部件的存在，但并不排 除一个或更多个其它特征、整体、步骤、操作、元件、部件、和/或它们的组 合的存在或添加。

在一个方面，提供了多功能选择阀300。如图1a所示，多功能选择阀 300包括：进口端口301、出口端口307、各自链接到样本分离柱310的每个 端部的第一样本分离柱连接端口302和第二样本分离柱连接端口303、以及 与其它端口选择性地流体连通的第一选择端口304、第二选择端口305和第 三选择端口306。

多功能选择阀300可以被布置在从向其注入样本的样本进口阀引向疏水 阀的流动路径中，反相液相色谱柱进行注入的样本的分析。

根据实施例的多功能选择阀300可以包括通过修改端口之间的连接得到 的以下三种模式。

第一模式是流体通过模式，其中从样本进口阀排出的流体被导入并排 出到疏水阀。在流体通过模式下，如图1a(a)所示，进口端口301与出口端口 307流体连通。这里，第二样本分离柱连接端口303可以与第一选择端口304 流体连通，并且第二选择端口305可以与第三选择端口306流体连通。因此， 在这些情况下，从样本进口阀导入的流体不通过样本分离柱310，而经由进 口端口301和出口端口307被直接排出到疏水阀。

第二模式是柱通过模式，其中从样本进口阀排出的流体通过样本分离柱 310，然后被排出到疏水阀。图1a(b)示出了柱通过模式下的端口之间的连接。 换言之，进口端口301与第一样本分离柱连接端口302流体连通，并且第二 样本分离柱连接端口303与出口端口307流体连通。这里，第二选择端口305 和第三选择端口306可以彼此流体连通。因此，导入到多功能选择阀300的 流体顺序地通过进口端口301、第一样本分离柱连接端口302、样本分离柱 310、第二样本分离柱连接端口303和出口端口307，然后向疏水阀排出。

第三模式是流体阻挡模式，其中防止从样本进口阀排出的流体导入多功 能选择阀300。如图1a(c)所示，在流体阻挡模式下，进口端口301和出口端 口307彼此流体中断。因此，从样本进口阀排出的流体在多功能选择阀300 的入口处被阻挡。根据流体阻挡模式的一个实施例，第一样本分离柱连接端 口302与第二选择端口305流体连通，第二样本分离柱连接端口303与第三 选择端口306流体连通，并且第一选择端口304与出口端口307流体连通， 以防止流体导入进口端口301。

如下文中描述的，多功能选择阀的流体通过模式允许液相色谱系统实现 一维分离的功能，柱通过模式允许二维分离，并且流体阻挡模式允许包括通 过增加溶剂的压力将蛋白质消解成肽状态的在线消解。端口的上述数目和连 接仅是说明性的，并且本公开的范围不限于此，只要端口可以引导或封闭导 入到多功能选择阀/从多功能选择阀排出的流体的流动路径即可。

同时，样本分离柱310可以是能够通过与反相液相色谱柱结合来进行二 维分离的任何柱。例如，强阳离子交换(SCX)柱、弱阴离子交换(WAX) 柱、亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱、或强阳离子交换-弱阴离子交换 (SCX-WAX)混合柱可以用作样本分离柱。

图1b是示出了根据另一实施例的多功能选择阀的不同模式的示意图。

如图1b所示的多功能选择阀可以链接到除了样本分离柱310之外的二 氧化钛柱311。因此，除了上述功能之外，可以通过使样本通过二氧化钛柱 311进行磷酸肽的选择性提取。

换言之，如图1b所示的多功能选择阀包括(除了如图1a所示的多功能 选择阀之外)与二氧化钛柱311的两个端部连接的第一二氧化钛柱连接端口 308和第二二氧化钛柱连接端口309。因此，下文中，将关于图1b的多功能 选择阀的与图1a的多功能选择阀的构造不同的构造来描述图1b的多功能选 择阀。

图1b(a)示出了流体通过模式，其中进口端口301与出口端口307流体 连通。提到选择端口，第一选择端口304与第二二氧化钛柱连接端口309流 体连通，并且第二选择端口305与第三选择端口306流体连通。

图1b(b)示出了柱通过模式，其中进口端口301与第一样本分离柱连接 端口302流体连通，并且出口端口307与第二样本分离柱连接端口303流体 连通。选择端口的构造与图1(a)相同。

