牙周病和牙髓疾病的治疗剂以及治疗方法

摘要

本发明的目的在于提供牙周病和牙髓疾病的治疗剂和治疗方法、牙周组织再生用移植材料、牙周组织的再生方法。通过本发明可以提供以神经营养因子作为有效成分的牙周病和牙髓疾病的治疗剂。

说明书

本申请是中国专利申请号200480031194.6，申请日2004年9月8 日，发明名称为“牙周病和牙髓疾病的治疗剂以及治疗方法”的分案申 请。

技术领域

本发明涉及到牙周病和牙髓疾病的治疗剂以及治疗方法、牙周组 织再生用移植材料、牙周组织的再生方法。

背景技术

由牙肉、牙槽骨、牙周韧带(牙根膜)、牙骨质、牙髓等构成的 牙周组织是用于使牙直立，维持咀嚼和咬合等功能的重要组织，它的 损伤或破坏与牙的丧失相关。例如，据称日本国内约3000万人患有牙 周病，在牙病发展的同时牙周组织的损伤或破坏也随之发展，成为丧 失牙的很大的一个原因。在被损伤或破坏的包括牙髓在内的牙周组织 的治疗中，虽然尝试了给药或外科手术等各种各样的方法，但任一种 药剂或治疗方法使被损伤或破坏的包括牙髓在内的牙周组织再生的效 果可以说都不理想。

神经营养因子中有来自脑的神经营养因子(Brain-derived  neurotrophic factor、BDNF)、神经生长因子(Nerve growth factor、 NGF)、神经营养素3(Neurotrophin 3、NT-3)以及神经营养素4/5 (Neurotrophin4/5、NT-4/5)，参与促进神经细胞的分化或维持生存、 促进再生、维持功能。BDNF和NT-4/5特异结合称为TrkB (tropomyosin receptor kinase B)的高亲和性受体、NGF特异结合 称为TrkA的高亲和性受体、NT-3特异结合称为TrkC的高亲和性受体。

BDNF、NGF、NT-3是主要存在于脑内的神经营养因子，BDNF和NGF 通过使用运动神经障碍模型、帕金森病模型、阿尔茨海默病模型等各 种疾病模型动物的实验已证明其有效性。人们正期盼其中BDNF可作为 以下各种疾病的治疗剂的开发，运动·末梢神经疾病-肌萎缩性侧索 硬化症(ALS)、糖尿病和由化疗制剂导致的末梢神经障碍等，以及中 枢神经系疾病-阿尔茨海默病、帕金森病、视网膜关联疾病等。

可以说这些神经营养因子不仅在中枢神经系，而且在末梢神经系 也起着重要的作用。有报道称在小鼠肋骨骨折的治愈过程中，BDNF、 NGF、NT-3、TrkC、TrkA的表达增加(K.Asaumi等人、Bone Vol 26，No.6，625-633，2000)，BDNF、NGF、NT-3促进小鼠牙周韧带细胞 的增殖(Y.Tsubo i等人，J Dent Res 80，(3)，881-886，2001)等。然 而，有关这些神经营养因子在牙周组织或牙髓组织中的作用的详细报 道还没有。

发明内容

本发明的目的在于提供牙周病和牙髓疾病的治疗剂以及治疗方 法、牙周组织再生用移植材料、牙周组织的再生方法。

本发明人为了解决上述课题进行了不断研究，结果了解到神经营 养因子促进来自人牙周韧带的成纤维细胞的增殖，促进骨关联蛋白质 的mRNA表达，狗的牙根分叉部病变模型中促进牙周组织的再生，直至 完成本发明。

即，利用本发明，可提供以神经营养因子作为有效成分的牙周病 治疗剂。

本发明的治疗剂优选使牙周组织再生。

本发明的治疗剂优选使牙骨质、牙周韧带、牙槽骨或牙髓再生。

本发明的治疗剂优选防止牙肉上皮沿着牙根面根尖方向侵入。

本发明的治疗剂优选促进牙髓腔中修复象牙质的产生。另外优选 促进修复象牙质向牙髓腔内壁的添加。

在本发明的治疗剂中，神经营养因子优选是来自脑的神经营养因 子、神经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。

根据本发明的另一个方面可提供含有神经营养因子的牙周组织再 生用移植材料。

本发明的移植材料优选使牙周组织再生。

本发明的移植材料优选使牙骨质、牙周韧带、牙槽骨或牙髓再生。

本发明的移植材料优选防止牙肉上皮沿着牙根面根尖方向。

本发明的移植材料优选促进牙髓腔中的修复象牙质的产生。另外， 优选向牙髓腔内壁添加修复象牙质。

在本发明的移植材料中，神经营养因子优选是来自脑的神经营养 因子、神经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。

根据本发明的另一个方面可以提供使用神经营养因子的牙周组织 的再生方法。

本发明的再生方法优选使牙周组织再生。

本发明的再生方法优选使牙骨质、牙周韧带、牙槽骨或牙髓再生。

本发明的再生方法优选防止牙肉上皮沿着牙根面根尖方向侵入。

在本发明的再生方法中，神经营养因子优选是来自脑的神经营养 因子、神经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。

根据本发明的另一方面可以提供牙周病的治疗法，作为牙周病的 治疗方法包括向患有或容易患有这样疾病状态的对象给予治疗有效量 的神经营养因子。

本发明的治疗法优选使牙周组织再生。

本发明的治疗法优选使牙骨质、牙周韧带、牙槽骨或牙髓再生。

本发明的治疗法优选防止牙肉上皮向牙根面根尖方向进入。

本发明的治疗法优选促进牙髓腔中修复象牙质的产生。另外优选 修复象牙质向牙髓腔内壁的添加。

在本发明的治疗法中，神经营养因子优选是来自脑的神经营养因 子、神经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。

根据本发明的另一方面可以提供用于制造牙周病治疗中使用的药 剂的神经营养因子的使用。

该药剂优选使牙周组织再生，优选使牙骨质、牙周韧带、牙槽骨 或牙髓再生。该药剂优选防止牙肉上皮向牙根面根尖方向进入。该药 剂优选促进牙髓腔中修复象牙质的产生。另外优选促进修复象牙质向 牙髓腔内壁的添加。神经营养因子优选是来自脑的神经营养因子、神 经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。

根据本发明的另一方面可以提供以神经营养因子作为有效成分 的修复象牙质的形成促进剂。神经营养因子优选是来自脑的神经营养 因子、神经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。优选修复象 牙质添加到牙髓腔的内壁。

根据本发明的另一方面可以提供牙髓疾病的治疗法，作为牙髓疾 病的治疗方法，包括为了促进修复象牙质的形成向患有或容易患有这 样疾病的对象给予治疗有效量的神经营养因子。其中神经营养因子优 选是来自脑的神经营养因子、神经生长因子、神经营养素3或神经营 养素4/5。优选修复象牙质被添加到牙髓腔的内壁。

本发明的另一个方面可以提供为了制造在促进修复象牙质的形成 中使用的药剂的神经营养因子的使用。其中神经营养因子优选是来自 脑的神经营养因子、神经生长因子、神经营养素3或神经营养素4/5。 优选修复象牙质被添加到牙髓腔的内壁。

附图的简单说明

[图1]是在HPL细胞以及人牙周韧带中显示BDNF和TrkB的mRNA 表达的电泳图。各个电泳图左端带为标记。(A)表示甘油醛-3-磷酸 脱氢酶(GAPDH)的mRNA(613bp)在人牙周韧带和HPL细胞中的表达。 (B)表示BDNF的mRNA(438bp)和TrkB的mRNA(434bp)在人牙周韧 带中的表达。(C)表示BDNF和TrkB的mRNA在HPL细胞中的表达。

