改善基于叶酸类化合物的受体型靶向制剂靶向效果的方法

摘要

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种增加基于叶酸类化合物的主动靶向制剂中靶向基团即叶酸类化合物基团在外水相的分布，进而改善制剂主动靶向效果的方法。其特征是：本发明与普通制备方法的关键区别为不使用常用的水、渗透压调节剂溶液或中性缓冲盐溶液作为水相，而采用pH7.5～10.0的弱碱性溶液。本发明方法制备的受体型靶向制剂能改善制剂主动靶向效果。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种增加基于叶酸类化合物的主动靶向制剂中靶向 基团即叶酸类化合物基团在外水相的分布，进而改善制剂主动靶向效果的方法。

背景技术

叶酸(FA)可还原为四氢叶酸，后者是一碳单位转移酶的辅酶，参与一碳单位代谢和嘌呤、 胸腺嘧啶的从头合成。叶酸受体在正常组织中的表达高度保守，只在肺、肾、脉络膜和胎盘 中有低至中等水平表达，且以β亚型为主，但在大部分恶性肿瘤中，如卵巢癌、子宫内膜癌、 前列腺癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌中均高度表达，有时可比正常组织高出100～ 300倍，且正常组织中叶酸受体主要定位于极化上皮尖端表面，血循环中叶酸复合物无法与其 接触。迄今为止的研究结果表明，叶酸通过其羧基与药物载体系统连接形成叶酸复合物后， 其与细胞表面受体亲和力基本保持不变，克服了递药系统在生理状态下难以穿透细胞膜的问 题，确保了通过叶酸介导将递药系统输送至肿瘤细胞内。叶酸作为肿瘤细胞的寻靶分子，具有 无免疫源性、易于修饰和价廉易得等优势，已成为介导递药系统主动靶向肿瘤的研究热点之

Yuan H等制备了叶酸偶联的紫杉醇脂质体，改善了制剂的细胞摄取，但其直接将叶酸与 脂肪酸相连接，中间没有聚乙二醇链，制成的脂质体在体内代谢过快，不具备长循环脂质体 延缓药物代谢、增加体内循环时间的特点，较大程度的影响了药效的发挥。

基于叶酸的靶向制剂经过多年的改进，现一般通过亲水性直链高分子将叶酸分子间接连 接在制剂表面而获得受体型靶向制剂，该方法弥补了普通制剂靶向性不足、易被网状内皮系统 中巨噬细胞膜表面Fc受体识别而被迅速从循环系统清除的缺点，为将药物高比例导入肿瘤细 胞内提供了一种较为实用的抗肿瘤药物靶向载体。Robert J.Lee等把叶酸接在与类脂结合的 PEG分子远端，使其从脂质体上灵活地伸展，进而将FA-PEG-脂质体复合物导入靶细胞。该制剂 可作为传送化疗药物的有效载体，但该方法制备脂质体，叶酸基团在制备过程中会因为自身 的疏水性被包埋于脂质体磷脂双分子层之间，进而降低制剂的主动靶向能力。

Pedro M制备了PLGA-PEG-FA修饰的纳米粒，发现只有20％的叶酸基团位于纳米粒外水 相中，其它80％则包覆于纳米粒的疏水内核中，证明叶酸基团本身的疏水性极大的影响了其 在主动靶向制剂上的应用。制剂制备过程中虽然可以通过增加靶向材料的投料量来增加暴露 在水相的叶酸靶头的绝对数目，但是一方面靶向材料成本较高，另外，因为前期插入制剂主 体的靶向材料会通过其PEG链或其他亲水链的空间位阻阻碍后期靶向材料的插入，所以靶向 材料的修饰量并不能随意增加。因此，如何便捷高效的提高叶酸基团在外水相的分布比例， 目前已成为国内外基于叶酸的主动靶向制剂研究中亟待急待解决的问题。

中国专利(申请号201110114306.6)首先用磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸制备胶束，然 后制备普通脂质体并将两者共同孵育，使胶束的磷脂酰乙醇胺基团即磷脂基团插入脂质体的 外层磷脂层，该融合过程可使叶酸基团分布在脂质体外，进而更好的发挥叶酸的靶向能力。 该专利较好的解决了叶酸受体靶向制剂经典修饰方法中叶酸基团大部分被包覆于制剂疏水内 核、无法暴露进而影响与靶细胞表面受体发生相互作用的问题，但该专利存在制备工艺繁琐 和孵育时磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-叶酸的磷脂酰乙醇胺基团即磷脂基团插入脂质体效率 有限的问题。同时孵育法通用性非常有限，孵育法要求待修饰制剂主体表面为亲水性和半固 态，且靶向材料必须含有与制剂表面材料结构完全相同或者具有高度亲和力的基团才能方便 其插入、融合，以该专利为例，如果用于连接叶酸基团的聚乙二醇链或其它亲水链另一端连 接的不是磷脂而是其他两亲性材料或者疏水性材料，则存在该材料与脂质体磷脂层的亲和性 不强甚至无法插入的问题，如果制剂表面为疏水性，制剂系统仅仅通过制剂个体间电荷斥力 或其它作用力保持物理稳定，或者制剂主体表面为固态，不具备恰当的流动性，则孵育法根 本不能用于主动靶向制剂的修饰，因为后插入这一关键过程根本无法实现。