图1b(c)示出了流体阻挡模式，其中封闭第一二氧化钛柱连接端口308。

图1b(d)示出了二氧化钛柱通过模式，其中进口端口301与第一二氧化 钛柱连接端口308流体连通，并且出口端口307与第二二氧化钛柱连接端口 309流体连通。提到选择端口，第一选择端口304与第一样本分离柱连接端 口302流体连通，并且第二选择端口305与第三选择端口306流体连通。

可以使用选择端口的任何组合，只要其连接允许每种模式。

下文中，将描述根据实施例的包括多功能选择阀300的全自动多功能 液相色谱系统。可以实现如图1b所示的多功能选择阀，同时其包括如图1a 所示的多功能选择阀的所有功能。因此，为了方便，以下描述将基于如图1b 所示的具有九个端口的多功能选择阀300。

如图2a所示，根据实施例的全自动多功能液相色谱系统包括：

样本进口阀100，被导入要分析的样本；

疏水阀400，其与固相提取柱410和反相液相色谱柱420流体连通；

多功能选择阀300，其布置在从样本进口阀引向疏水阀的流动路径 中，并且链接到样本分离柱310以及可选地链接到二氧化钛柱311；以及

连接阀200，其将从样本进口阀排出的流体选择性地提供给多功能选 择阀300或疏水阀400。

图2a是示出了样本注入期间阀的配置的示意图。

样本进口阀100允许导入要分析的样本，并且包括样本进口端口101、 样本出口端口102、经由样本存储环107彼此链接的第一样本存储环连接端 口103和第二样本存储环连接端口104、溶剂进口端口105、以及溶剂出口 端口106。

图2a示出了样本注入期间的样本进口阀。这里，样本进口端口101与 第一样本存储环连接端口103流体连通、并且样本出口端口102与第二样本 存储环连接端口104流体连通，使得样本可以通过样本进口端口101导入到 样本存储环107。如果给定的样本浓度被判定为太低，则样本存储环107允 许使用者通过多次重复样本注入来获得足够的样本浓度。

样本存储环107可以具有1μL到10μL的容积。当样本存储环107具有 小于1μL的容积时，样本处理会是难的。另一方面，当样本存储环具有大于 10μL的容积时，要花费太长时间注入样本。

此外，样本进口阀100包括样本出口端口102，其允许过量的样本排出， 以使得样本存储环107能够以上面指定的容积范围接收样本。

在完成如上所述的样本导入之后，样本进口阀100的模式开关(未示出) 用于将操作模式从第一模式(图2a)转换成第二模式(图2b)。

在样本进口阀100的第二模式下，第一样本存储环连接端口103与溶剂 出口端口106流体连通，并且第二样本存储环连接端口104与溶剂进口端口 105流体连通。

根据一个实施例的全自动多功能液相色谱系统还可以包括用以将溶剂 提供给样本进口阀100或连接阀200的溶剂进给泵500。

溶剂进给泵500可以在5,000磅/平方英寸到20,000磅/平方英寸的压强 下提供溶剂。当压强低于5,000磅/平方英寸时，分解会由于柱的可用长度减 小而退化。另一方面，当压强高于20,000磅/平方英寸时，溶剂会从阀泄露。

从溶剂进给泵500提供的溶剂可以是第一溶剂、或第一溶剂与第二溶剂 的混合溶剂。为此，溶剂进给泵500设置有溶剂选择阀(未示出)，其提供 第一溶剂或包含预定比率的第一溶剂和第二溶剂的混合溶剂。

此外，T形溶剂划分管501可以链接到溶剂进给泵500以将溶剂选择性 地提供给样本进口阀100或连接阀200。

图2b是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行在线 消解期间每个阀的配置的示意图。

经由溶剂进给泵，将第一溶剂从溶剂进口端口导入到样本进口阀100。 由于第一溶剂的液压，存储在样本存储环107中的样本通过溶剂出口端口106 被排出，并到达连接阀。