[图2A]是表示在HPL细胞中BDNF的作用时间与ALPase的mRNA (381bp)的表达量的关系的电泳图和图。HPL细胞都用最终浓度 50ng/ml的BDNF处理。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作 用时间0的mRNA表达量作为1时各个作用时间中的mRNA表达量的比 例。横轴表示BDNF作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的 范围。**表示p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图2B]是表示在HPL细胞中BDNF的作用时间与OPN的mRNA (532bp)的表达量的关系的电泳图和图。HPL细胞都用最终浓度 50ng/ml的BDNF处理。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作 用时间0的mRNA表达量作为1时各个作用时间中的mRNA表达量的比 例。横轴表示BDNF作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的 范围。**表示p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图2C]是表示在HPL细胞中BDNF的作用时间与BMP-2的mRNA (440bp)的表达量的关系的电泳图和图。HPL细胞都用最终浓度 50ng/ml的BDNF处理。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作 用时间0的mRNA表达量作为1时各个作用时间中的mRNA表达量的比 例。横轴表示BDNF作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的 范围。**表示p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图2D]是表示在HPL细胞中BDNF的作用时间与GAPDH的mRNA的 表达量的关系的电泳图。HPL细胞都用最终浓度50ng/ml的BDNF处理。 电泳图左端带为标记。

[图3A]是表示在HPL细胞中BDNF的作用时间与BMP-4的mRNA (339bp)的表达量的关系的电泳图和图。HPL细胞都用最终浓度 50ng/ml的BDNF处理。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作 用时间0的mRNA表达量作为100时各个作用时间中的mRNA表达量的 百分率。横轴表示BDNF作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏 差的范围。

[图3B]是表示在HPL细胞中BDNF的作用时间与OPG的mRNA (736bp)的表达量的关系的电泳图和图。HPL细胞都用最终浓度 50ng/ml的BDNF处理。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作 用时间0的mRNA表达量作为100时各个作用时间中的mRNA表达量的 百分率。横轴表示BDNF作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏 差的范围。

[图4A]是表示在HPL细胞中BDNF的给予量与ALPase的mRNA的 表达量的关系的电泳图和图。使各个浓度的BDNF作用于HPL细胞24 小时。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF的给予量为0的mRNA 表达量作为1时在各个给予量下的mRNA表达量的比例。横轴表示BDNF 的浓度(ng/ml)。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。** 表示p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图4B]是表示在HPL细胞中BDNF的给予量与OPN的mRNA的表达 量的关系的电泳图和图。使各个浓度的BDNF作用于HPL细胞12小时。 电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF的给予量为0的mRNA表达 量作为1时于各个给予量下的mRNA表达量的比例。横轴表示BDNF的 浓度(ng/ml)。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。**表示 p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图4C]是表示在HPL细胞中BDNF的给予量与BMP-2的mRNA的表 达量的关系的电泳图和图。使各个浓度的BDNF作用于HPL细胞24小 时。电泳图左端带为标记。图纵轴表示BDNF的给予量为0的mRNA 表达量作为1时于各个给予量下的mRNA表达量的比例。横轴表示BDNF 的浓度(ng/ml)。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。*表 示p＜0.05，**表示p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图4D]是表示在HPL细胞中BDNF的给予量与GAPDH的mRNA (613bp)的表达量关系的电泳图。

[图5](A)是表示在HPL细胞中BDNF的给予量与OPN的分泌量 关系的图。使各个浓度的BDNF作用于HPL细胞12小时。纵轴表示OPN 的分泌量(ng/ml)，横轴表示BDNF的浓度(ng/ml)。(B)表示在 HPL细胞中BDNF的给予量与BMP-2分泌量关系的图。使各个浓度的 BDNF作用于HPL细胞24小时。纵轴表示表示BMP-2分泌量(pg/ml)， 横轴表示BDNF的浓度(ng/ml)。(C)是表示在HPL细胞中BDNF的 作用时间与BMP-2的分泌量关系的图。细胞用最终浓度50ng/ml的 BDNF处理。纵轴表示表示BMP-2分泌量(pg/ml)，横轴表示BDNF的 作用时间。(A)～(C)的各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范 围。**表示p＜0.01的统计学的有意义差(t-test)。

[图6]是表示BDNF的给予量与HPL细胞和HGK的DNA合成能力关 系的图。使各个浓度的BDNF作用于HPL细胞和HGK24小时。各个图的 纵轴以没有给予BDNF或bFGF(即BDNF浓度为0或bFGF浓度为0)时 的DNA合成能力作为100时的各个给予量下的DNA合成能力的比例。 横轴表示BDNF或bFGF的浓度(ng/ml)。各个棒图的杆表示平均值± 标准偏差的范围。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的统计学的有意义 差(t-test)。(A)表示HPL细胞中的DNA合成能力，(B)表示HGK 细胞中的DNA合成能力。

[图7](A)是表示HPL细胞中BDNF的给予量与I型胶原的合成 量关系的图。使各个浓度的BDNF作用于HPL细胞24小时。纵轴表示 I型胶原的合成量(μg/ml)，横轴表示BDNF的浓度(ng/ml)。(B) 是表示HPL细胞中BDNF的作用时间与I型胶原的合成量关系的图。细 胞用最终浓度50ng/ml的BDNF处理。纵轴表示I型胶原的合成量(μ g/ml)，横轴表示BDNF的作用时间。(A)、(B)的各个棒图的杆表 示平均值±标准偏差的范围。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的统计 学的有意义差(t-test)。

[图8]是表示狗的3级牙根分叉部病变模型中BDNF的给予量与牙 骨质和牙槽骨再生的关系的图。纵轴表示牙骨质再生率(％)或骨再 生率(％)，横轴表示BDNF的浓度(μg/ml)。各个棒图的杆表示平 均值±标准偏差的范围。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01的统计学的 有意义差(t-test)。(A)表示与牙骨质再生率的关系，(B)表示 与骨再生率的关系。

[图9A]是填塞了实施例2做成的不含BDNF的TERUPLUG R的牙根 分叉部骨缺损部位(对照组)的苏木精·曙红染色标本的光学显微镜 像(倍率20倍)。

[图9B]是填塞了实施例2做成的含有BDNF(5μg/ml)的移植材 料的分叉部骨缺损部位的显微镜像(倍率20倍)。

[图10]是图9B的牙根分叉部正下方的部分放大像(倍率200倍)。 在牙根分叉部正下方，在裸露的牙根面的几乎所有部分中埋入了胶原 纤维的牙骨质已再生，也没有看到上皮的侵入。

[图11A]是表示HPL细胞中NGF的mRNA表达量的放射活性的带和 图。图纵轴表示NGF的mRNA表达量对GAPDH的mRNA表达量的比例。 图中，HGF表示牙肉成纤维细胞、HPC表示牙髓细胞、HSF表示来自包 皮的成纤维细胞、HNB表示人成神经细胞瘤细胞。

[图11B]是表示HPL细胞中TrkA的mRNA表达量的放射活性的带 和图。图纵轴表示TrkA的mRNA表达量对GAPDH的mRNA表达量的比例。 图中，HGF表示牙肉成纤维细胞、HPC表示牙髓细胞，HSF表示来自包 皮的成纤维细胞、HNB表示人成神经细胞瘤细胞。

[图12]是NGF影响HPL细胞中OPN的mRNA表达量的图。(A) 是表示NGF的经时效果的测定结果的图，图纵轴表示以NGF作用时间 0的mRNA表达量作为1时各个作用时间中的OPN的mRNA表达量的比 例。图横轴表示NGF的作用时间。全部用最终浓度100ng/ml的NGF 进行处理。(B)是表示浓度效果的测定结果的图。图纵轴表示以在 NGF浓度0时mRNA表达量作为1时，各个浓度下OPN的mRNA表达量 的比例。横轴表示NGF的浓度(ng/ml)。NGF都作用24小时。