发明内容

本发明公开了一种增加基于叶酸的主动靶向制剂中靶向基团在外水相的分布，进而改善制 剂主动靶向效果的方法。

本发明的主要特点为在基于叶酸类化合物的主动靶向制剂制备过程中，含叶酸基团的靶向 材料和形成制剂主体的脂质或高分子材料同时投料，共同参与制剂主体的自发形成，以弱碱 性碱溶液作为外水相，从本质上大幅增加叶酸类化合物基团的亲水性，进而使其在制剂主体 自发形成过程中主动分布于外水相，避免其因自身的疏水性被包埋于制剂主体的疏水部位， 最终达到增强叶酸介导的主动靶向效果的作用。

基于叶酸的主动靶向制剂的经典制备方法为：将脂质材料和含叶酸基团的靶向材料溶于 有机溶剂，旋转蒸发成膜，加入水相水合，探头超声，过滤除菌。

本发明与普通制备方法的关键区别为不使用常用的水、渗透压调节剂溶液或中性缓冲盐 溶液作为水相，而采用pH7.5～10.0的弱碱性溶液。

本发明的受体型靶向制剂的制备方法，包括：将脂质材料或高分子材料和含叶酸类化合物 基团的靶向材料溶于有机溶剂，通过薄膜洗脱法、乙醇注入法、逆向蒸发法、透析法、乳化- 溶剂挥发法或微乳法分散于水相，整粒后过滤除菌即得，制备载药制剂之前，如药物为脂溶 性，则将药物和脂质材料或高分子材料一同溶于有机溶剂，如药物为水溶性，则将药物溶于 水相，在上述制备中，关键是：水相含路易斯碱，水相pH值保持在7.5～10.0范围内。更优 选pH值为7.8～8.2。本发明方法制备的受体型靶向制剂能改善制剂主动靶向效果。

推测本发明的原理如下：对靶向材料中叶酸基团进行极性化改造是从根本上解决叶酸基 团被包埋问题的关键。在保持叶酸基团空间构象和化学结构稳定的前提下，对其未取代的α 游离羧基进行改造是最简便可行的方法。pH7.5～10.0的弱碱性水合介质能使该α游离羧基离 子化，使叶酸基团由非极性转为极性，大幅增强叶酸基团自身亲水性。以上理论由本发明首 次提出。将含叶酸基团的靶向材料和脂质或高分子材料同时投料，共同参与制剂主体的自发 形成，靶向材料的疏水基团会和其他脂质材料或高分子材料的疏水链段在水相通过疏水作用 力相互吸引、自发聚集，并将PEG等亲水链和亲水性的改性叶酸基团排挤到外水相，从根本 上杜绝叶酸基团在制剂疏水主体的包埋。以上设想经K562细胞摄取实验证明切实可行。关 于外水相pH值范围的选择，制剂体系内叶酸α羧基离子型数目和游离型数目的比值会随外 水相pH值的增加而增加，但该比值增加的速度会随外水相pH值的增加而迅速减小，即通过 增加外水相pH值促进α游离羧基离子化的效率会随着外水相pH值的增加迅速变差，所以为 了使叶酸的α游离羧基更完全地离子化，外水相应具备较高、偏碱性的pH值，但不必过高， 而且pH值过高会导致部分脂质材料如磷脂的水解，结合制剂静脉滴注时对血管刺激性的要 求，我们试验表明在pH7.5～10.0的范围能得到此效果，更优选pH7.8～8.2。对于pH值9.0～10.0 的外水相，可采用碱性条件下化学性质更稳定的高分子材料制备制剂。

本发明相对于经典的主动靶向载体组装方法，能简便的实现叶酸基团的外水相分布，因 为制备过程中叶酸基团为亲水性，从根本上防止了叶酸在载体疏水内核中的分布，而且弱碱 性的水合介质不会影响叶酸基团本身的化学稳定性和叶酸与其靶细胞表面受体的结合能力， 也不会影响脂质材料的物化性质和制剂本身的物理稳定性及包封率，制剂最终pH值也符合 注射液要求，安全性良好。

