一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法

摘要

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体的说是一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法。利用SEQ ID NO：1所示的序列、SEQ ID NO：2所示的序列和带有选择标记的外源基因构建的DNA重组片段，将其插入克隆载体并导入亚心型扁藻细胞，转化后经培养筛选获得转基因亚心型扁藻。采用本发明的亚心型扁藻叶绿体稳定表达系统，可实现外源基因在亚心型扁藻叶绿体中的稳定和高效表达，并大量积累目的蛋白，对其藻种的品种改良以及基因工程产品开发都具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体的说是一种构建亚心型扁藻 叶绿体表达系统的方法。

背景技术

在能进行光合作用的真核细胞中，细胞核、叶绿体和线粒体三种细胞 器均含有DNA分子，构成了既独立又相互联系的遗传体系。自20世纪70 年代基因工程技术诞生以来，向细胞核导入外源基因的转化技术已经得到 普遍应用。然而随着研究的深入发展，人们逐渐认识到核基因组中的基因 工程操作有着如下难以克服的困难：1.细胞核基因组庞大，背景复杂；2.导 入的外源基因随机插入到核基因组中；3.外源基因表达效率低，且表达不 稳定；4.有时外源基因的插入会引起其它性状的变异，从而影响其经济价 值；5.安全性不好，外源基因容易扩散等。这些问题严重制约着外源基因 转化技术的改进及其在实践中的应用。

1988年，Boynton等构建了莱茵衣藻的叶绿体稳定转化体系，首次证 明了叶绿体转化的可行性。在此之后，叶绿体转化技术在烟草等高等植物 中得到了广泛应用。与核转化相比，叶绿体转化技术具有如下特点：1.外 源基因可以定向插入；2.外源基因表达效率高、变异小；3.叶绿体基因 组属于原核表达系统，便于遗传操作；4.生物安全性高。

叶绿体转化系统包括以下三个关键因素：1)同源片段：叶绿体转化基 于同源重组的原理，在叶绿体表达载体时，外源基因两侧各具有一段叶绿 体的同源片段，长度约1Kb左右，较长的同源片段有利于同源重组的发生。 2)选择标记基因：由于叶绿体自身的结构与遗传特点，选择标记的选择与 使用与核转化明显不同，也是影响叶绿体转化效率的关键因素。3)叶绿体 基因表达调控序列：外源基因需要能够在叶绿体中起作用的原核型启动子 和终止子，来保障外源基因整合后在叶绿体中的稳定和高效表达。

亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)，又名亚心型四爿藻 (Tetraselmis subcordiformis)，是一种海洋单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻 门(Chlorophyta)，青绿藻纲(Prasinophyceae)，扁藻属(Platymonas)。亚 心型扁藻具有重要的应用价值，是应用于鱼、对虾、贝类等养殖中的重要 饵料微藻，其多糖含量非常高，具有抗肿瘤活性，还可作为油脂代谢调控 的贮藏物质来源。另外，亚心型扁藻还可进行光合产氢，在解偶联剂CCCP 的诱导下，其产氢效率可达50±3ml/l。

尽管目前尚缺乏对亚心型扁藻叶绿体基因组序列的了解，但参照高等 植物以及其它单细胞绿藻的相关研究，可以有把握地推测，亚心型扁藻叶 绿体中编码许多与光合固碳、油脂代谢等重要过程相关的基因，因此，在 亚心型扁藻中构建叶绿体表达系统可以为其遗传改造提供有力的工具，工 程藻株有望在构建高效微藻反应器(生产高值蛋白、油脂或氢气)、开发口 服型渔药等方面发挥独特优势。特别是，亚心型扁藻细胞中只有一个巨大 的杯型叶绿体，这一结构也有利于叶绿体遗传转化体系的建立，其技术关 键是发展叶绿体同源整合平台，以及可在叶绿体内进行筛选的相关机制， 最终实现外源基因在叶绿体基因组中的整合与稳定表达。但至目前为止， 亚心型扁藻遗传转化研究仅限于核基因组操作，叶绿体基因组操作研究领 域尚属完全空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种构建亚心型扁藻叶绿体表达系统的方法：

利用SEQ ID NO：1所示的序列、SEQ ID NO：2所示的序列和带有选择 标记的外源基因构建的DNA重组片段，将其插入克隆载体如pMD-18T，p Bluscript KS，pBluescript SK+，并导入亚心型扁藻细胞，转化后经培养筛选 获得转基因亚心型扁藻。

所述利用的SEQ ID NO：1所示的序列采用由SEQ ID NO：1所示的序列 3’端起始，向5’端延伸至不小于1kb的连续片段所代替。

所述利用的SEQ ID NO：2所示的序列采用由SEQ ID NO：2所示的序列 5’端起始，向3’端延伸至不小于1kb的连续片段所代替。

所述带有选择标记的外源基因为外源叶绿体启动功能的启动子、终止 子和选择标记的DNA片段。其中外源叶绿体启动功能的启动子和终止子， 可以来源于模式衣藻的叶绿体基因组，或者来源于研究较清楚的高等植物 叶绿体，如拟南芥，烟草，或油菜等。