[图13]是表示NGF影响HPL细胞中ALPa s e的mRNA表达量的图。 (A)是表示NGF的经时效果的测定结果的图，图纵轴表示以NGF作用 时间0的ALPase的mRNA表达量作为1时各个作用时间中的ALPase 的mRNA表达量的比例。图横轴表示NGF的作用时间。(B)是表示浓 度效果的测定结果的图。图纵轴表示以在NGF浓度0时ALPase的mRNA 表达量作为1时，各个浓度下ALPase的mRNA表达量的比例。横轴表 示NGF的浓度(ng/ml)。

[图14]是表示NGF影响HPL细胞中BMP-2的mRNA表达量的图。 (A)是表示NGF的经时效果的测定结果的图，图纵轴表示以NGF作用 时间0的BMP-2的mRNA表达量作为1时各个作用时间中的BMP-2的 mRNA表达量的比例。图横轴表示NGF的作用时间。(B)是表示浓度 效果的测定结果的图。图纵轴表示以在NGF浓度0时BMP-2的mRNA 表达量作为1时，在各个浓度下BMP-2的mRNA表达量的比例。横轴表 示NGF的浓度(ng/ml)。

[图15]是表示NGF的给予量与HPL细胞和HGK的DNA合成能力关 系的图。使各个浓度的NGF作用于HPL细胞和HGK 24小时。各个图的 纵轴以NGF浓度0时的DNA合成能力作为100时的各个NGF给予量下 的DNA合成能力的比例。横轴表示NGF的浓度(ng/ml)。(A)表示 在HPL细胞中的DNA合成能力，(B)表示在HGK中的DNA合成能力。

[图16A]是表示在HPL细胞中NT-3的mRNA表达量的放射活性的 带和图。图纵轴表示GAPDH的mRNA表达量作为1时的NT-3的mRNA 表达量的比例。图中，HGF表示牙肉成纤维细胞、HPC表示牙髓细胞、 HSF表示来自包皮的成纤维细胞、HNB表示人成神经细胞瘤细胞。

[图16B]是表示HPL细胞中TrkC的mRNA表达量的放射活性的带 和图。图纵轴表示GAPDH的mRNA表达量作为1时的TrkC的mRNA表达 量的比例。图中，HGF表示牙肉成纤维细胞、HPC表示牙髓细胞，HSF 表示来自包皮的成纤维细胞、HNB表示人成神经细胞瘤细胞。

[图17]是HPL细胞中的表示NT-3的给予量与ALPase活性的关系 的图。图纵轴表示ALPase活性(nmol/孔)，横轴表示NT-3浓度(ng/ml)。

[图18]是表示在HPL细胞中的NT-3的给予量与HPL细胞的DNA 合成能力的关系的图。图纵轴表示通过吸光度比较在NT-3各浓度下的 HPL细胞的DNA合成能力，横轴表示NT-3浓度(ng/ml)。

[图19A]是表示在HPL细胞中NT-4/5的作用时间与OPN、OCN的 mRNA的表达量的关系的电泳图和图。NT-4/5最终浓度调整到50ng/ml。 电泳图左端带为标记。各个图纵轴表示以NT-4/5作用时间0的各mRNA 表达量作为100时各个作用时间中的各mRNA表达量的比例。横轴表 示NT-4/5作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。各 图中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(统计学的鉴定用t-test)。

[图19B]是表示在HPL细胞中NT-4/5的作用时间与BMP-2、BMP-7 的mRNA的表达量的关系的电泳图和图。NT-4/5最终浓度调整到 50ng/ml。电泳图左端带为标记。各个图纵轴表示以NT-4/5作用时间 0的各mRNA表达量作为100时各个作用时间中的各mRNA表达量的比 例。横轴表示NT-4/5作用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差 的范围。各图中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(统计学的鉴定用 t-test)。

[图19C]是表示在HPL细胞中NT-4/5的作用时间与ALPase的 mRNA的表达量的关系的电泳图和图，以及NT-4/5的作用时间与GAPDH 的表达量的关系的电泳图。NT-4/5最终浓度调整到50ng/ml。电泳图 左端带为标记。图纵轴表示以NT-4/5作用时间0的mRNA表达量作为 100时各个作用时间中的各mRNA表达量的比例。横轴表示NT-4/5作 用时间。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。*表示p＜0.05 (统计学的鉴定用t-test)。

[图20]是表示对于HP细胞的各个骨关联蛋白质(ALPase、BMP-2、 DSPP、OPN、OCN)的mRNA表达的NGF浓度效果的测定结果的图。NGF 作用时间是24小时。各图纵轴表示以在NGF浓度0时mRNA表达量作 为1时，在各个浓度下mRNA表达量的比例。横轴表示NGF的浓度 (ng/ml)。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。

[图21]是表示对于HP细胞的各个骨关联蛋白质(ALPase、BMP-2、 DSPP、I型胶原、OPN、OCN)的mRNA表达的BDNF浓度效果的测定结 果的图。各图纵轴表示以在BDNF浓度0时各mRNA表达量作为1时， 在各个浓度下mRNA表达量的比例。横轴表示BDNF的浓度(ng/ml)。 各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。

[图22]是表示NT-3浓度对于HP细胞的各个骨关联蛋白质 (ALPase、BMP-2、DSPP、OPN、OCN)的mRNA表达的效果的测定结果 的图。各图纵轴表示以在NT-3浓度0时mRNA表达量作为1时，在各 个浓度下mRNA表达量的比例。横轴表示NT-3的浓度(ng/ml)。各个 棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。

[图23]是表示NT-4/5浓度对HP细胞的各个骨关联蛋白质 (ALPase、BMP-2、DSPP、I型胶原、OPN、OCN)的mRNA表达的效果 的测定结果的图。各图纵轴表示以在NT-4/5浓度0时mRNA表达量作 为1时，在各个浓度下mRNA表达量的比例。横轴表示NT-4/5的浓度 (ng/ml)。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。

[图24]是表示各种神经营养因子(NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5) 的给予量与HP细胞的DNA合成能力关系的图。使各浓度神经营养因子 作用于HP细胞24小时。各个图的纵轴以没有给予神经营养因子(即 神经营养因子的浓度0)时的吸光度作为100时的各个给予量下的吸 光度的比例。横轴表示各神经营养因子的浓度(ng/ml)。各个棒图的 杆表示平均值±标准偏差的范围。

[图25A]是表示在HMS细胞中NGF的作用时间与ALPase的mRNA 的表达量的关系的电泳图和图。也显示出表示与作为对照的GAPDH的 mRNA表达量的关系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NGF 处理。电泳图左端带为标记。图纵轴表示以NGF作用时间0的mRNA 表达量作为100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表 示NGF作用时间。

[图25B]是表示在HMS细胞中NGF的作用时间与OCN的mRNA的表 达量的关系的电泳图和图。也显示出表示与GAPDH的mRNA的表达量的 关系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NGF处理。各电泳 图左端带为标记。图纵轴表示以NGF作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NGF作用 时间。

[图25C]是表示在HMS细胞中NGF的作用时间与OPN的mRNA表达 量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA表达量的关系的电 泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NGF处理。各电泳图左端带 为标记。图纵轴表示以NGF作用时间0的mRNA表达量作为100％时各 个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NGF作用时间。

[图25D]是表示在HMS细胞中NGF的作用时间与BSP的mRNA表达 量的关系的电泳图和图。也显示出也给出了与GAPDH的mRNA表达量的 关系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NGF处理。各电泳 图左端带为标记。图纵轴表示以NGF作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NGF作用 时间。

[图25E]是表示在HMS细胞中NGF的作用时间与I型胶原的mRNA 表达量的关系的电泳图和图。也显示出表示与GAPDH的mRNA的表达量 的关系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NGF处理。各电 泳图左端带为标记。图纵轴表示以NGF作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NGF作用 时间。

[图26A]是表示在HMS细胞中BDNF的作用时间与ALPa s e的mRNA 的表达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA的表达量的 关系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的BDNF处理。各电 泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作用时间0的mRNA表达量作 为100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示BDNF 作用时间。

