一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA试剂盒及应用

摘要

本发明属于动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。具体涉及一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及应用。本发明试剂盒包括抗甲型H1亚型流感病毒血凝素的保藏号为CCTCC C201106的单克隆抗体包被的酶标板，辣根过氧化物酶标记甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体为二抗。公开了甲型H1亚型流感病毒的分离、扩增、灭活和纯化方法及甲型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及纯化方法。还公开了甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。具体地说，本发明涉及一种甲型H1亚型流感 病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒及其在猪群中甲型H1亚型流感病毒抗原检测的应用。

背景技术

1975年，Kohler G和Milstein C在Nature杂志上发表了细胞融合法建立杂交瘤技术，创建了具有划时 代意义的杂交瘤单克隆抗体技术。经克隆后产生结构和各种特性完全相同的高纯度抗体，称为单克隆抗体 (Monoclonal Antibody，McAb)，简称单抗。单克隆抗体技术的发现和使用，对现代生命科学研究的发展 起到了巨大的推动作用，已经成为生物技术领域的一个重要方面。迄今，该技术的应用已经广泛应用于基 础研究、疾病诊断、治疗、预防等方面。

2009年6月世界卫生组织宣布对甲型(H1N1)流感的警戒级别升至6级，意味着甲型(H1N1)流感 的世界性大流行已形成。最近一次流感的世界性大流行起源于墨西哥，一开始被称为猪流感(Swine flu)， 后根据病毒的分析，改称为猪源性流感病毒感染(swine origin influenza virus infection，简称S-OIV  infection)，最后为了与人的季节性流感A(H1N1)区别，改称新流感A(H1N1)，在我国则称为甲型H1N1流 感。甲型H1N1流感对人及动物的健康造成巨大的影响，而且对经济造成了巨大的损失。

1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免 疫吸附法(Enzyme Linked ImmunosrbentAssay，简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量 反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成 为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗 原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体 反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有 洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测 迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。(焦奎等.酶联 免疫分析技术及应用[M].北京：化学工业出版社，2004，84～141；李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及 应用[J].湖北职业技术学院学报，2003，4(6)：65～69)

酶标记抗体技术是ELISA检测方法的关键技术，本发明中所用的酶标记抗体是本实验室自行生产抗甲 型H1亚型流感病毒血凝素单克隆抗体，经过辣根过氧化物酶(简称HRP)标记，具有很高的酶活性，产 量高及成本低。

发明内容

本发的的主要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测 试剂盒，以解决猪群中甲型H1亚型流感病毒抗原的检测。

本发明的第一个目的是得到一种特异性强的可用于组装ELISA试剂盒的核心试剂的抗甲型H1亚型流 感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是建立一种甲型H1亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法

本发明的第三个目的是组装一种甲型H1亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA检测试剂盒。

本发明的第四个目的是利用该试剂盒在猪群甲型H1亚型流感病毒抗原检测中的应用。

本发明是这样实现的：

申请人所在的华中农业大学农业微生物国家重点实验室病毒室从猪群中分离得到的一株甲型H1亚型 流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株，该毒株于2011年1月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培 养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：V201105。

申请人制备了一种特异性强的单克隆抗体，它是抗甲型H1亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆 抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株5F7，于2011年1月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201106。

申请人利用所述的单克隆抗体制备成双抗体夹心ELISA核心试剂，组装了一种用于快速检测适用于猪 群的甲型H1亚型流感病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。本发明的试剂盒是由盒体和包含在盒体内的样品 稀释液、洗涤液、底物A液、底物B液、终止液，阳性对照样品和阴性对照样品组成。

更详细的技术方案如下所述。

抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备，它包括下列步骤：

1)以从猪群中分离得到的一株保藏编号为CCTCC NO：V201105的甲型H1亚型流感病毒 A-Influ/JML-F9为抗原，经过扩增、灭活和纯化，对5-8周龄BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中 心)进行免疫。

2)细胞融合，取经加强免疫后的BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)的脾脏，与新鲜制备 的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)融合。