连接阀200可以包括第一进口端口201、第二进口端口202、第一连接 端口203、第二连接端口204、第一出口端口205和第二出口端口206。

由于连接阀200的第一进口端口201与样本进口阀100的溶剂出口端口 106流体连通，所以从溶剂进给泵导入的第一溶剂通过连接阀，同时其与样 本一起顺序地通过第一进口端口201、第一连接端口203、第二连接端口204 和第一出口端口205。这里，如图2b所示，连接阀具有在彼此流体连通的端 口之间形成的Z形流动路径。

通过连接阀200的第一溶剂经由与连接阀200的第一出口端口205流体 连通的多功能选择阀的进口端口301，到达多功能选择阀。这里，多功能选 择阀300的每个端口处于上述流体阻挡模式的配置中。换言之，通过封闭第 一二氧化钛柱连接端口308而使进口端口301和出口端口307彼此流体中断。 如上所述，可以按照使得多功能选择阀300的进口端口301和出口端口307 彼此流体中断的方式而无任何特定限制地实现流体阻挡模式。

因此，第一溶剂可以不通过多功能选择阀300，并由此第一溶剂的压力 增大得越来越多。以这种方式，通过在传送溶剂的情况下阻挡溶剂的流动以 生成高压来进行将蛋白质在线消解成肽状态。在这种情况下，在线消解表明， 随着溶剂压力增加效率越高。因此，第一溶剂的压力可以增加到阀的可能最 高压力。

在进行了在线消解之后，可以进行一维分离以执行脱盐和样本的浓缩。 图2c是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行一维分离 期间每个阀的配置的示意图。

如图2c所示，允许多功能选择阀300的进口端口301和出口端口307 彼此流体连通以执行一维分离。因此，从进口端口导入的溶剂不通过样本分 离柱310，而经由出口端口排出到疏水阀400。

疏水阀400可以包括与固相提取柱410流体连通的固相提取柱连接端口 402、与反相液相色谱柱420流体连通的反相液相色谱柱连接端口406、第一 进口端口401、第二进口端口404、经由样本传送环407连接到固相提取柱 连接端口的样本传送环连接端口403、以及出口端口405。此外，疏水阀400 的第一进口端口401与多功能选择阀300的出口端口307流体连通。

通过多功能选择阀300的第一溶剂到达疏水阀400。此时，疏水阀的每 个端口具有这样的配置，其中第一进口端口401与固相提取柱连接端口402 流体连通，并且样本传送环连接端口403与出口端口405流体连通。

因此，从多功能选择阀300与第一溶剂一起传送的样本借助于第一进口 端口401、经由固相提取柱连接端口402通过固相提取柱410。用箭头标记 示出了导入到多功能选择阀的样本的流动方向。

固相提取柱410直接连接到固相提取柱连接端口402。固相提取柱410 具有50μm-500μm的内径和1cm-4cm的长度。这样的长度显著小于传统的 固相提取柱。由于固相提取柱即使在约10,000磅/平方英寸的非常高的压强 下操作也具有这样的小长度，所以可以在分离样本时使分解度最大。此外， 如下文所描述的，可以进一步改进分解度，因为到反相液相色谱柱的样本注 入方向和样本洗脱方向彼此相反。

根据一个实施例，内部减压器的不锈钢衬里用作固相提取柱410，并且 诸如C18材料的材料被填塞到该柱中。然后，利用具有约2μm的孔隙尺寸 的不锈钢筛网(screen)来封闭柱的两个端部以防止填塞材料从柱排出。以 这种方式，提供了可以抵抗这样的高压的坚固的固相提取柱。

同时，可以通过以0.5μL/分钟到10μL/分钟的流速排出的第一溶剂来控 制通过第一溶剂的液压导入到固相提取柱410的样本的流速。此外，出口端 口405还排出样本中包含的盐成分，从而完成高效脱盐。

下文中，将描述二维分离功能，并且二维分离功能能够在通过允许第一 溶剂通过样本分离柱来分馏样本之后增加样本的脱盐和浓缩的效率。

图2d是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行二维 分离期间每个阀的配置的示意图。

为了进行二维分离功能，将多功能选择阀300从流体通过模式转换成柱 通过模式，而样本进口阀100、连接阀200和疏水阀400处于与一维分离功 能的实施例相同的配置中。换言之，如图2d所示，在柱通过模式下，进口 端口与第一样本分离柱连接端口302流体连通，并且出口端口307与第二样 本分离柱连接端口303流体连通。因此，导入到多功能选择阀300的第一溶 剂通过样本分离柱310，然后发送给疏水阀400。以这种方式，可以在完成 样本分馏之后进一步增加使样本脱盐和浓缩的效率。