[图26B]是表示在HMS细胞中BDNF的作用时间与OCN的mRNA表 达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA表达量的关系的 电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的BDNF处理。各电泳图左 端带为标记。图纵轴表示以BDNF作用时间0的mRNA表达量作为100％ 时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示BDNF作用时间。

[图26C]是表示在HMS细胞中BDNF的作用时间与OPN的mRNA的 表达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA的表达量的关 系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的BDNF处理。各电泳 图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示BDNF作用 时间。

[图26D]是表示在HMS细胞中BDNF的作用时间与BSP的mRNA表 达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA的表达量的关系 的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的BDNF处理。各电泳图 左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示BDNF作用 时间。

[图26E]是表示在HMS细胞中BDNF的作用时间与I型胶原的mRNA 表达量的关系的电泳图和图。也给出了表示与GAPDH的mRNA的表达量 的关系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的BDNF处理。各 电泳图左端带为标记。图纵轴表示以BDNF作用时间0的mRNA表达量 作为100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示BDNF 作用时间。

[图27A]是表示在HMS细胞中NT-3的作用时间与ALPase的mRNA 的表达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA表达量的关 系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NT-3处理。各电泳 图左端带为标记。图纵轴表示以NT-3作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NT-3作用 时间。

[图27B]是表示在HMS细胞中NT-3的作用时间与OCN的mRNA的 表达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA的表达量的关 系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NT-3处理。各电泳 图左端带为标记。图纵轴表示以NT-3作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NT-3作用 时间。

[图27C]是表示在HMS细胞中NT-3的作用时间与OPN的mRNA表 达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA表达量的关系的 电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NT-3处理。各电泳图左 端带为标记。图纵轴表示以NT-3作用时间0的mRNA表达量作为100％ 时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NT-3作用时间。

[图27D]是表示在HMS细胞中NT-3的作用时间与BSP的mRNA表 达量的关系的电泳图和图。也给出了表示与GAPDH的mRNA表达量的关 系的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NT-3处理。各电泳 图左端带为标记。图纵轴表示以NT-3作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NT-3作用 时间。

[图27E]是表示在HMS细胞中NT-3的作用时间与I型胶原的mRNA 表达量的关系的电泳图和图。也给出了与GAPDH的mRNA表达量的关系 的电泳图。HMS细胞都用最终浓度100ng/ml的NT-3处理。各电泳图 左端带为标记。图纵轴表示以NT-3作用时间0的mRNA表达量作为 100％时各个作用时间下的mRNA表达量的百分率。横轴表示NT-3作用 时间。

[图28]是表示抗坏血酸(Aa)、NGF、BDNF、NT-3对HMS细胞的 增殖影响的效果的图。图纵轴表示试验组相对于对照组的吸光度的百 分率。各个棒图的杆表示平均值±标准偏差的范围。*表示p＜0.05， **表示p＜0.01(统计学的鉴定用t-test)。

[图29A]是填塞了实施例8做成的含NGF(100g/ml)的移植材 料的牙根分叉部骨缺损部位的光学显微镜像(倍率20倍)。

[图29B]是填塞了实施例8做成的含NT-3(100μg/ml)的移植 材料的牙根分叉部骨缺损部位的光学显微镜像(倍率20倍)。

具体实施方式

以下就本发明的更具体的方式、以及用于实施本发明的方法进行 说明。

在本说明书中，所谓“牙周组织”指的是由牙肉、牙槽骨、牙周 韧带(牙根膜)、牙骨质构成的组织。

所谓“牙肉”指的是被覆牙颈部和牙槽骨一部分的软组织，由牙 肉上皮和牙肉固有层构成。

所谓“牙周韧带”是介于牙槽骨和牙骨质之间的结缔组织，也称 为牙根膜。

“牙槽骨”分为相当于包围牙根的牙槽壁的致密质部分的固有牙 槽骨、以及由处于它的外侧的海绵质和致密质的部分构成的支持牙槽 骨。

“牙骨质”是牙根的最表层的硬组织，分为含有牙骨质细胞的有 细胞性牙骨质和不含有牙骨质细胞的无细胞性牙骨质。

“牙髓”是负责牙的生活反应的组织，对生理、病的刺激反应， 形成牙质。由牙髓细胞、神经纤维、细胞外基质、血管等构成。

所谓“再生(regeneration)”是丧失组织、被破坏的组织和损 伤组织的再构成(reconstruction)以及再构建(reproduction)， “牙周组织的再生”是使牙周组织恢复到原来状态的功能。

所谓“修复(repair)”指的是创伤部的结构和功能现在不能以 完全的状态恢复的组织的治愈，在“牙周组织的修复”中，包括对牙 根表面的上皮性附着等。

所谓“防止牙肉上皮沿着牙根面根尖方向侵入”指的是防止牙肉 上皮细胞沿着牙根面向牙根尖侧增殖。

所谓“牙周组织再生用移植材料”是促进牙周组织再生的材料。 为了使BDNF等神经营养因子以一定的浓度作用于所定的生物体部位 (牙槽骨的缺损部位等)，需要某种支架材料(scaffold)。组合了 可成为这样支架材料的材料与BDNF等神经营养因子的材料是本申请 的移植材料。

所谓“牙周病”指的是局部的细菌等为起因引起的牙周组织的发 炎性疾病。

所谓“修复象牙质”指的是受到外来刺激的结果形成的象牙质。

所谓“牙髓疾病”指的是牙髓的发炎性疾病、退行变性等。

本发明在人等温血动物中，特别优选的是适用于人。

本发明中使用的神经营养因子、BDNF、NGF、NT-3、NT-4/5等无 论是通过基因重组或化学合成等人工制造的，还是天然型(native) 的都可以。

本发明的牙周病治疗剂优选是通过外用剂等局部给药。也可以充 填到注射器等，注入到牙周袋内。另外当进行牙周外科治疗时，也可 以向牙周组织的缺损部给药。此时，为了能以一定浓度长时间作用， 优选是使本发明的治疗剂吸收到片材或海绵等后使用。优选将感染的 牙周组织除去之后给药。本发明的治疗剂可以通过注射局部给药。例 如，可以注射到牙周袋部的牙肉，也可以注射到牙槽骨顶部附近的牙 根膜腔。也可以注射到牙根尖部附近。

本发明的修复象牙质形成促进剂优选是通过外用剂等局部给药。 例如，可以将液状、膏状、糊状等修复象牙质形成促进剂运用于露髓 部，也可以运用于断髓(amputation)或拔髓(extirpation of the  pulp)。也可以运用吸收活性成分的片材或海绵，进行一定期间暂封。 或当对由于外伤等脱落的牙进行再植时，也可以运用于牙根尖部等。

作为本发明的牙周病治疗剂和修复象牙质形成促进剂的剂型，如 通过通常的制剂方法使用制剂中容许的载体或稀释剂等制造的膏剂、 软膏剂、洗剂等外用剂以及例如以水系的溶剂为主要成分的注射剂等。 作为粉末状剂型，也可以在使用之前溶解于精制水等后使用。

本发明的牙周病治疗剂和修复象牙质形成促进剂的给药量因给予 对象的年龄、性别、症状等不同而有所差异，在局部给药时，通常每 一颗牙作为神经营养因子为1×10^-12g～1×10^-3g、特优选1×10^-11g～ 1×10^-7g、更优选1×10^-10g～1×10^-8g。一般来说，当通过注射局部 给药时，比外用药少的给药量就可以。

本发明的移植材料每一个牙根分叉部缺损中使用的每份量，优选 含有1×10^-12g～1×10^-3g、特别优选1×10^-11g～1×10^-8g、更特别优 选1×10^-10g～1×10^-9g的神经营养因子。

本发明的牙周病治疗剂、修复象牙质形成促进剂和移植材料只要 是不妨碍其有效性，可以与其它药剂组合使用。也可以将BDNF、NGF、 NT-3、NT-4/5相互组合后使用。也可以与来自骨髓的间叶系干细胞 (MSC)、来自牙周韧带的成纤维细胞、牙肉成纤维细胞、血管内皮细 胞等组合使用。也可以与氢氧化钙制剂、抗菌剂等并用。

