化合物(20R,24R)-24,25-16,23-23,27-三环氧-12-乙酰氧基-9,19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙在制药中的应用

摘要

一种从升麻中提取的化合物DA即(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙[(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-triepoxy-12-acetoxyl-9，19-Cyclolanostanol-3-O-β-D-xylopyranoside]在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备抗乳腺癌的药物中的应用，以及化合物DA的制备方法。

说明书

所属领域：

本发明属于药物学领域，具体地，涉及一种从升麻中提取的化合物DA即 (20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡 喃木糖甙[(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-triepoxy-12-acetoxyl-9，19-Cyclolanostanol- 3-O-β-D-xylopyranoside]在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在制备抗乳腺癌 的药物中的应用。

背景技术：

升麻是我国十分常用的著名中药，主要为毛茛科植物三叶升麻Cimicifuga  heracleifolia Kom、兴安升麻C.dahurica Maxim、升麻或绿升麻C.foetida L.的 干燥根茎。这三种药用植物的根茎，已经作为中药升麻药材，收载入《中华人 民共和国药典》(2010年版)。升麻具有发表透疹，清热解毒，升举阳气的功 效；常被用于风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑，脱 肛，子宫脱垂等病症。升麻Cimicifuga foetida L.主要产于云南、贵州、四川、 湖北等地，是大量栽培或野生的常用中药材。

同属植物黑升麻(Cimicifuga racemosa L.)，又称蛇根草，在欧美国家也有 很长的使用历史。印地安人饮用煎煮的黑升麻药汁解除疲劳，治疗喉痛、关节 炎与毒蛇咬伤等症，同时也用于治疗一些妇科疾病，并在1820-1926年被收入 到美国药典。英国也将黑升麻载入英国草药典，1749年Linnaeus将黑升麻收入 《Materia Medica》，20世纪初成为顺势疗法的主要药物之一。

升麻属植物的化学成分和药理活性研究一直是国内外研究热点。近十年来 从其中分离得到三萜及其苷类、苯丙素类、色酮及其他类型化合物200多个。 国际上对升麻中化学成分的研究主要集中在其三贴皂苷类成份上，对其药理活 性研究则以类雌激素、抗骨质疏松为主。在德国、日本、美国等发达国家都分 别开发出了治疗更年期综合症和骨质疏松症的药物。与国际上研究的热点不 同，本发明为了拓展升麻三萜化合物研究的新领域，充分利用云南省升麻资 源，开发其新用途。

发明内容：

本发明旨在提供一种从升麻中提取的化合物DA即(20R，24R)-24，25-16，23- 23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙[(20R，24R)- 24，25-16，23-23，27-triepoxy-12-acetoxyl-9，19-Cyclolanostanol-3-O-β-D- xylopyranoside]在制备抗肿瘤药物中的应用，以及化合物DA的制备方法。

本发明的上述目的是用下面的技术方案加以实现的：

化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷- 3-O-β-D-吡喃木糖甙在制备抗肿瘤药物中的应用。

化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷- 3-O-β-D-吡喃木糖甙在制备抗乳腺癌药物中的应用。

化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷- 3-O-β-D-吡喃木糖甙的制备方法，取升麻Cimicifuga foetida L.干燥根茎，粉碎 后用80％甲醇提取三次，每次4小时；80％甲醇提取液过滤除去药渣后，减压 浓缩至蒸不出甲醇；再加一定量的水稀释之后，用石油醚萃取2-3次，回收石 油醚后，浓缩得到石油醚提取部位；然后水层再用氯仿萃取2-3次，回收氯 仿，浓缩得到氯仿提取部位；氯仿提取部位用硅胶柱层析分离，洗脱液用40∶1 的氯仿∶甲醇或氯仿∶丙酮反复洗脱，洗脱后结晶纯化得化合物(20R，24R)-24，25- 16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙。