下文中，将描述磷酸肽提取功能，并且磷酸肽提取功能允许第一溶剂通 过二氧化钛柱，使得可以选择性地提取磷酸肽。

图2e是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行磷酸 肽的提取期间每个阀的配置的示意图。

为了进行磷酸肽提取功能，将多功能选择阀300从柱通过模式转换成二 氧化钛柱通过模式，而样本进口阀100、连接阀200和疏水阀400处于与二 维分离功能的实施例相同的配置中。换言之，如图2e所示，在二氧化钛柱 通过模式下，进口端口301与第一二氧化钛柱连接端口308流体连通，并且 出口端口307与第二二氧化钛柱连接端口309流体连通。因此，导入到多功 能选择阀300的第一溶剂通过二氧化钛柱311，然后发送给疏水阀400。以这 种方式，可以选择性地提取样本中的磷酸肽。

目前为止，描述了这样的过程，其包括：通过样本进口端口101导入样 本以将预定量的样本存储在样本存储环107中、以及通过使用第一溶剂进行 样本的在线消解、一维分离和二维分离以及磷酸肽提取。

下文中，将详细地描述以下过程，其包括：通过使用第二溶剂将导入到 固相提取柱410的样本分离以及分析该样本。

图2f是示出了在根据实施例的全自动多功能液相色谱系统中进行样本 分析期间每个阀的配置的示意图。

参照图2f，虽然分析了样本，但是样本进口阀100处于这样的状况下： 使得溶剂进口端口105和溶剂出口端口106中断，并且通过溶剂划分管510 导入的溶剂可以不通过样本进口阀100而直接提供给连接阀200。换言之， 在样本分析期间，样本进口阀100的每个端口处于与样本注入步骤相同的配 置中。

样本分析中使用的溶剂是第一溶剂与第二溶剂的混合溶剂。通过改变两 种溶剂的混合比率，可以通过溶剂梯度分离样本。

此外，在连接阀200中，第二进口端口202、第二连接端口204、第一 连接端口203和第二出口端口206顺序地彼此流体连通，使得在连通的端口 之间形成Z形流动路径。

连接端口200的第二出口端口206与疏水阀400的第二进口端口404流 体连通，使得通过连接阀200的混合溶剂不会通过多功能选择阀300而发送 给疏水阀400。

按照使得反相液相色谱柱连接端口406与固相提取柱连接端口402流体 连通且第二进口端口404与样本传送环连接端口403流体连通的方式，对疏 水阀400进行模式的改变。因此，通过第二进口端口404的混合溶剂借助样 本传送环407传送给固相提取柱410，然后借助固相提取柱连接端口402和 反相液相色谱柱连接端口406通过反相液相色谱柱420。这里，用箭头标记 表示向反相液相色谱柱420洗脱的样本的流动方向(或混合溶剂的流动方 向)，其与导入到固相提取柱的样本的流动方向(或第一溶剂的流动方向) 相反。以这种方式，可以进一步改进样本分离的分解力。

在随时间改变从溶剂进给泵500提供的混合溶剂的第一溶剂与第二溶剂 的比率的情况下，进行固相提取柱410中的样本的分离。换言之，随着混合 溶剂中的第二溶剂的比例增加，附着到固相提取柱410的样本的脱离度增加， 并且具有这样的增加的脱离度的样本被导入到反相液相色谱柱420，然后被 分离以执行分析。

第一溶剂与第二溶剂的各种组合可以用于完成上述目的。作为非限制性 示例，0.1％甲酸水溶液和90％乙腈水溶液可以分别用作第一溶剂和第二溶 剂。简言之，溶剂的这种选择取决于以下事实：混合溶剂中的乙腈的比例越 高导致附着到固相提取柱的样本的脱离度越高。