在本发明的移植材料中作为可与神经营养因子组合的材料只要是 能在给药局部保持神经营养因子的对生物体没有危害性的材料就可 以，例如优选多孔性的片材或海绵等。如果是生物体分解性蛋白质材 料(胶原、明胶、白蛋白、富有血小板的血浆(PRP))或组织吸收性 材料(聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、 透明质酸(HA)、三磷酸钙(TPC))，由于以后不用取出所以更优选。 例如，TERUPLUG R(商品名)(TERUMO株式会社)、GC膜(商品名) (株式会社GC)、Osferion(商品名)(OLYMPUS株式会社)等。

实施例

以下通过实施例对本发明进行更详细说明。

(实施例1)BDNF对来自人牙周韧带成纤维细胞(human  periodontal ligament cell、HPL细胞)和人牙肉上皮细胞(human  gingival keratinocyte、HGK)影响的研究。

(1)使用细胞

(i)来自牙周韧带的成纤维细胞(HPL细胞)

从为矫正治疗而方便拔出的健全的人小臼齿的牙周韧带分离HPL 细胞。为了防止来自牙周韧带周围的其它结缔组织的细胞混入，用手 术刀将除去人小臼齿的齿颈部、除去牙根部的牙根中央部的健康牙周 韧带剥离，切碎。将切碎的组织贴附在直径60mm的细胞培养用皿 (CORNING、NY)，于37℃、5％CO₂气相条件下进行培养。培养基使 用添加了10％FBS(GIBCO、Buffalo、NY)、盘尼西林(100单位/ml) (明治制果、东京)、链霉素(100μg/ml)(明治制果)、以及两性 霉素B(1μg/ml)(GIBCO)的Dulbecco改进培养基(DMEM、日水制 药、东京)(这里使用的培养基表记为“培养基A”)。将进行了4～ 8代继代的HPL细胞供以下实验用。

(ii)人牙肉上皮细胞(HGK)

要将使用人培养细胞的实验的必要性以及牙肉的使用目的等对患 者充分说明，征得患者同意后，接受牙肉的提供。以智齿牙周炎患者 当在拔掉成为病因的智齿时，可以从剩余的牙肉边(gingival flap) 获得牙肉片。将得到的牙肉片于4℃下用含有0.01％乙二胺四乙酸 (EDTA)和0.025％胰蛋白酶的Dulbecco PBS(-)(PBS(-)、日 水制果)处理一昼夜，分离HGK。用含有牛胰岛素(10μg/ml)(Sigma、 St.Rouis，MO，USA)、人转运铁蛋白(5μg/ml)(Sigma)、2-巯基 乙醇(10μM)、2-氨基乙醇(10μM)、亚硒酸钠(10μM)、牛下垂 体提取液(50μg/ml)、盘尼西林(100单位/ml)、链霉素(100μ g/ml)以及两性霉素B(50ng/ml)的MCDB153培养基(Sigma)进行 初代培养(将这里使用的培养基表记为“培养基C”)。培养使用牛I 型胶原被覆的直径60mm培养皿(SUMILON CELTITE C-1、住友 BAKELIGHT、东京)，于37℃、5％CO₂气相条件下进行。将进行了3～ 4代继代培养的HGK供以下实验用。

(2)BDNF和它的受体在HPL细胞中的表达

对于BDNF和TrkB的mRNA在HPL细胞以及人牙周韧带中的表达使 用用于RT-PCR的第1条链cDNA合成试剂盒(Roche、Indianapolis)， 通过逆转录PCR法进行研究。

当上述(1)(i)中得到的HPL细胞达到铺满时，回收细胞，通 过ISOGEN(Nippin Gene，东京)使细胞溶解后，加氯仿进行离心分 离，向得到的水相中加异丙醇，提取总RNA。

将上述(1)(i)中得到的人牙周韧带在ISOGEN中均匀化后，加 入氯仿进行离心分离，在得到的水相中加入异丙醇，提取总RNA。

对于纯化的总RNA中的1μg的各个RNA使用寡dT引物进行逆转 录，通过PCR反应30个循环使得到的cDNA扩增后，进行1.5％琼脂 糖凝胶电泳。作为对照使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

结果如图1所示。作为对照使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。 就像图表明的那样，在人牙周韧带中看到BDNF和TrkB的mRNA的表达， 在从该人牙周韧带分离、培养的HPL细胞中也确认BDNF和TrkB的mRNA 表达。

(3)细胞用BDNF处理

(i)HPL细胞

将上述(1)(i)中得到的HPL细胞在用牛I型胶原被覆的直径 60mm培养皿(SUMILON CELTITE C-1)，每一个皿3.5×10⁵个，使用 含有50μg/ml的L-抗坏血酸的培养基A，于37℃、5％CO₂气相条件 下培养13天(将这里使用的培养基记为“培养基B”)。培养基每2 天交换一次。在第14天培养结束前0、3、6、12或24小时，用DMEM 将细胞洗2次，换成含有最终浓度0、1、10、50或100ng/ml的BDNF (Recombinant Human BDNF、R&D system、Minneapolis、USA)的无 血清培养基(添加了盘尼西林(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml) 以及两性霉素B(1μg/ml)(GI BCO)以及L-抗坏血酸(50μg/ml) 的DMEM)(将这里使用的培养基记为“培养基D”)。

(ii)HGK

将上述(1)(ii)中得到的HGK按照2×10³个/孔接种到用牛I 型胶原被覆的96孔板(SUMILON CELTITE C-1板96F、住友BEKELIGHT)， 于37℃、5％CO₂气相条件下，使用培养基C进行培养。培养基每2天 交换一次。当处于细胞增殖期的培养第4～5天，将板的细胞用MCDB153 培养基洗2次，换成含有最终浓度0、1、10、25、50或100ng/ml的 BDNF的培养基(除了不含牛下垂体提取液以外，其它与培养基C同一 组成的培养基)培养24小时。

(4)骨相关蛋白在HPL细胞中的表达

(i)mRNA的表达

与上述(3)(i)所述方法同样操作，使用ISOGEN从用最终浓度 0、1、10、50或100ng/ml的BDNF处理的HPL细胞提取、纯化总RNA。 碱性磷酸酶(ALPase)、骨形成蛋白-2(bone morphogenetic  protein-2，BMP-2)、骨形成蛋白-4(bone morphogenetic  protein-4、BMP-4)、骨桥蛋白(osteopontin、OPN)、护骨蛋白 (osteoprotegerin、OPG)的mRNA表达量使用ABI PRISM7700 (Applied Biosystems、东京)，通过实时监测PCR产物生成过程进 行定量解析(Real-time PCR法)。作为对照使用GAPDH。

对于各个骨相关蛋白的mRNA表达的BDNF的经时效果测定的结果 如图2A～2C、3A、3B所示，浓度效果测定的结果如图4A～4C所示。 在各个图中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(统计学的鉴定通过 t-test)。

就像这些图所表明的那样，BDNF不影响OPG、BMP-4的mRNA表 达，但ALPase、BMP-2、OPN的mRNA表达量依赖于浓度和时间，随着 它们增加而增加。

(ii)蛋白质的表达

将上述(1)(i)中得到的HPL细胞按照1×10⁴个/孔接种到用 牛I型胶原被覆的48孔板(SUMILON CELTITE C-1板48F、住友 BEKELIGHT)，使用培养基B培养13天。培养基每2天交换一次。在 第14天培养结束前24小时，将板的细胞用DMEM培养基洗2次，换成 含有最终浓度0、1、10、25、50或100ng/ml的BDNF的无血清培养基 D。培养结束后，回收上清，通过ELI SA法测定上清中的分泌OPN量、 分泌BMP-2量。在分泌OPN量的测定中使用夹心ELI SA试剂盒(IBL、 群马)，在分泌BMP-2量的测定中使用夹心ELISA试剂盒(R&D  system)。

