一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法

摘要

本发明为一种测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，该方法是将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为0.2~2：0.2~2的乙腈：乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。该方法有效地分离内生真菌

说明书

技术领域

 本发明属分析化学技术领域，涉及内生真菌中苦马豆素的分离测定，具体是一种测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法。

背景技术

苦马豆素（SW）是吲哚里西啶生物碱，化学名为1,2,8-三羟基-8-氢-吲哚里西啶。SW是疯草（豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称）中的主要毒性成分。疯草在世界范围内分布广泛，动物大量采食后可引起中毒，甚至死亡。

苦马豆素不仅是一种植物源性毒素，而且它还具有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。因为SW是一种极强的α-甘露糖苷酶抑制剂，不仅能抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达，还可抑制肿瘤细胞的生长和转移、诱导细胞凋亡，刺激机体的免疫系统，增强杀灭肿瘤细胞的能力。因此SW也被作为抗肿瘤药物的必选后备药。

研究发现植物病原真菌豆类丝核菌、昆虫病原真菌金龟子绿僵菌可以产生SW。2000年，Harris等的首次证实SW的来源与疯草中的内生真菌密切相关；2003年，Braun等从美国3种疯草（Astragalus mollissimus, Oxytropis lambertii, O. sericea）的根、茎、叶、花、种子中都分离到Embellisia属的内生真菌，并且这些内生真菌能够产生SW，发现内生真菌分离率高的疯草，其苦马豆素含量也高。2008年，余永涛等从中国冰川棘豆、茎直黄芪、毛瓣棘豆等疯草中也分离出了可产苦马豆素的内生真菌Undifilum oxytropis。

目前对苦马豆素的检测主要采用薄层色谱法和气相色谱法。薄层色谱法是针对SW的定性检测，由于其灵敏度低，不适于定量检测；气相色谱法是目前定量测定苦马豆素的有效方法。但是在用气相色谱检测苦马豆素前，需要用衍生化试剂对样品进行前处理。衍生化反应复杂、费时。而且衍生化反应对反应条件要求非常苛刻。

由于苦马豆素自身缺少发光基团，应用高效液相色谱-紫外检测法很难对苦马豆素进行检测，从而限制了传统的高效液相色谱在检测苦马豆素方面的应用。蒸发光散射检测器作为一种通用型检测器，可以实现对低挥发性的、没有发光基团的化学物质进行检测。本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法可以不经柱前衍生化，直接对样品中的苦马豆素进行精确测定。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种快速、准确的测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法。

实现上述发明目的的技术方案是：一种检测疯草内生真菌中苦马豆素的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；

2）用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为0.2~2︰0.2~2的乙腈：乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；

3) 以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。

本发明所述的菌丝样品预处理技术是：首先采用甲醇提取菌丝样品，提取液挥干后用乙酸溶解，经阳离子树脂交换柱动态循环交换1 h；用去离子水冲洗树脂中的杂质；再用稀氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干；最后甲醇溶解，离心后取上清液，挥干待用。

本发明所述的高效液相色谱仪蒸发光散射检测器ELSD的检测条件：增益值为150，载气流速25 psi，漂移管温度：55℃，雾化器36℃，进样量20μL。

本发明采用色谱柱Waters XBridge?HILIC（规格150mm×4.6mm，3.5μm）。

本发明流动相优选比例为乙腈：乙酸铵缓冲液的体积比1︰1。

本发明流动相中还添加占流动相总体积0.02%的氨水。

本发明所选用的乙酸铵缓冲液浓度为5 mmol/L。

经HPLC-ELSD分析，苦马豆素在色谱上的保留时间为5.3分钟。

按照本发明所说的苦马豆素高效液相色谱分析方法，是将需测定SW含量的疯草内生真菌Undifilum oxytropis-FEL4-F5预处理样品浓度稀释30倍后进样检测。

采用本发明测定疯草内生真菌中苦马豆素的含量，其苦马豆素的检测范围为15.625～250 μg/mL。该方法灵敏度高，专属性强，重现性好，分析方法可靠。

附图说明

图1 是苦马豆素标样的HPLC- ELSD色谱图。

图2 是疯草内生真菌Undifilum oxytropis-FEL4-F5中测得的苦马豆素HPLC- ELSD色谱图。

具体实施方式

下面的具体实施例将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：苦马豆素标准曲线的绘制

1) SW标准溶液的配制：精确称取SW标准品，用流动相溶解，梯度稀释。

2) 实验仪器及色谱条件：Waters 1525型高效液相色谱仪，二元泵；Water 2424蒸发光散射检测器，参数设置增益值为150，载气流速25 psi，漂移管温度55℃，雾化器36℃，进样量20 μL；Waters XBridge?HILIC色谱柱（规格150mm×4.6mm，3.5μm）；色谱分离系统的控制和记录由Breeze 2.0工作站完成。流动相由乙腈和乙酸铵缓冲液组成，体积比为1︰1，乙酸铵的浓度为5 mmol/L，添加总体积0.02%的氨水。流动相的流速为0.5 ml/min。苦马豆素标样结果见图1。

3) 以不同浓度SW的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到SW的标准曲线。采用本方法测定的SW浓度，在15.625～250 μg/mL浓度范围内表现出很好的线性关系。得到线性回归方程为Y＝1.0641X + 2.5679，线性回归系数 R²＝0.9981。

实施例2  内生真菌Undifilum oxytropis-FEL4-F5样品的检测

1) 样品的预处理：取Undifilum oxytropis-FEL4-F5干燥菌丝0.5g，在提取器中加入50 mL甲醇，60 ℃提取24 h。将甲醇提取液浓缩挥干，残渣用10 mL 2 %的乙酸溶液溶解，将该溶液加入到含5 cm高AG 50W阳离子树脂的交换柱中，使其动态循环交换1 h，使苦马豆素与阳离子树脂充分结合；然后用100 mL去离子水冲洗树脂中的杂质；再用100 mL 1 mol/L的氨水溶液洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干，用2 mL甲醇溶解，离心后取上清液并将其挥干待用。进样前用流动相15mL稀释(30倍,W/V)，结果见图2。

2) 实验仪器及色谱条件：同实施例1。

实施例3 不同疯草分离的内生真菌SW含量的检测  

内生真菌样品的处理同实施例2，实验仪器及色谱条件同实施例1。经HPLC- ELSD检测得到内生真菌Undifilum oxytropis中SW含量如下表：

疯草种类产地内生真菌SW含量（μg/g）O.ochrocepala宁夏 海原县FEL4-F54963.14±35.55A.strictus西藏 日喀则FEL5-G33077.64±27.33O.glabra甘肃 民勤FEL1b-B42043.20±22.66O.kansuensis甘肃 天祝FEL3-E92334.41±48.25