化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷- 3-O-β-D-吡喃木糖甙的制备方法，取升麻Cimicifuga foetida L.干燥根茎，粉碎 后用80％的甲醇水溶液90℃回流提取3次，提取液除去大部分甲醇后，分别 用石油醚，氯仿，正丁醇萃取；回收溶剂后，得石油醚部分、氯仿部分、正丁 醇部分；氯仿部分用硅胶拌样，硅胶层析；用1∶0，40∶1，20∶1，10∶1的氯仿： 甲醇梯度洗脱，TLC检测合并相同部分，得到四个组分Fr.A-D；其中Fr.B硅 胶拌样，硅胶层析柱，常压层析分离，用40∶1氯仿∶甲醇反复洗脱层析，得到 化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷-3-O- β-D-吡喃木糖甙。

本发明的化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环 羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙(简称DA)可直接作为药物使用，其余辅料为 药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的药用载体或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、 超填料以及药物制品辅剂。将所述的有效提取物或有效部位以单位体重服用量 的形式使用。本发明的药物可经口服和口腔喷雾两种形式给药。

口服可用其固体或液体制剂，如粉剂、片剂、糖衣片剂、胶囊、酊剂、糖 浆、滴丸剂等。

口腔喷雾可用其固体或液体制剂。

本发明药物可用于治疗和预防抗肿瘤，特别用于治疗乳腺癌疾病。本发明 药物具有疗效非常显著，起效快，服药量低，方便患者等优点。

附图说明：

图1：各个组别裸鼠照片，图1A模型对照组；图1B他莫昔芬组；图1C 化合物DA高剂量；图1D化合物DA中剂量；图1E化合物DA低剂量；

图2：各个组别肿瘤照片，图2A模型对照组；图2B他莫昔芬组；图2C 化合物DA高剂量；图2D化合物DA中剂量；图2E化合物DA低剂量。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但 并不以此来限定本发明。

实施例1：

化合物(20R，24R)-24，25-16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷- 3-O-β-D-吡喃木糖甙(DA)的分离制备：

1、植物特征和样品来源：

绿升麻Cimicifuga foetida L.分布于我国西藏、云南、四川、甘肃、陕西、 河南西部和山西等省份。生于海拔1700-3500米间阴湿的山地林缘林中或路旁 的草丛中。为多年生草本植物，根状茎粗壮，坚实而稍带木质，外皮黑色，生 多数细根。茎单一，常高大，直立，圆柱形，通常在上部少数分枝。叶为一回 至三回三出或近羽状复叶，有长柄；小叶卵形、菱形或狭椭圆形，边缘具有粗 锯齿。花序为总状花序，通常2-30条集成圆锥状花序。花每年7-8月开放， 白色，花瓣状，倒卵状圆形。种子少数，椭圆形至狭椭圆形，黄褐色，通常四 周生膜质的鳞翅，背、腹面的横向鳞翅明显或不明显，9-10月成熟。

升麻(Cimicifuga foetida L.)植物样品2006年采自云南省丽江市玉龙县； 植物标本由中科院昆明植物研究所裴盛基研究员鉴定。

2、化合物DA的分离制备：

干燥升麻根茎10公斤，粉碎后用80％的甲醇水溶液90℃回流提取3次， 提取液除去大部分甲醇后，分别用石油醚，氯仿，正丁醇萃取。回收溶剂后， 得石油醚部分50克，氯仿部分900克，正丁醇部分500克。氯仿部分900克用 1公斤硅胶拌样，1公斤硅胶层析。氯仿∶甲醇(1∶0，40∶1，20∶1，10∶1)梯度 洗脱，TLC检测合并相同部分，得到四个组分：Fr.A-D。其中Fr.B(300克)， 300克硅胶拌样，1公斤硅胶层析柱，常压层析分离，用氯仿∶甲醇(40∶1)反复 洗脱层析，得到化合物DA(1.0g)。