图5中给出了BDNF对于HPL细胞的分泌OPN量和分泌BMP-2量 的经时效果测定以及浓度效果测定的结果。在各个图中，*表示p＜ 0.05，**表示p＜0.01(统计学的鉴定通过t-test)。就像图5所表 明的那样，BDNF促进OPN和BMP-2在HPL细胞中的分泌。

(5)HPL细胞和HGK的增殖

对于BDNF对HPL细胞和HGK的DNA合成能力的影响使用Cell  Proliferation ELISA system，version 2(Amersham Pharmacia  Biotech)通过ELISA法进行测定。

将上述(1)(i)中得到的HPL细胞按照5×10³个/孔接种到用 牛I型胶原被覆的96孔板(SUMILON CELTITE C-1板96F、住友 BEKELIGHT)，使用培养基B培养10天。将细胞用DMEM洗2次，替代 10％FBS用添加了0.3％FBS的培养基B培养24小时后，与向同一培 养基按照最终浓度为0、1、10、25、50或100ng/ml添加了BDNF制备 的培养基交换，再培养24小时。培养结束的前2小时(即BDNF添加22 小时后)，以10ng/ml的浓度向各个孔添加溴脱氧尿苷(BrdU)，整 合到细胞。培养在37℃、5％CO₂气相条件下进行。

将上述(1)(ii)中得到的HGK用与上述(3)(ii)同一方法 进行培养，用BDNF处理。培养结束的前2小时(即BDNF添加22小 时后)，以10ng/ml的浓度向各个孔添加溴脱氧尿苷(BrdU)，整合 到细胞。

培养结束后，将HPL细胞和HGK固定后，进行封闭，使过氧化物 酶标记抗BrdU抗体于室温下作用2小时，加TMB(3，3′，5，5′-四甲基 联苯胺)底物，用吸光度计(MICRO PLATE READER、TOSOH)测定波长 450nm的吸光度。作为对照，对使碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在最终浓度0、0.3、1、3、5、10ng/ml下作用24小时的细胞进行同 样处理，测定DNA合成能力。

结果如图6所示。(A)表示对HPL细胞的效果的图，(B)表示 对HGK的效果的图。在各个图中*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(统 计学的鉴定通过t-test)。

就像图6所表明的那样，BDNF促进HPL细胞的DNA合成能力，而 对HGK的DNA合成能力没有影响。

(6)HPL细胞的胶原合成

将上述(1)(i)中得到的HPL细胞接种到用牛I型胶原被覆的 48孔板，使用培养基B培养13天。培养基每2天换一次。在第14日 的培养结束的前0、3、6、12或24小时，将板中细胞用DMEM洗2次， 换成含有最终浓度0、1、10、25、50或100ng/ml的BDNF的无血清培 养基D。

使用I型原胶原C-肽(Procollagen type IC-peptide)(PIP) EIA试剂盒(TAKARA)，通过ELISA法测定HPL细胞的胶原合成量。 使用对I型胶原C末端前肽(PIP)特异的单克隆抗体(过氧化物酶标 记)通过吸光度计(MICRO PLATE READER)测定波长450nm的吸光度 来测定HPL细胞培养上清中的胶原合成量。

结果如图7所示。(A)表示BDNF对I型胶原合成的浓度效果测 定的结果，(B)表示经时效果测定的结果。就像图7表明的那样，BDNF 可使HPL细胞的I型胶原合成量增加。

(实施例2)

BDNF在Beagle犬的3级牙根分叉部病变模型中的效果的研究。

使浓度5、25、50μg/ml的BDNF溶液(灭菌生理盐水液中)的 25μl浸透直径8mm×5mm的TERUPLUG R(商品名)(TERUMO)，作为 移植材料。

将7只雌beagle犬(12～20个月龄、体重10～14kg)通过DOMI TOR (明治制果)肌肉注射镇静下来，用手动刮牙器(scaler)进行全颚 刮牙。以后按照每2天一次的比例进行刷牙和用以聚维酮碘为有效成 分的漱口药ISOJIN(商品名)(明治制果)进行口腔清扫一个月，确 立临床上健康牙周组织的状态。

对这些Beagle犬通过戊巴比妥系麻醉剂的静脉内注射实施全身 麻醉，对左右两侧下颚颊侧牙肉进行浸润麻醉，由第一小臼齿远心 (distal part)至第一大臼齿近心(mesial part)的牙肉切开一个 沟，剥离牙肉，形成粘膜骨膜瓣。然后，用圆头锉(bur)和骨凿消除 左右两侧第二、第三、第四小臼齿的牙根分叉部牙槽骨，做成牙根分 叉部3级(按照Lindhe&Nyman的分类)的骨缺损。骨缺损的大小从 未处置的牙根分叉部正下方至约4mm靠近牙根尖侧。

将露出的牙根面的残存牙骨质用手动刮牙器除去后，将牙根分叉 部骨缺损内用生理盐水充分清洗，冲去碎片，每一处填塞直径8mm× 5mm的TERUPLUG R移植材料。作为对照填塞渗透了不含BDNF，而只含 灭菌生理盐水25μl的8mm×5mm的TERUPLUG R移植材料。

手术6周后，在通过戊巴比妥系麻醉剂的静脉内注射实施全身麻 醉下，用4％多聚甲醛对全身进行灌流固定。灌流固定后，切断下颚， 将处理的牙和牙周组织一块摘出。将得到的标本于4％聚多甲醛中浸 渍固定1天后，用10％EDTA除去石灰质，根据通用做法进行乙醇脱水， 包埋在石蜡中。从该标本制作在近远心方向(mesial-distal plane) 与牙轴平行的切片(厚度约5μm)实施苏木精曙红染色。

在做成的组织标本中，选择与近远心方向牙轴平行，而且在牙根 中央附近被切得很薄的标本，用光学显微镜(ECLIPSE E600、NIKON) 进行组织观察和计测。骨再生率以再生牙槽骨的面积与裸露的牙根分 叉部缺损的面积的比例(百分率)表示。牙骨质再生率以再生牙骨质 的长度与裸露的牙根面的长度的比例(百分率)表示。

结果如图8、9A、9B、10所示。图8的(A)表示BDNF对牙骨质 再生的效果的测定结果，图8的(B)表示BDNF对牙槽骨再生的效果 的测定结果。图9A是没有给予BDNF(对照)的牙根分叉部骨缺损部 的苏木精曙红染色标本，图9B是给予BDNF(填塞含有BDNF(5μg/ml) 的移植材料)的牙根分叉部骨缺损部的光学显微镜像(倍率20倍)。 图10是图9B的牙根分叉部正下方的部分放大像(倍率200倍)。

就像图8表明的那样，通过给予BDNF，在狗的3级牙根分叉部病 变模型中证实牙骨质的再生和牙槽骨的再生。

在图9A的对照标本中，虽然牙骨质、牙槽骨、牙周韧带的再生可 观察到少许，但停留在从骨缺损底部到牙冠侧方向大约1/2处。在牙 根分叉部正下方的缺损部没有看到牙骨质再生、牙槽骨再生，但看到 上皮的进入，被以成纤维细胞、胶原纤维、血管为主体的结缔组织占 据。

在图9B和图10的给予BDNF的牙根分叉部骨缺损部的标本中，在 裸露的牙根面的几乎所有部分牙骨质再生，没有看到上皮的侵入。另 外，在再生牙骨质和再生牙槽骨之间还观察到维持一定宽度的牙周韧 带。

(实施例3)

NGF对HPL细胞和HGK的影响的研究。

(1)NGF和它的受体在HPL细胞中的表达

用与上述实施例1(2)同一的方法从HPL细胞回收、纯化总RNA。 将得到的的总RNA作为样品，通过Northern blot法测定NGF和TrkA 的mRNA表达。作为对照使用GAPDH。