所述选择标记基因为草丁膦抗性基因bar基因。

所述筛选试剂为除草剂草丁膦。

本发明方法成功构建了亚心型扁藻的叶绿体稳定表达系统。通过本发 明能够有效的将外源基因重组到亚心型扁藻的叶绿体基因组中，并通过筛 选获得转基因藻株。与现有技术相比，本发明实现了亚心型扁藻基因工程 技术的重点突破，具有如下有益效果：

1、本发明提供用于亚心型扁藻叶绿体转化的叶绿体基因组序列。

2、本发明利用亚心型扁藻对除草剂草丁膦的敏感性，采用一种可行的 选择标记基因-选择压力组合(bar基因-草丁膦)用于叶绿体转化体系的构 建，依靠在叶绿体中表达翻译的抗性蛋白帮助转化子在除草剂筛选压力下 存活是本发明的又一技术特点。

3、本发明能将外源基因定点整合到亚心型扁藻的叶绿体基因组上，并 能实现外源基因的稳定表达。

4、本发明能使外源基因在亚心型扁藻叶绿体中高效表达，并能大量积 累目的蛋白。

5、本发明能在亚心型扁藻叶绿体中同时表达多个外源基因。

6、本发明利用叶绿体遗传表达的原核性质，外源重组DNA可以是多 顺反子，操作简便，表达效率高。

附图说明

图1为本发明实施例提供的含有本发明的同源重组片段的亚心型扁藻 叶绿体基因组DNA片段。其中1-1608bp下划线标注部分，为16S-trnI区 域的片段，即SEQ ID NO：1；1629-3729bp斜体标注部分，为trnA-23S区 域的片段，即SEQ ID NO：2。

图2为本发明实施例提供的质粒p64D物理图谱。

图3为本发明实施例提供的质粒pSVbar物理图谱。

图4为本发明实施例提供的质粒pPSCB物理图谱。

图5为本发明实施例提供的PCR产物电泳图(其中引物为5’atpA for 和3’rbcL rev，泳道1-11为草丁膦抗性藻株；泳道12为野生型藻株；泳道 M为分子标记DL2000)。

图6为本发明实施例提供的PCR产物电泳图(其中引物为con-16s for 和con-23s-rev，泳道1为空白对照；泳道2为野生型藻株；泳道3和4为 阳性转基因藻株；泳道5为质粒pPSCB；泳道M为分子标记DL2000)。

图7为本发明实施例提供的转基因亚心型扁藻Southern杂交图，(其 中泳道1为野生型藻株；泳道2和3为阳性转基因藻株；泳道4为质粒 pPSCB)。

具体实施方式

本发明获得的亚心型扁藻叶绿体转化藻株，是指利用基因枪法或珠磨 法等其他直接导入方法，将含有本发明的亚心型扁藻叶绿体同源重组片段 的载体导入亚心型扁藻叶绿体中，通过同源重组，将带有外源基因的外源 DNA片段定点插入到亚心型扁藻叶绿体基因组中，特别是trnI和trnA之间 的间隔区。

下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细 说明。

实施例：实现除草剂抗性基因在亚心型扁藻叶绿体中的稳定表达

一、亚心型扁藻两段叶绿体同源重组片段的扩增与克隆

设计并合成如下两对引物

P1：5’-CGGGGTACCTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(下划线为 Kpn I酶切位点)

P2：5’-GCGTCGACTTGAGGCAAATGGGCTATGC-3’(下划线为 Sal I酶切位点)

P3：5’-TTGCGGCCGCACAACGGAGTTTCGGAATA-3’(下划线为 Not I酶切位点)

P4：5’-CGAGCTCCGTTACTCAAACCGACATTC-3’(下划线为Sac I 酶切位点)

其中引物P1和P2的扩增产物是SEQ ID NO：1，即片段16S-trnI；引物 P3和P4的扩增产物是SEQ ID NO：2，即片段trnA-23S(参见图1)。

以亚心型扁藻基因组总DNA为模板，经引物P1和P2进行PCR扩增， 反应程序为：94℃10min预变性；94℃1min，50℃90sec，72℃90sec， 共30个循环；72℃10min延伸。PCR扩增产物约为1288bp，即为片段 16S-trnI，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化 的PCR产物用Kpn I和Sal I酶切，与经过同样酶切的pBluescript SK载体 (Sigma公司)连接，获得含有片段16S-trnI的重组质粒pSK16I。