3)利用血凝抑制法(HI)(肖金晖等.RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医 学，2005，5：401～402)，筛选出分泌抗甲型H1亚型亚型流感病毒血凝素(HA)抗体的阳性孔。对筛选出来 的阳性孔立刻用有限稀释法(但汉并等.H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进 展，2006，27(8)：67～69)进行克隆、筛选。经过3～5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗甲型H1亚型流感 病毒血凝素(HA)蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株(保藏编号为CCTCC NO：C201106)。

4)腹水的制备，取雌5-6周龄BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐 剂0.5ml/只，5天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制(HI)法检测腹水效价， -70℃保存。

5)将保藏编号为CCTCC NO：C201106单克隆抗体进行纯化和标记。

上述抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)经过纯化和标记后可用于制备检测甲型H1亚型流感 病毒的双抗体夹心ELISA试剂盒。

与现有技术相比本发明具有如下显著优点：

1、本发明的试剂盒能直接对甲型H1亚型流感病毒进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短， 检测样品范围宽(鸡胚尿囊液、内脏组织匀浆液)的特点。

2、本发明的试剂盒适用于对甲型H1亚型猪流感病毒进行检测，对经典H1亚型猪流感病毒不反应， 具有特异性。

3、本发明的试剂盒适用于对甲型H1亚型流感病毒进行检测，而对其它亚型的流感病毒，如：经典 H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒，则不反应，具有很好的特异性。

4、本发明将所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒 稳定性好、保存期长，在4℃条件下放置半年不会影响其敏感性。

5、本发明一次能同时处理多个样本，非常适合甲型H1亚型猪流感病毒的临床大规模检测。并能够满 足试验要求，也可作为科研使用。

6、目前市场上还没有检测甲型H1亚型猪流感病毒抗原(北美流感)的试剂盒。也无区分甲型H1亚 型猪流感病毒(北美流感)和经典H1亚型流感病毒的鉴别诊断试剂盒。

附图说明

图1：是本发明总体技术路线图。

图2：是SP2/0细胞染色体计数。

图3：5F7杂交瘤细胞染色体计数。

图4：抗甲型H1亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白单克隆抗体间接免疫荧光检测图。其中图4A：为抗甲型 H1亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白单克隆抗体间接免疫荧光检测图；图4B为阴性对照

具体实施方式

实施例1制备实施例

一、甲型H1亚型流感病毒的分离

1、分离过程：用灭菌的咽拭子采集病猪咽喉样本，置于灭菌磷酸盐缓冲液(简称PBS，配方：Na₂CO₃ 1.59g， NaHCO₃ 2.93g，用ddH₂O定容至1000ml)中，随后将咽拭子样本液0.2ml接种9日龄无特定病原体(Specific  pathogen Free，SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，置35℃下孵育72h，收货尿囊液 做血凝定性试验，血凝试验为阳性的样本，再经过RT-PCR试验定型。

2、鉴定依据：RT-PCR检测为阳性的样本，扩增HA，送上海生工生物工程有限公司测序，对所得DNA 序列与网上公布的序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，以确定病毒亚型。

3、甲型H1亚型流感病毒株的病毒学特征：经过的HA-DNA序列比对，得出与北美流感HA-DNA核酸 同源达99.2％，氨基酸同源达99.0％，因此确实了我们获得的流感病毒为甲型H1亚型流感病毒。

4、专利程序的保藏：将鉴定后得到的得甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9送交位于湖北省武汉市武 汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：V201105。

二、甲型H1亚型流感病毒(保藏编号为CCTCC NO：V201105)的扩增、灭活及纯化

1、将保藏编号为CCTCC NO：V201105的甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9进行扩增； (1)严格筛选9～10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动 物技术有限公司)

每批送过来的鸡胚要经过严格筛选。外检共4项：白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项：去除沙 壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。

(2)接种病毒(A-Influ/JML-F9)于鸡胚尿囊腔

选用9～10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术 有限公司)，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精进行消毒，用钢锥穿一小孔，随后将1ml 注射器针头沿此小孔插入(避开血管)，接种甲型H1亚型流感病毒(A-Influ/JML-F9)。最后用石蜡封口， 并置35℃下孵育72h。每天检查鸡胚生长情况，每12h翻卵并检卵一次。24h内死亡的鸡胚，认为是非特 异死亡并弃去，72h收取鸡胚，4℃下放置过夜。