结果如图11A、11B所示。图11A表示NGF的mRNA的表达，图11B 表示TrkA的mRNA表达。就像图所表明的那样，确认NGF的mRNA和 TrkA的mRNA在HPL细胞中都表达。

(2)骨相关蛋白在HPL细胞中的表达

NGF对HPL细胞中的骨相关蛋白的mRNA表达的影响的测定。

除了使用最终浓度0、5、10、25、50或100ng/ml的NGF (Recombinant Human NGF、R&D system、Minneapolis、USA)取代 BDNF以外，用与实施例1(4)(i)同一的方法对HPL细胞进行处理。 用与实施例1(4)(i)同一的方法对NGF处理的HPL细胞的ALPase、 BMP-2、OPN的各个mRNA表达量进行测定。

图12、13、14分别给出了NGF对于OPN、ALPase、BMP-2的各个 mRNA表达的经时效果测定和浓度效果测定的结果。在各个图中，*表 示p＜0.05，**表示p＜0.01。检验通过t-test。

就像图12、13、14所表明的那样，NGF依赖于浓度和时间使ALPase、 BMP-2、OPN的mRNA表达量增加。

(3)HPL细胞和HGK的增殖

NGF对HPL细胞和HGK的DNA合成能力影响的测定。

除了使用最终浓度0、5、10、25、50或100ng/ml的NGF取代BDNF 以外，用与实施例1(5)同一的方法对HPL细胞和HGK的DNA合成能 力进行处理。用与实施例1(5)同一的方法对NGF处理的HPL细胞和 HGK进行测定。

图15给出了测定结果。NGF作用时间都是24小时。(A)表示对 HPL细胞的效果，(B)表示对HGK的效果。在各个图中，*表示p＜0.05， **表示p＜0.01。鉴定通过t-test。

就像图15所表明的那样，NGF促进HPL细胞的DNA合成能力，而 使HGK的DNA合成能力降低。

(实施例4)

NT-3对HPL细胞和HGK影响的研究。

(1)NT-3和它的受体在HPL细胞中的表达

用与上述实施例1(2)同一的方法从HPL细胞回收、纯化总RNA。 将得到的的总RNA作为样品，通过Northern blot法测定NT-3和TrkC 的mRNA表达。作为对照使用GAPDH。

结果如图16A、16B所示。图16A表示NT-3的mRNA的表达，图 16B表示TrkC的mRNA表达。就像这些图所表明的那样，确认NT-3 的mRNA和TrkC的mRNA在HPL细胞中都表达。

(2)骨相关蛋白在HPL细胞中的表达

NT-3对HPL细胞的ALPase活性影响的测定。

除了使用最终浓度0、1、10或50ng/ml的NT-3(Recombinant Human NT-3、R&D system、Minneapolis、USA)取代BDNF以外，用 与实施例1(3)(i)同一的方法对HPL细胞进行处理，该ALPase活 性按照Bessey-Lowry法进行定量。即用磷酸缓冲液将NT-3处理的 HPL细胞洗3次，加10mM Tris盐酸缓冲液后，在冰冷下进行超声波 处理，制备样品。使用对硝基苯磷酸作为底物的ALPase测定试剂盒(和 光纯药)，测定样品中的ALPase活性。

图17给出了对于ALPase活性的NT-3浓度效果测定的结果。NT -3作用时间都是24小时。就像图表明的那样，几乎没有看到NT-3 对ALPase活性有什么影响。

(3)HPL细胞的增殖

除了使用最终浓度0、1、5、10、50或100ng/ml的NT-3取代 BDNF以外，用与实施例1(5)同一的方法对用实施例1(1)同一方 法分离的HPL细胞进行处理。用与实施例1(5)同一的方法对它的DNA 合成能力进行测定。

图18给出了测定结果。NT-3作用时间都是24小时。在各个图 中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。鉴定通过t-test。就像图表明 的那样，NT-3促进HPL细胞的DNA合成能力。

(实施例5)

对在来自人牙周韧带成纤维细胞(human periodontal ligament  cell、HPL细胞)中NT-4/5导致骨相关蛋白的mRNA表达进行研究。

(1)用NT-4/5处理HPL细胞

将上述实施例1(1)(i)中得到的HPL细胞按照每皿3.5×10⁵个接种到用牛I型胶原被覆的直径60mm的培养皿(SUMILON CELTITE C-1)，使用50μg/ml的培养基B在37℃、5％CO₂气相条件下培养13 天。培养基每2天交换一次。在第14天培养结束前0、3、6、12或 24小时，将细胞用DMEM洗2次，换成含有最终浓度50ng/ml的NT- 4/5(R&D)的培养基D。

(2)mRNA在HPL细胞中的表达

与上述(3)(i)所述方法同样操作，使用ISOGEN从用最终浓度 50ng/ml的NT-4/5处理的HPL细胞提取、纯化总RNA。ALPase、BMP -2、OPN、骨钙蛋白(OCN)、BMP-7、BMP-4、OPG的mRNA表达量使 用ABI PRISM7700(Applied Biosystems、东京)，通过实时监测PCR 产物生成过程进行定量解析(Real-time PCR法)。作为对照使用 GAPDH。

对于各个骨相关蛋白的mRNA表达的NT-4/5的经时效果测定的结 果如图19A、19B、19C所示。在各个图中*表示p＜0.05，**表示p＜ 0.01(统计学的鉴定通过t-test)。就像图所表明的那样，在HPL细 胞中NT-4/5促进OPN、BMP-2、ALPase、OCN、BMP-7的mRNA表达。 然而，对BMP-4、OPG的表达没有影响。

(实施例6)

NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5对人牙髓细胞(human pulp cell，HP 细胞)的影响的研究。

(1)使用细胞

将在方便除去牙髓时得到的健全牙髓切碎。将切碎的组织贴附在 直径60mm的细胞培养用皿(CORNING、NY)，于37℃、5％CO₂气相条 件下用培养基A进行培养。将进行了4～8代继代的HP细胞供以下实 验用。

(2)细胞用NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5处理

将NGF、BDNF、NT-3或NT-4/5按照最终浓度0、5、10、25、 50或100ng/ml加到培养基D中，制备含有各种浓度的神经营养因子 的培养基。将上述(2)得到的HP细胞在用牛I型胶原被覆的直径60mm 培养皿(SUMILON CELTITE C-1)，每一个皿3.5×10⁵个，使用培养 基B，于37℃、5％CO₂气相条件下培养13天。培养基每2天交换一次。 在第14天培养结束前24小时，用DMEM将细胞洗2次，换成含有任一 个神经营养因子的培养基。

(3)mRNA在HP细胞中的表达

使用ISOGEN从在上述(1)用各种浓度NGF、BDNF、NT-3或NT -4/5处理24小时的HP细胞提取、纯化总RNA。ALPase、BMP-2、牙 质唾液酸磷酸蛋白(DSPP)、I型胶原(collagen)、OPN、OCN的mRNA 表达量使用ABI PRISM7700(Applied Biosystems、东京)，通过实 时监测PCR产物生成过程进行定量解析(Real-time PCR法)。作为 对照使用GAPDH。

对于NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5对于各个骨相关蛋白的mRNA 表达的浓度效果测定的结果分别如图20、21、22、23所示。就像图所 表明的那样，NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5在HP细胞中促进ALPase、 BMP-2、DSPP、OPN、OCN的mRNA表达。BDNF和NT-4/5也促进I型 胶原mRNA的表达。

(4)HP细胞的增殖

NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5对于对HP细胞的DNA合成能力的影 响使用Cell Proliferation ELISA system，version 2(Amersham  Pharmacia Biotech)通过ELISA法进行测定。

取代10％的FBS，向添加了0.3％FBS的培养基B按照最终浓度为 0、5、10、25、50或100ng/ml分别添加NGF、BDNF、NT-3或NT- 4/5，制备含有各种神经营养因子的培养基。