以亚心型扁藻基因组总DNA为模板，经引物P3和P4进行PCR扩增， 反应程序为：94℃10min预变性；94℃1min，50℃100sec，72℃100sec， 共30个循环；72℃10min延伸。PCR扩增产物约为1405bp，即为片段 trnA-23S，将片段经琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化 的PCR产物用Not I和Sac I酶切，与经过同样酶切的pSK16I连接，获得 含有片段trnA-23S和片段16S-trnI的重组质粒pSK16I/A23。

上述获得的重组质粒pSK16I/A23上，两段插入序列trnA-23S和16S-trnI 之间有一段多克隆位点，包括Sal I、EcoRV、BamH I和Xba I等，可以 继续插入外源DNA片段。

二、含有除草剂草丁膦抗性基因(bar)的亚心型扁藻叶绿体定点转化 载体pPSCB的构建

载体pPSCB的构建是以上述重组质粒pSK16I/A23为基础的。载体 pPSCB的构建过程分为3步。首先，设计并合成以下引物。

5’atp A for：5’-GCGTCGACAAGCTTATCGATGACTTTATTAG-3’(下划 线为Sal I酶切位点)

5’atp A rev：5’-CCGATATCGGACATTTTCACTTCTGGAGT-3’(下划线 为EcoRV酶切位点)

Bar for：5’-CCGATATCATGAGCCCAGAACGACGCC-3’(下划线为 EcoRV酶切位点)

Bar rev：5’-CGGGATCCTCATCAAATCTCGGTGACGGG-3’(下划线为 BamH I酶切位点)

3’rbcL for：5’-CGGGATCCGTACTCAAGCTCGTAACGAAG-3’(下划 线为BamH I酶切位点)

3’rbcL rev：5’-GCTCTAGAGGATCGCACTCTACCGATT-3’(下划线为 Xba I酶切位点)

其中，引物5’atpA for和5’atpA rev的扩增产物是5’atpA，为来源于莱 茵衣藻叶绿体的具有叶绿体启动功能的启动子；引物3’rbcL for和3’rbcL rev 的扩增产物是3’rbcL，为来源于莱茵衣藻叶绿体的具有叶绿体启动功能的 终止子；引物Bar for和Bar rev的扩增产物是bar基因，为草丁膦抗性基因。

质粒p64D为模式藻种莱茵衣藻的叶绿体转化载体，由中国农业科学院 生物技术所所得(质粒图谱参见附图2)。这个载体上有叶绿体启动功能的 启动子5’atpA和终止子3’rbcL。质粒pSVbar(质粒图谱参见附图3)含有 草丁膦抗性基因bar基因，其构建过程为：载体pSV40LacZ经Sac II酶切、 回收、补平；载体pGEM/bar经Nco I和Ncot I酶切、回收小片段(带有 bar基因)、补平；T4连接酶连接上述大小片段，其中载体pSV4LacZ和 pGEM/bar均购自Clotech公司。

以质粒p64D为模板，经引物5’atpA for和5’atpA rev进行PCR扩增， 扩增产物即为莱茵衣藻叶绿体启动功能的启动子片段，PCR反应程序 为：94℃5min预变性；94℃1min，50℃40sec，72℃50sec，共30个循 环；72℃10min延伸，产物为668bp。琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天 根公司试剂盒)纯化的PCR产物用Sal I和EcoR V酶切，与经过同样酶切 的上述pSK16I/A23连接，获得含有莱茵衣藻叶绿体启动功能的启动子的重 组质粒pSK1623atp。

以质粒p64D为模板经引物3’rbcL for和3’rbcL rev进行PCR扩增，扩 增产物即为莱茵衣藻叶绿体启动功能的终止子；PCR反应程序为94℃5min 预变性；94℃1min，50℃30sec，72℃40sec，共30个循环；72℃10min 延伸，产物为450bp。琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒) 纯化的PCR产物用BamH I和Xba I酶切，与经过同样酶切的上述 pSK1623atp连接，获得重组莱茵衣藻叶绿体启动功能的终止子的质粒 pSK1623-53。

以质粒pSVbar为模板经引物Bar for和Bar rev进行PCR扩增，扩增产 物即为草丁膦抗性基因bar基因，PCR反应程序为94℃5min预变性；94℃ 1min，50℃30sec，72℃40sec，共30个循环；72℃10min延伸，产物为 560bp。琼脂糖凝胶电泳后，经胶回收(天根公司试剂盒)纯化的PCR产 物用EcoRV和BamH I酶切，与经过同样酶切的pSK1623-53连接，获得含 有草丁膦抗性基因bar基因的重组质粒pPSCB(质粒图谱见附图4)。质粒 pPSCB上，在片段3’rbcL与trnA-23S之间有Cla I和Not I等多克隆位点， 用以插入外源基因。