(3)含甲型H1亚型流感病毒(A-Influ/JML-F9)尿囊液的收获

用75％浓度的酒精消毒鸡胚气室端，用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。 用无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。将鸡胚收获液3000r/min离心5min去除血液和细胞。 然后进行红细胞凝集实验，确定鸡胚尿囊液血凝效价。

2、甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9的灭活

将含病毒A-Influ/JML-F9尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8％的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀， 37℃灭活24小时，每隔6小时振摇1次。每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。 灭活容器的甲型H1亚型流感病毒的尿囊液经检定合格。8000r/min，离心10min。弃去沉淀，上清备用。

3、甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9浓缩及纯化

(1)将甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9进行浓缩，方法是：将甲型H1亚型流感病毒鸡胚尿囊液于 27000r/min，离心2h，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，充分混匀备用。

(2)甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9纯化

在超速离心管中依次加入60％、45％、30％、20％浓度蔗糖溶液形成密度梯度。将重悬好的病毒 A-Influ/JML-F9样品平铺于最上层，于32000r/min，离心1h。离心后取出45％、30％之间层面样品，用PBS 重悬30％、45％之间层面样品取出样品，32000r/min，离心1h，取沉淀(即得所述的病毒A-Influ/JML-F9) 进行蛋白质含量测定。以此作为免疫原。

实施例2抗甲型H1亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的制备

1、以灭活及纯化的甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9原毒株(保藏在湖北省武汉市武汉大学内的 中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V201105)为抗原，加弗氏佐剂乳化(首免选用弗 氏完全佐剂，二、三免选用弗氏不完全佐剂)免疫5-8周龄BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)。 首免剂量为20ug/只，每只小鼠颈背部皮下多点注射。二周后用相同剂量加强免疫一次，二周后再加强免 疫一次，剂量为40ug/只，二周后断尾采集少量小鼠血，收集血清，用血凝抑制法检测小鼠抗体效价。待 小鼠抗体达到试验要求，再经腹腔注射灭活及纯化的甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9，注射剂量为 40ug/只免疫一次。三天后，即可取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按实验 室常规方法进行融合。

2、细胞融合，取经过强化免疫的BALB/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)一只，眼眶放血处死(收 集血清，即为阳性血清)，在75％浓度酒精中浸泡10min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新 鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按1×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞(个数比1∶10) 的比例于50ml离心管中混匀，1500r/min，离心10min。弃去上清，管壁用灭菌的滤纸吸干，轻震管底， 使细胞沉淀略有松动。将装有细胞混合物的离心管放置于37℃恒温水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温 至37℃的50％聚乙二醇(PEG)0.8ml(购自sigma公司)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌1min。 然后慢慢加入预温至37℃的1640(购自sigma公司)细胞培养液40ml。

融合具体步骤如下：

第一分钟逐滴滴入50％聚乙二醇(PEG)0.8ml，静置0.5min；第二分钟加1640细胞培养液1ml，静 置0.5min(重复一次)；第四分钟加1.5ml，静置0.5min(重复一次)；第六分钟加5ml，静置0.5min(重 复一次)；第八分钟加10ml，静置0.5min(重复一次)；每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。静置 1min，1000r/min离心10min，弃上清，于37℃环境中放置8min。用HAT培养基(购自Sigma公司)悬浮， 同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基， 分种于96孔培养板中，约200μl/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0 的细胞数计算，每孔接种量约含10⁴左右个SP2/0细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。融合后第二天 开始观察96孔板内细胞有无污染，于第4天用HT培养基换HAT培养基100μl。待融合细胞集落长至培养 孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体效价检测。采用灭活的的甲型H1亚型流感病毒(A-Influ/JML-F9)作 为筛选抗原，利用血凝抑制法(肖金晖等.RT-PCR法与血凝抑制法鉴定流感病毒的比较[J].中国热带医 学，2005，5：401～402)筛选出分泌抗甲型H1亚型亚型流感病毒血凝素(HA)抗体的阳性孔。对筛选出来 的阳性孔立刻用有限稀释法(但汉并等.H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进 展，2006，27(8)：67～69)进行克隆、筛选。经过3～5次克隆纯化，最终筛选出分泌抗甲型H1亚型亚型 流感病毒血凝素(HA)抗体的单克隆杂交瘤细胞株5F7，于2011年1月27日送交湖北省武汉市武汉大学 内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：C201106。