3.化合物DA的结构表征：

化合物DA：C₃₇H₅₆O₁₀，无色针晶，mp 253-254℃，[α]_D＝-61.2°(c＝0.255， CHCl₃-CH₃OH(1∶1))。

氢核磁共振谱数据δ(ppm)(溶剂Py-d5)：5.10(1H，brd，J＝5.3Hz，12-H)； 4.23(1H，brd，J＝6.7Hz，16-H)，4.05(1H，d，J＝10.4Hz，26-H)，4.04(1H，s，24-H)， 3.62(1H，d，J＝10.4Hz，26-H)，3.44(1H，dd，J＝10.8，3.4Hz，3-H)；1.45(3H，s，27-H)， 1.40(3H，s，18-H)，1.29(3H，s，29-H)，1.00(3H，d，J＝6.7Hz，21-H)，0.99(3H，s，30-H)， 0.83(3H，s，28-H)，0.52(1H，d，J＝3.8Hz，19-H)，0.19(1H，d，J＝3.8Hz，19-H)。12- COCH₃部分：2.12(3H，s，2’-COCH₃)。木糖部分：4.83(1H，d，J＝7.2Hz，1’-H)， 4.04(1H，t，J＝10.4Hz，2’-H)，4.10(1H，t，J＝8.6Hz，3’-H)，4.20(1H，m，4’-H)； 3.71(1H，t，J＝10.4Hz，5’-H)，3.35(1H，dd，J＝4.2，10.4Hz，5’-H)。

碳核磁共振谱数据δ(ppm)(溶剂Py-d5)：105.9(s，23-C)，88.1(d，3-C)， 77.0(d，12-C)，74.5(d，16-C)，68.1(t，26-C)，62.5(s，25-C)，62.3(d，24-C)，56.2(d，17- H)，48.8(s，13-C)，47.9(s，14-H)，47.0(s，5-C)，45.6(d，8-C)，44.2(t，15-C)，41.22(s，4- C)，37.6(t，22-C)，36.6(t，11-C)，31.9(t，1-C)，29.9(t，2-C)，29.8(t，19-C)，26.7(s，10-C)， 25.7(t，7-C)，25.7(q，29-C)，23.3(d，20-C)，21.3(q，21-C)，20.3(t，6-C)，20.1(s，9-C)， 19.6(q，28-C)，15.3(q，30-C)，14.3(q，18-C)，13.4(q，27-C)。12-COCH₃部分： 171.6(s，CO)，21.6(q，COCH₃)。木糖部分：107.5(d，1’-C)，75.6(d，2’-C)，78.6(d，3’- C)，71.2(d，4’-C)，67.1(t，5’-C)。

4.化合物DA的化学结构：

化合物DA的化学结构为脱氧阿科特素(Deoxy-Actein)：(20R，24R)-24，25- 16，23-23，27-三环氧-12-乙酰氧基-9，19-环羊毛甾烷-3-O-β-D-吡喃木糖甙[(20R， 24R)-24，25-16，23-23，27-triepoxy-12-acetoxyl-9，19-Cyclolanostanol-3-O-β-D- xylopyranoside]

实施例2：

按实施例1制得活性化合物DA，按DA与赋形剂重量比1∶1的比例加入赋 形剂，制粒压片。

实施例8：

按实施例1制得活性化合物DA，按DA与赋形剂重量比1∶2的比例加入赋 形剂，制粒压片。

实施例9：

按实施例1制得活性化合物DA，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。

实施例10：

按实施例1制得活性化合物DA，再按下述方法制成片剂

片剂：

实施例11：

胶囊剂：活性化合物DA                  100mg

        淀粉                          适量

        硬脂酸镁                      适量

制备方法：将活性化合物DA与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混 合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。

实施例12：

鼻喷雾剂：

制备方法：搅拌下于适当体积的重蒸馏水中每次加入一种成分，直至完全 深解，然后再加入另一种成分。加水至2ml后，将该溶液在无菌过滤器上过 滤，装入瓶中并按照适当的剂量分隔。