三、基因枪转化法将质粒pPSCB导入亚心型扁藻

在转化前1h，取浓度约为5.0×10⁵cell ml^-1的对数生长期的亚心型扁藻 藻液，离心力6000g离心5min，弃上清，用f/2培养液调整浓度到1×10⁸cell ml^-1。然后取0.2ml藻液涂在f/2固体培养平板的中央，呈直径约3cm的圆 形。涂好的平板置于超净工作台中备用。

微粒子弹的制备：取50μL金粉悬浮液(约含3mg金粉)边涡旋边加 入5μL质粒(质粒浓度＞＝1μg μL^-1)，50μL 2.5M CaCl₂，20μL 0.1M亚 精胺。然后继续涡旋3min。离心5-6sec，弃上清。然后用250μL无水乙 醇洗两次，最后用60μL无水乙醇重悬。这样一管包被了质粒的微粒子弹 可用于5-6次轰击。

在无菌条件下(超净工作台中)，用高压氦气式基因枪进行轰击。

轰击后，藻细胞先在固体培养平板上黑暗条件下培养8h，然后再转到 f/2培养液中继续培养40h，使细胞生长状态得以恢复。

四、叶绿体转化藻株的获得

经过恢复培养的亚心型扁藻细胞，转到选择性培养液中，以杀死未转 化的藻细胞。选择性培养液即为含有15μg ml^-1草丁膦的f/2培养液。15d 后，对照组细胞全部死亡，实验组仍有活的藻细胞。将培养液以6000g离 心5min，弃上清。收集到的藻体涂布到含有15μg ml^-1草丁膦的f/2固体培 养平板上，使抗性的藻细胞分散生长，得到抗性单藻落。约培养20d后， 平板上长出单藻落。再将单藻落挑出，并划线到含有5μg ml^-1草丁膦的f/2 固体培养平板上，使抗性藻落进一步纯化并增强抗性。20d后，挑取单藻 落至f/2培养液中继续培养约20d，6000g离心5min，收集藻体，每个藻 体湿重＞＝100mg，然后置于液氮中冷冻备用。

提取转基因亚心型扁藻的基因组总DNA，用以进行分子鉴定。首先用 PCR方法来鉴定质粒的整合情况。PCR中使用的上游引物为5’atpA for，下 游引物为3’rbcL rev，产物为包括5’atpA和3’rbcL在内的bar基因表达盒。 PCR反应程序为：94℃10min预变性；94℃1min，55℃100sec，72℃110 sec，共30个循环；72℃10min延伸。PCR产物约为1700bp(参见图5)。 在一部分抗性亚心型扁藻基因组中扩增到了这个片段，在未转化的亚心型 扁藻中均未发现该片段。

然后在SEQ ID NO：13’端附近和SEQ ID NO：25’端附近分别设计并合 成引物，引物序列如下：

con-16s for：ACAAGCAACGGGCTATTA；

con-23s rev：TTTAGGCTGTTCCCATTT。

这对引物con-16s for和con-23s rev在野生型亚心型扁藻基因组总DNA 中扩增到包括trnI-trnA的片段，长度约为500bp；在实现同质化的转基因 亚心型扁藻基因组总DNA中，扩增到trnI-5’atpA-bar-3’rbcL-trnA的片段， 长度约为2000bp。

以阳性转基因藻的全基因组DNA为模板，以引物con-16s for和 con-23s-rev进行PCR扩增。PCR反应程序为：94℃10min预变性；94℃1 min，50℃110sec，72℃120sec，共30个循环；72℃10min延伸。PCR 产物经电泳分离有两条带，一条约为2000bp，另一条约为500bp(参见图 6)。较长的条带说明bar基因的通过同源重组插入到亚心型扁藻叶绿体基 因组中，插入位点为片段SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间的间隔区位 置。

PCR有阳性结果的转基因亚心型扁藻样品，要继续进行Southern杂交 鉴定。每个样品的基因组总DNA至少4μg。Southern杂交探针是来源于地 高辛标记的质粒pPSCB上bar基因内部的一段序列。杂交结果显示，一部 分草丁膦抗性藻株的基因组，杂交后出现了一条约550bp的条带，与质粒 酶切后的条带大小一致，而未转化的藻株的基因组中没有这个条带(参见 图7)，这表明在一些阳性藻株中，质粒pPSCB已经整合到叶绿体基因组 中。

上述所得亚心型扁藻叶绿体表达系统可用于构建微藻反应器，高效生 产工业及医药用重组蛋白，例如酶、药用蛋白及疫苗。由于亚心型扁藻是 一种应用非常广泛的饵料藻，也可以通过在叶绿体中高效表达抗菌药物或 生长激素，并经口服饲喂，以实现新型渔药的开发。另外，还可应用本系 统对叶绿体编码的内源基因进行定点修饰，从而调控光合固碳、以及油脂 代谢的通路与终端产物，获得表达新性状的工程藻株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上 述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改 变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。