3、腹水的制备，选用5-6周龄雌BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐剂 0.5ml/只，5天后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法(HI)检测腹水效价，-70℃ 保存。

4、腹水抗体的纯化：辛酸-硫酸铵法

具体步骤如下：

(1)将上述步骤3制备的腹水1000r/min离心10min，用0.45μm滤膜过滤，滤液边搅拌边加入用4倍体 积60mmol/L醋酸缓冲液(pH＝4.5)；

(2)边搅拌边逐滴加入正辛酸至终浓度为33μl/ml，室温条件下搅拌30min，8000r/min离心30min，弃沉 淀收集上清；

(3)将步骤(2)的上清液经滤纸过滤一次，滤液pH调制7.4；

(4)向步骤(3)所得的滤液边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液(硫酸铵体积/总体积≤45％)，待滤液程白色 浑浊液时，继续搅拌30min，然后于4℃静置5h。再于4℃条件12000r/min下离心30min；

(5)弃上清，沉淀用10mmol pH＝9.0Tris-HCl重悬；在100倍体积的10mmol pH＝9.0的Tris-HCl中，于 4℃条件下磁力搅拌透析，透析透析36h，期间3次(12h/次)更换新鲜Tris-HCl液。透析结束，取上清， 用SDS-PAGE电泳的方法鉴定抗体的纯度，用紫外分光光度计测定抗体浓度，分装、冻存。

上述纯化抗体试验中所用试剂按照以下配方配制：

醋酸缓冲液(60mmol/L)：C₂H₃NaO₂ 2.463g，用ddH₂O定容至500ml(pH＝4.5)。

饱和硫酸铵溶液：每100ml ddH₂O中加(NH₄)₂SO₄ 90g，加热至80℃溶解，趁热滤纸过滤，降至室温既有 结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25％氨水调pH值至7.2，备用。

5、辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)

(1)取5.0mg的辣根过氧化物酶(HRP)5.0mg溶于5ml ddH₂O，溶液呈棕红色；随后滴加NaIO₄溶液 (60mmol/L)0.5ml，使溶液呈草绿色，4℃条件放置30min；滴加乙二醇溶液(160mmol/L)0.5ml，终 止氧化反应，室温下避光条件放置30min，溶液呈棕黄色；

(2)取本发明制备的单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)5ml(1mg/ml)与上述步骤(1) 所处理好的液体混合，10mmol pH＝9.5碳酸盐缓冲液，4℃条件下磁力搅拌透析过夜。

(3)向完成透析液体中加新鲜配制的浓度为5mg/ml的NaBH₄溶液0.2ml，于4℃下放置2h；然后等体 积加入饱和硫酸铵溶液，于4℃下静置30min，7000r/min离心10min，弃去上清。PB溶液(20mmol/L pH＝7.4，) 3ml重悬，在1000倍体积的PB(20mmol/L pH＝7.4)中，4℃条件下磁力搅拌透析，透析36h，期间3次 (12h/次)换液。

(4)标记抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)完成透析后，加PB(20mmol/L pH＝7.4)、甘油(终 浓度30％)定容至5ml，于-20℃保存。

标记抗体试验中所用试剂按以下配方配制：

NaIO4溶液(60mmol/L)：NaIO₄ 1.283g，用ddH₂O定容至100ml；

乙二醇溶液(160mmol/L)：乙二醇13.4μl，用ddH₂O稀释至1.5ml；

碳酸盐缓冲液10mmol pH＝9.5：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，用ddH₂O定容至1000ml(pH＝9.5)；