将上述(1)中得到的HP细胞按照5×10³个/孔接种到用牛I型 胶原被覆的96孔板(SUMI LON CELTI TE C-1板96F)，使用培养基B 培养10天。将细胞用DMEM洗2次，取代10％的FBS，用添加了0.3％ FBS的培养基B培养24小时后，换成上述的含有各种神经营养因子的 培养基，再培养24小时。培养结束的前2小时(即神经营养因子添加 22小时后)，以10ng/ml的浓度向各个孔添加溴脱氧尿苷(BrdU)， 整合到细胞。培养在37℃、5％CO₂气相条件下进行。

培养结束后，对HP细胞进行固定后，进行封闭，使过氧化物酶标 记抗BrdU抗体于室温下作用2小时，加TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯 胺)底物，用吸光度计(MICRO PLATE READER、TOSOH)测定波长450nm 的吸光度。

结果如图24所示。就像图表明的那样，NGF、BDNF、NT-3或NT -4/5促进HP细胞的DNA合成能力。

(实施例7)

NGF、BDNF、NT-3、抗坏血酸对人间叶系干细胞(human  mesenchymal stem cell、HMS细胞)影响的研究。

(1)使用细胞

HMS细胞的分离按照堤等人(S.Tsutsumi：BBRC，26，288(2)，2001) 方法进行。即，在取得完全告知同意的患者的智齿拔去时，向下颚骨 髓腔进行穿刺，得到骨髓液。将得到的骨髓液与含有肝磷脂钠(heparin  sodium)(200U/ml，Sigma，美国)的Dulbecco改进的Eagle培养 基(DMEM、Sigma、美国)迅速混合，进行离心分离(150g，5分钟)。 离心分离后除去上清，将得到的细胞成分悬浮于含有10％的胎牛血清 (FCS，Biological Industries，Israel)、100单位/ml的盘尼西 林(明治制果、东京)、100μg/ml的链霉素(明治制果、东京)、1 μg/ml的两性霉素B(GI BCO，美国)的DMEM，按照骨髓液为200～500 μl/dish、培养基为10ml/dish那样接种于直径100mm的细胞培养用 培养皿(Corning、美国)。培养在37℃、5％CO₂气相条件下进行。 以后每隔4天进行培养基交换。在增殖的细胞刚达到铺满时，用含有 0.05％胰蛋白酶(GIBCO，美国)、0.02％EDTA(片山化学，大阪)、 100单位/ml的盘尼西林、100μg/ml的链霉素的磷酸缓冲生理盐水 (PBS，日水制药，东京)使细胞分散。分散的细胞按照最终细胞密度 为1.0×10⁶细胞/ml那样悬浮于含有20％的FCS、10％二甲基亚砜 (DMSO，片山化学，大阪)、100单位/ml的盘尼西林、100μg/ml的 链霉素的DMEM中，按照每管1ml分装于血清管(住友BAKELI TE，东 京)后，于-20℃下冷冻2小时，-80℃下冷冻过夜后，保存在液氮 中。

(2)骨相关蛋白的mRNA在HMS细胞中的表达

(i)将细胞用NGF、BDNF、NT-3处理

将上述(1)得到的HMS细胞悬浮于含有10％的FCS的DMEM(含 有100单位/ml的盘尼西林(明治制果，东京)、100μg/ml的链霉素 (明治制果，东京)、的1μg/ml的两性霉素B(GIBCO，美国))中， 按照1.0×10⁵细胞/孔的密度接种在6孔细胞培养板上。将细胞培养 一周，在细胞要达到铺满前的时点，换成不含有FCS的DMEM(含有100 单位/ml的盘尼西林(明治制果，东京)、100μg/ml的链霉素(明治 制果，东京)、1μg/ml的两性霉素B(GIBCO，美国))，使NGF、 BDNF、NT-3中的任一个都以100ng/ml浓度作用12小时和24小时。 培养结束后使用ISOGEN(商品名)进行总RNA的提取。

(ii)mRNA的表达

使用对ALPase、OCN、OPN、骨唾液酸蛋白(BSP)、I型胶原特异 的引物进行PCR。PCR反应在进行94℃、2分钟变性后，按照每一循环 为94℃15秒、退火30秒、72℃50秒反复进行30循环(只有BSP进 行35循环)，最后72℃进行7分钟的延伸。得到的PCR产物使用含 有0.002％溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶的2％琼脂糖凝胶 进行电泳。电泳后的带浓度用NIHimage进行测定。

结果如图25A～E、26A～E27以及27A～E所示。就像图表明的那 样，没有看到NGF对HMS细胞的ALPase、OCN、OPN、BSP、I型胶原的 任一个mRNA表达有显著作用。BDNF明显促进ALPase、OPN、BSP、BMP -2的mRNA表达，也对OCN的基因表达有些促进。NT-3促进ALPase 和I型胶原的mRNA表达。

(3)抗坏血酸、NGF、BDNF、NT-3对HMS细胞增殖的影响

将上述(1)得到的HMS细胞悬浮于含有10％FCS的DMEM(日水 制药制)(含有100单位/ml的盘尼西林(明治制果、东京)、100 g/ml的链霉素(明治制果、东京)、1μg/ml的两性霉素B(GIBCO， 美国))，按照5.0×10³细胞/孔的密度接种在96孔细胞培养板 (Corning、美国)。试验组在培养开始24小时后分别单独向培养基 中50μg/ml的抗坏血酸(Sigma、美国)、100ng/ml的NGF (FUNAKOSHI，东京)、100ng/ml的BDNF(FUNAKOSHI，东京)、或 100ng/ml的NT-3(FUNAKOSHI，东京)，再培养7天。培养基交换在 第4天进行。对照组为用含有10％FCS的DMEM(日水制药制)(含有 100单位/ml的盘尼西林(明治制果、东京)、100μg/ml的链霉素(明 治制果、东京)、1μg/ml的两性霉素B(GI BCO，美国))培养的细 胞。培养7天后，培养基全部换成含有10％FCS的DMEM(含有100单 位/ml的盘尼西林(明治制果、东京)、100μg/ml的链霉素(明治制 果、东京)、1μg/ml的两性霉素B(GIBCO，美国))，使用CellTiter96 (商品名)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega、美国)，通过测定490nm的吸光度计测活细胞数。

结果如图28所示。图的纵轴表示试验组相对于对照组的吸光度的 百分率。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01(统计学的鉴定通过t-test)。 就像图所表明的那样，添加了抗坏血酸、NGF、BDNF、NT-3中任一个 的培养基培养的HMS细胞与对照相比表现出有意义的很高的细胞增 殖。特别是抗坏血酸、BDNF、NT-3的增殖促进作用比NGF强。

(实施例8)

在Beagle犬的3级牙根分叉部病变模型中NGF和NT-3的效果的 研究。

除了取代浓度5、25、50μg/ml的BDNF溶液(灭菌生理盐水液中) 的25μl，使浓度100μg/ml的NGF溶液(灭菌生理盐水液中)的25 μl浸透直径8mm×5mm的TERUPLUG R后的材料和使浓度100μg/ml 的NT-3溶液(灭菌生理盐水液中)的25μl浸透的材料作为移植材 料以外，其它与实施例2同样进行实验。从做成的组织标本(苏木精 曙红染色)选择与近远心方向牙轴平行，而且在牙根中央附近被切得 很薄的标本，用光学显微镜(ECLIPSE E600、NIKON)进行观察。

图29A是填塞含有NGF的移植材料的牙根分叉部骨缺损部的光学 显微镜像，图29B是填塞含有NT-3的移植材料的牙根分叉部骨缺损 部的光学显微镜像(倍率20倍)。就像图表明的那样，通过给予NGF 或NT-3，在狗的3级牙根分叉部病变模型中观察到再生骨。

产业上利用的可能性

本发明的牙周病治疗剂、修复象牙质形成促进剂、治疗方法、牙 周组织再生用移植材料、牙周组织的再生方法在牙周病治疗和牙内疗 法中都具有能成为有效治疗的可能性。