样本被分离的反相液相色谱柱420可以具有10μm-150μm的内径和 10cm-150cm的长度。反相液相色谱柱420连接到质谱仪，用于后续分析的 目的。

如上文中所描述的，根据实施例的全自动多功能液相色谱系统通过使用 样本进口阀100、连接阀200、多功能选择阀300和疏水阀400，根据需要选 择性地进行一维分离功能、二维分离功能、在线消解功能和磷酸肽提取功能。 虽然上述实施例通过使用第一溶剂进行在线消解功能、一维分离功能、二维 分离功能和磷酸肽提取功能的全部，然后通过使用混合溶剂进行样本分离和 分析，但是可以根据需要使用任何组合。例如，在另一实施例中，可以在通 过使用混合溶剂进行样本分离和分析之前单独地或与二维分离功能结合地 执行一维分离功能。在又一实施例中，可以首先进行在线消解，然后可以选 择性地进行一维分离功能或二维分离功能。此外，除了上述功能的每个功能 之外，可以执行磷酸肽提取功能。

示例

现在将描述示例和实验。以下示例和实验仅用于说明的目的，并非意在 限制本公开的范围。

工具

作为第一溶剂，使用0.1％甲酸水溶液(可从德国达姆施塔特的Merck 公司商购)。此外，包含0.1％甲酸的100％乙腈(可从美国新泽西的菲利普 斯堡的J.T.Baker公司商购)用作第二溶剂。

通过利用C18材料填塞熔融石英毛细管来制造固相提取柱(75μm的内 径×360μm的外径×3cm的长度)。在填塞完成之后，在保持12,000磅/平方英 寸的压强的情况下，对柱进行5分钟的超声破碎。使柱在使用之前逐渐减压， 使得防止C18填塞材料分散。此外，在填塞柱之前，衬里的前部填充有熔块 填塞材料，并且其后部用不锈钢筛网(孔隙尺寸：2μm)封闭。

通过用C18键合的颗粒的浆料填塞熔融石英毛细管来制造毛细管柱(反 相液相色谱柱)(75μm的内径×360μm的外径×80cm的长度)(Shen，Y.，Moore， R.J.，Zhao，R.，Blonder，J.，et al.，Anal.Chem.2003，75，3596-3605；Shen，Y.， Tolic N.，Masselon，C.，Pasa-Tolic L.et al.，Anal.Chem.2004，76，144-154； Shen，Y.，Smith，R.D.，Unger K.K.，Kumar，D.，Lubda，D.，Anal.Chem.2005， 77，6692-6701)。

在填塞完成之后，在保持12,000磅/平方英寸的压强的情况下，对柱进 行5分钟的超声破碎。使柱在使用之前逐渐减压，使得防止C18填塞材料分 散。此外，在填塞柱之前，衬里的前部填充有熔块填塞材料，并且其后部用 不锈钢筛网(孔隙尺寸：2μm)封闭。

通过利用(新泽西的克利夫顿的Whatman公司的)5μm的Partisphere 强阳离子交换树脂的浆料填塞柱而获得用作样本分离柱的示例(150μm的内 径×360μm的外径×15cm的长度)的强阳离子交换柱。在填塞完成之后，在 保持10,000磅/平方英寸的压强的情况下，对柱进行5分钟的超声破碎。使 柱在使用之前逐渐减压，使得防止填塞材料分散。此外，在填塞柱之前，衬 里的前部填充有熔块填塞材料，并且其后部用不锈钢筛网(孔隙尺寸：2μm) 封闭。

通过在5,000磅/平方英寸的压强的情况下利用具有10μm尺寸的(日本 东京的GL Sciences公司的)二氧化钛颗粒的浆料填塞柱而获得二氧化钛柱 (150μm的内径×360μm的外径×10cm的长度)。在填塞完成之后，在保持 5,000磅/平方英寸的压强的情况下，对柱进行5分钟的超声破碎。使柱在使 用之前逐渐减压，使得防止填塞材料分散。此外，在填塞柱之前，衬里的前 部填充有熔块填塞材料，并且其后部用不锈钢筛网(孔隙尺寸：2μm)封闭。

同时，反相液相色谱系统连接到质谱仪，该质谱仪是配备有纳米电喷雾 电离接口的7-特斯拉傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(ThermoFinnigan公 司的FTICR，LTQ-FT)。

示例1

样本

作为要分析的样本，使用与焙烤酵母隔离的烯醇酶(可从美国密苏里的 圣路易斯的Sigma-Aldrich商购)。通过使用(美国威斯康辛的麦迪逊的 Promega公司的)测序级修改的猪胰蛋白酶(Sequencing Grade Modified  Porcine Trypsin)对样本进行预处理以经由蛋白质消解过程获得肽。样本浓 度为20ng。