NaBH₄溶液(5mg/ml)：NaBH₄0.05g，用ddH₂O定容至10ml，现配现用；

饱和硫酸铵溶液：每100ml ddH₂O中加(NH₄)₂SO₄ 90g，加热至80℃溶解，趁热滤纸过滤，降至室温既有 结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25％氨水调pH值至7.2，备用。

PB溶液(20mmol/L pH＝7.4)：Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，NaH₂PO₄ 1.56g，用ddH₂O定容至1000ml，pH＝7.4。

实施例3抗甲型H1亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)的鉴定

1、HI效价的鉴定

采用本发明分离得到的甲型H1亚型流感病毒(保藏编号为CCTCCNO：V201105)作为抗原用血凝抑 制法测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价。结果见表1。

表1：利用血凝抑制法(HI)测定杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水的效价

2、单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)的Ig亚类(型)的鉴定

用鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit，购自ROCKLAND公司)对本发明所得到 的单克隆抗体进行鉴定，确定本发明制备的单克隆抗体抗体为IgG₁亚类。

3、单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)的特异性鉴定

采用血凝抑制法(HI)分别测定抗甲型H1亚型流感血凝素蛋白(HA)单克隆抗体与经典H1亚型、 H3亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒，结果均显示为阴性，说明获得的抗甲型H1亚型流感血凝素蛋白 (HA)单克隆抗体具有很好的特异性。结果见表2。

表2：血凝抑制法测定单克隆抗体与经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型、H10亚型的流感病毒结果

4、染色体计数

按常规方法进行杂交瘤染色体计数(章谷生等.单克隆抗体在医学上的应用[M].上海科学技术出版 社，1987：281～406)，所有获得的杂交瘤细胞染色体众数位于85-97之间(SP2/0骨髓瘤细胞染色体众数为70， BALB/c鼠脾细胞染色体数为40)，均高于两亲本细胞的染色体数目，证明所有获得的杂交瘤细胞确为SP2/0 细胞与免疫脾细胞的杂合体。

实施例4甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法

1、核心试剂配制：

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，用ddH₂O定容至1000ml(pH9.6)。

10倍洗涤液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 5ml，用ddH₂O定容 至1000ml(pH＝7.4)。

封闭液：5g脱脂乳溶于100ml洗涤液。

底物液：分为底物A液和底物B液。具体组成如下：

底物A液：0.006％浓度的H₂O₂缓冲液。

底物B液：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用ddH₂O定容至500m配成0.1ml磷酸盐柠檬酸 缓冲液(pH＝5.0)，然后按终浓度为20mg/L添加联苯二胺(TMB)(使用时将A液和B液等体积混合，混合 后5分钟内使用，现配现用)。

终止液(终浓度0.025％氢氟酸溶液)：取浓度为40％氢氟酸溶液625μL，用ddH2O定容至100mL。

2、ELISA检测方法步骤：

(1)包被抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)最佳包被浓度和辣根过氧化物酶标记抗体(保藏编 号为CCTCC NO：C201106)最佳稀释浓度比采用方阵滴定法(李海燕等.禽流感病毒重组核蛋白ELISA 诊断技术的研究，2000，22(3)：182～185)来确定。检测抗原为甲型H1亚型流感病毒(保藏编号为CCTCC NO：V201105)尿囊液。试验结果显示包被抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)最佳包被浓度为2μg/ml， 辣根过氧化物酶标记抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)最佳稀释浓度比为1∶1000。

(2)酶标反应板的制备：纯化抗体(保藏编号为CCTCC NO：C201106)用包被液按照体积比为1∶1000 的比例稀释，100μl/孔加入到酶标板中，37℃放置1h后置4℃冷库过夜；甩干包被液，用洗涤液洗涤1次， 每次5min，甩干洗涤液；加封闭液200μl/孔到酶标板中，于37℃封闭2h，甩干封闭液。于4℃冷藏过夜， 自然干燥。

3、结果判定值的确定：

通过对89份已知背景的甲型H1亚型流感病毒阴性样品进行检测，得到结果，求其平均值标准偏差SD＝0.03；确定阴阳性临界点为即待测样品的OD₆₃₀值≤0.23则判 定为阴性，OD₆₃₀值＞0.23则判定为阳性。