实施例13

滴丸：活性化合物DA                      1g

      聚乙二醇6000                      9g

制法：活性化合物DA与聚乙二醇6000熔融液的制备：按上述处方量称取 活性化合物DA加入适量无水乙醇，微热溶解后，加入处方量的聚乙二醇熔融液 中(60℃水浴保温)，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽为止，静置于60℃水浴中 保温30分钟，待气泡除尽，然后将除尽气泡的上述混匀熔融液转入贮液筒内， 在保温80-85℃的条件下，控制滴速，一滴滴地滴入冷凝液中，等冷凝完全， 倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去丸上的冷凝液，放置硅胶干燥器中 或自然干燥即可。

以下通过试验例来进一步阐明本发明所述药物化合物的有益效果：

试验例1：

化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用：

本实验委托南京凯基生物科技发展有限公司完成实验和数据分析处理。

1、实验目的：

根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》和《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究 技术指导原则》的要求，测试化合物A和化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37 裸鼠异种移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。

2、受试药物：化合物DA

配制方法：每次给药前用5％羧甲基纤维素钠稀释至所需浓度

3、阳性对照药物：枸橼酸他莫昔芬(扬子江药业集团有限公司产品；批 号：09052001)

配制方法：每次给药前用生理盐水稀释至所需浓度

4、组别及剂量设置：

模型对照组：5％羧甲基纤维素钠0.1ml/次灌胃给药每天一次连续14 天；

阳性药物对照组：枸橼酸他莫昔芬2mg/Kg灌胃给药每天一次连续14 天；

化合物DA高剂量组：27mg/Kg灌胃给药每天一次连续14天；

化合物DA中剂量组：9mg/Kg灌胃给药每天一次连续14天；

化合物DA低剂量组：3mg/Kg灌胃给药每天一次连续14天；

5、受试动物：

来源、种系、品系：BALB/c裸小鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提 供(实验动物生产许可证：SCXK(沪)2007-0005；实验动物使用许可证： SYXK(军)2007-030)。

日龄：35-40天

体重：18-22g

性别：雄性

动物数：每组8只，共40只

6、移植瘤：

人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠移植瘤，由人乳腺癌细胞BcAP-37细胞株接 种于裸小鼠腋窝皮下而建立。细胞接种量为1×10⁶，接种形成移植瘤后再在裸 小鼠体内传3代后使用。

7、实验方法：

取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm³左右，在无菌条件下匀浆后制备成 1×10⁷/ml细胞悬液，以0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游 标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100mm³后将动物随机分组，每组5 只。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。模型对照组静脉注 射等量生理盐水溶液。给药27天后，小鼠处死，手术剥取瘤块称重。肿瘤体积 (tumor volume，TV)的计算公式为：

TV＝1/2×a×b²

其中a、b分别表示长宽。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计 算公式为：RTV＝V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C (％)，计算公式如下：

$T/C(\%)=\frac{T_{\mathrm{RTV}}}{C_{\mathrm{RTV}}}\times 100$

T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：阴性对照组RTV。

8、实验数据(见表1、表2和图1、图2).

9、结果与讨论：

化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠移植瘤的实验性治疗结果见表 1，2和图1，2。实验结果显示，化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠 移植瘤有一定的生长抑制作用。

化合物DA以27mg/kg、9mg/kg、3mg/kg灌胃给药，连续给药14天时， 对人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠移植瘤的T/C(％)分别为70.02％、62.65％、 60.08％，抑瘤率达54.8％、50.02％、47.5％；同样条件下枸橼酸他莫昔芬以 2mg/kg灌胃给药时对人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠移植瘤的T/C(％)为 71.46％，抑瘤率为33.6％。表明化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠移 植瘤的抑制作用优于或接近一线临床治疗药物枸橼酸他莫昔芬片，是具有前景 的治疗肿瘤天然药物。

10、结论：

化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸小鼠移植瘤有一定的生长抑制作 用。

表1.化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响 (X±SD，n＝6，肿瘤体积：单位mm³)

与空白对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

表1.化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸鼠异种移植肿瘤生长体积变化的影响(续) (X±SD，n＝6，肿瘤体积：单位mm³)

与空白对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；

表2.化合物A和化合物DA对人乳腺癌细胞BcAP-37裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用(X±SD)

与空白对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01