结果评估

使用根据实施例的多功能液相色谱系统对浓度为20ng的烯醇酶样本进 行一维分离。换言之，0.1％甲酸水溶液用作第一溶剂，烯醇酶样本被发送给 固相提取柱并通过反相色谱法而分离。图3a是在利用质谱仪分离和检测之 后的样本的色谱。在进行三次测试之后，获得可高再现的结果。此外，示出 了分离表明高分解度。

同时，图3b示出了在进行二维分离之后的同一样本的结果。在图3b中， 上面的5个图示出了在顺序地改变第一溶剂(500mM的醋酸铵水溶液、乙 腈水溶液、或其混合物)的组分的情况下使用强阳离子交换柱的二维分离的 结果，并且最下方的图示出了一维分离的结果。如图3b所示，一维分离的 整体结果符合二维分离的结果。

示例2

样本

为了执行更复杂的蛋白质组样本的分析，使用酵母的全部溶解产物的被 胰蛋白酶分解的肽。这里使用的酵母蛋白质组是酿酒酵母、Y 2805(MAT  pep::his3 prb1-D1.6R can1 his1-200 ura3-52)和AF2(HMLa或HMRa ho  ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3，112 his3-11，15 ura3-1 ssd1)的单倍体菌株(Kim， M.-S.，Choie，W.-S.，Shin，Y.S.，Yu，M.H.，Lee，S.-W.，Bull.Korean Chem. Soc.2004，25，1833-1839)。在这种情况下，蛋白质被分解成100mM的碳酸 氢铵水溶液，向其添加胰蛋白酶，并且在37℃下进行水解作用24小时。生 成的产物通过使用SPeedVac系统(SPD1010；美国纽约的胡尔伯克的 ThermoSavant公司)被完全干燥，然后在-20℃下存储用于后续实验。酵母 肽样本具有20μg的浓度。

评估结果

使用根据实施例的多功能液相色谱系统对浓度为20μg的烯醇酶样本进 行一维分离和二维分离。图4a示出了在顺序地改变第一溶剂(500mM的醋 酸铵水溶液、乙腈水溶液、或其混合物)的组分的情况下使用强阳离子交换 柱进行二维分离之后的同一样本的结果。图4b示出了使用作为第一溶剂的 包含0.1％甲酸的100％乙腈的组分中的梯度的一维分离的结果。与一维分离 的结果相比，二维分离的结果提供了每个分区中的更大数目的峰。这使人想 到二维分离的结果允许增加数目的肽的确定。从前述内容可以看到，二维分 离增加了一维分离的信息能力并改进了分析的效率。

示例3

样本

作为要分析的样本，使用β-酪蛋白(可从美国密苏里的圣路易斯的 Sigma-Aldrich商购)。通过使用(美国威斯康辛的麦迪逊的Promega公司的) 测序级修改的猪胰蛋白酶对样本进行预处理以经由蛋白质消解过程获得肽。 样本浓度为50ng。

结果评估

使用根据实施例的多功能液相色谱系统对样本进行一维分离和磷酸肽 提取。图5a示出了在使用作为第一溶剂的包含0.1％甲酸的100％乙腈的组 分中的梯度进行一维分离后同一样本的结果。图5b是在磷酸肽的选择性提 取之后获得的图，其中通过使用包含0.1％三氟乙酸和乳酸的80％乙腈作为 第一溶剂，使样本通过二氧化钛柱以仅允许磷酸肽附着到柱上，并且通过利 用300mM的碳酸氢铵水溶液洗脱磷酸肽，来进行磷酸肽提取。如图5a所 示，一维分离示出磷酸肽的存在，但是它们的峰由于其它峰而不清楚。然而， 如图5b所示，当使β-酪蛋白肽通过二氧化钛柱时，仅选择性提取了磷酸肽。

如从前述内容可以看到的，本公开提供了多功能阀、包括该阀的多功能 液相色谱系统、以及用于使用该系统分析样本的方法。

虽然已经关于具体实施例描述了本公开，但是本领域技术人员将明白可 以在不背离如所附权利要求限定的本公开的精神和范围的情况下做出各种 修改和变更。