4、阴阳性对照试剂的制备：

将含病毒尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8％的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀，37℃灭活24 小时，每隔6小时振摇1次。加入0.02％NaN₃防腐，并作为阳性对照样品4℃保存。

空白鸡胚尿囊液加入0.02％NaN₃防腐作为作为阴性对照样品4℃保存。

5、甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的使用步骤：

(1)包被：以纯化抗体最佳包被浓度包被酶标板为100μl/孔，37℃孵育1h后置4℃过夜。

(2)洗板：弃包被液，PBST洗涤液，200μl/孔，洗涤3次，每次3min。

(3)封闭：拍干酶标板，加入封闭液，200μl/孔，37℃孵育2h，封闭非特异性结合位点。

(4)洗板：弃封闭液，同步骤(2)。

(5)加待检样品：拍干酶标板，加入待检样品，100μl/孔，设阴性对照，37℃孵育30min。

(6)洗板：弃待检样品液，同步骤(2)。

(7)加酶标抗体：拍干酶标板后加入HRP标记的抗单克隆抗体(保藏号为CCTCC NO：C201106)，体 积比为1∶1000倍稀释，100μl/孔，37℃放置30min。

(8)洗板：弃酶标抗体，同步骤(2)。

(9)显色：每孔加入新配的底物A液、底物B液各50μl，室温避光显色10min。

(10)终止反应：每孔加入50μl终止液终止反应；

(11)测定OD₆₃₀值：酶标仪测定波长为630nm时OD值。

实施例5甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的敏感性试验和特异性试验

1、甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的敏感性试验

通过本发明敏感性试验，表明本发明的ELISA方法最低可检测的病毒含量为TCID₅₀＝10^-2.33(约215个 TCID₅₀)(殷震等.动物病毒学(第2版)[M].北京：科学出版社，1997)。结果见表3。

表3：本发明敏感性试验

2、甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的特异性试验

(1)将经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型的流感病毒分别用本发明的方法进行检测，OD₆₃₀结果 值均≤0.23，判定为阴性，说明本发明对流感各亚型具有很好的特异性。其结果见表4所述。

表4：本发明对经典H1亚型、H3亚型、H5亚型、H9亚型、H10亚型的流感病毒的检测结果

(2)将畜禽类主要病毒如：将猪瘟病毒(CSFV)、猪生殖与呼吸综合症病病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒 (PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪乙脑病毒、鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡 减蛋综合症病毒(EDSV)、SPF鸡胚尿囊液等样本分别用本发明的方法进行检测，OD₆₃₀结果值均≤0.23， 判定为阴性，说明本发明对以上各种病毒具有很好的特异性。其结果见表5所述。

表5：本发明对畜禽类主要病毒的检测效果

实施例6甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法与PCR方法的比较

1、检测尿囊液样本：将本实验室分得16株甲型H1亚型流感病毒鸡胚尿囊液同时用本发明方法和RT-PCR 方法检测并进行比较。其结果见表6所述。

表6显示：本发明方法共检出15份阳性样本，1份阴性样本，检出率93.75％(15/16)；RT-PCR方法 共检测出16份阳性样品，0份为阴性样品，检出率100％(16/16)；本发明方法和RT-PCR方法符合率93.75％ (15/16)。

表6：本发明ELISA检测方法与RT-PCR方法的结果比较

2、检测组织样本：将已知背景为阳性的样本17份(包含心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、气管和气管冲洗 液)、阴性样本16份(包含心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、气管和气管冲洗液)共33份样同时用本发 明方法和RT-PCR方法检测并进行比较。其结果见表7所述。

表7显示：本发明共检出16份样本为阳性，17份样本为阴性。通过RT-PCR方法共检出17份为阳性， 16份为阴性。本发明对阳性样本的检出率为94.1％(16/17)，两种方法的符合率94.1％(16/17)；本发明 对阴性样本的检出率为100％(16/16)，两种方法的符合率100％(16/16)。

表7：本发明与RT-PCR方法的检出率的比较

3、检测临床样本：将各地所采集样本共284份样本用双抗体夹心ELISA检测方法试验。结果显示：本 发明检测方法检出阳性样本0份，阳性率为0％(0/284)。

实施例7甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒的组装

1、甲型H1亚型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒包括：

1)包被单克隆抗体(CCTCC NO：C201106)的96孔酶标板

(8孔×12条×2块)

2)阴、阳性对照(具体配方详见：2、相关试剂的配制)

                               各1管          (0.5ml/管)

3)辣根过氧化物酶标记的保藏号为CCTCC NO：C201106的单克隆抗体

                               1瓶            (25ml/瓶)

4)10倍洗涤液浓缩液             1瓶            (50ml/瓶)

5)底物A液、底物B液             各1瓶          (12ml/瓶)

6)终止液                       1瓶            (12ml/瓶)

7)样品处理A液(处理组织脏器)    1瓶            (50ml/瓶)

8)样品处理B液(处理喉、鼻拭子)  1瓶            (50ml/瓶)

2、相关试剂的配制

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，用ddH₂O定容至1000mL(pH9.6)。

10倍洗涤液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 5ml，用ddH₂O定容至 1000ml(pH＝7.4)。

封闭液：5g脱脂乳溶于100ml洗涤液。

底物液：底物A液：0.006％H₂O₂缓冲液；底物B液：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用ddH₂O 定容至500ml，配成0.1ml磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH＝5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将底物A液和 底物B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

终止液(终浓度0.025％氢氟酸溶液)：取浓度为40％氢氟酸溶液625μL，用ddH2O定容至100mL。

样品处理A液的配制：称取Na₂B₄O₇·10H₂O 13.3g，H₃BO₃ 16.08g，NaCl 8.5g，ddH₂O 800ml，调pH值为 8.4后用蒸馏水定容至1000ml。在121℃，高压蒸汽灭菌30分钟后分装，置4℃贮存，用于处理内脏组织。

样品处理B液的配制：称取Na₂B₄O₇·10H₂O 13.3g，H₃BO₃ 16.08g，NaCl 8.5g，ddH₂O 800ml，调pH值为 8.4后用蒸馏水定容至1000ml。在121℃高压蒸汽下灭菌30分钟后加入5g N-乙酰-L-半胱氨酸，5mL NP-40， 混匀后分装，置4℃贮存，用于处理喉头拭子。

阳性对照的配制：将含病毒尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8％的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀， 37℃灭活24小时，每隔6小时振摇1次。加入0.02％NaN₃防腐，并作为阳性对照样品分装成0.5ml/管， 置4℃下保存。

阴性对照的配制：无菌收取SPF鸡胚尿囊液，4℃，12000r/min离心30min后加入0.02％NaN₃防腐。 分装成0.5ml/管，置4℃下保存。

实施例8甲型H1型流感病毒双抗体夹心ELISA检测试剂盒的操作步骤

1)取酶标板(根据样品多少可拆开分次使用)，将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后，洗板一次(200μl/ 孔)后拍干；

2)加入待检样品，100μl/孔，设阴性对照，37℃孵育30min；

3)弃待检样品液，

4)拍干酶标板后加入HRP标记抗体，1∶1000倍稀释，100μl/孔，37℃放置30min；

5)弃酶标抗体，加入洗涤液，200μl/孔，洗涤3次，每次3min；

6)每孔加入新配的底物A、B液各50μl，室温避光显色10min；

7)终止反应：每孔加入50μl终止液终止反应；

8)测定OD630值：酶标仪测定波长为630nm时OD值。

9)结果判定：阴、阳性对照的OD值是反应试剂盒质量和试验操作规范的重要标志，我们选择灭活的 甲型H1亚型流感病毒作为阳性对照，SPF鸡胚空白尿囊液作为阴性对照。ELISA试验成立的条件是阳性 对照OD值大于0.8，阴性对照OD值小于0.2。阳性对照、阴性对照必须控制在这个范围内，否则检测结 果无效。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由 所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或 修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。