本发明相对于我国已有的孵育即后插入法的专利技术(CN201110114306.6)，具备操作简 便，靶向材料插入效率高的特点，更重要的是，该方法从本质上改变了叶酸基团的疏水性质， 具备良好的通用性，无论靶向材料中需要插入制剂主体的基团为两亲性的磷脂类材料还是完 全疏水的烷基短链或高分子材料，因为靶向材料参与了制剂系统早期的自发形成过程而不是 在制剂主体形成后再插入，该方法都能将绝大多数靶向材料牢固地锚定在制剂主体，不存在 上述孵育即后插入技术中要求靶向材料锚定基团必须为磷脂或必须与制剂表面材料具备高度 结构相似性的限制。同时，目前主动靶向制剂为增强制剂本身的物理稳定性，大多采用疏水 内核外包亲水表层的组装方法，即使临床使用过程中采用葡萄糖注射液等稀释，破坏了促使 叶酸转为亲水性的外水相弱碱性环境，因为制剂本身表面包覆有亲水层，亲水性减弱的叶酸 基团仍可稳定分布于水相中而不会因为其疏水性重新插入制剂疏水性内核。

所述的碱优选路易斯碱，即能给出电子对的物质中的一种或多种，更优选碳酸盐、酸式 碳酸盐、氢氧化物、磷酸盐、亚硫酸盐、氨、胺中的一种或多种，进一步优选碳酸钠、碳酸 氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氢氧化钠、氢氧化钾、亚硫酸钠中的一种或多种。

所述的叶酸类化合物优选叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、10-甲 酰四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸、甲氨蝶呤、喋 酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸或8-去氮叶 酸。

所述靶向材料为叶酸与其他医学上允许使用材料的共价结合物即叶酸修饰的叶酸-分子 复合物，优选双硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FA)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇-叶酸(PE-PEG-FA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇-叶酸(PLGA-PEG-FA)、胆固醇- 聚乙二醇-叶酸(Chol-PEG-FA)、聚十六烷基氰基丙烯酸酯-聚乙二醇-叶酸(PHDCA-PEG-FA) 或单硬脂酸聚氧乙烯酯-叶酸(S100-FA)。

所述主动靶向制剂为脂质体、胶束、固体脂质纳米粒、纳米结构脂质载体或乳脂体等常 见剂型。

所述主动靶向制剂粒径范围优选5nm-10μm。

所述的脂质材料优选三硬脂酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、单硬脂酸甘 油酯、山嵛酸甘油酯、辛酸/癸酸三甘油酯、丙二醇二辛酸酯、丙二醇二癸酸酯、三肉豆蔻酸 甘油酯、胆固醇、硬脂酸、微晶石蜡、鲸酯蜡、大豆磷脂、卵磷脂、蛋黄磷脂、氢化磷脂中 的一种或多种。

所用高分子材料优选淀粉、阿拉伯胶、明胶、瓜尔豆胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、西黄 蓍胶、海藻酸钠、白蛋白、聚丙烯酸、丙烯酸树脂、乙烯/醋酸乙烯共聚物、聚乳酸、聚羟基 乙酸、乳酸/羟基乙酸共聚物中的一种或多种。

本发明制剂水相中可以另外添加渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、甘露醇。

本发明制备方法也适于将纳米粒制成冻干制剂，纳米粒制剂加入冻干保护剂如葡萄糖、 甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、右旋糖苷、甘油或甘氨酸，过滤除菌后冷冻干燥， 可制得纳米粒冻干制剂。

本发明制剂制备过程中还可以加入抗氧剂，优选抗坏血酸、生育酚衍生物如维生素E。

本发明制剂水相中还可以加入表面活性剂以减小纳米粒粒径，优选泊洛沙姆188、聚山 梨酯80、聚氧乙烯蓖麻油、去氧胆酸钠。

制备纳米粒时，所用药物和原料一般按如下重量份数选取：药物1-3份，脂质0-150份， 高分子材料0-300份，靶向材料1-300份，抗氧剂0-2份，冻干保护剂0-1000份，渗透压调 节剂0-600份，路易斯碱1-300份，表面活性剂0-500份。

下面是用常规方法制备的普通靶向制剂和本发明方法制备的改良的靶向制剂的效果比 较：

普通靶向制剂制备：称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、S100-FA(单硬脂酸聚氧乙 烯酯与叶酸以共价键结合)0.3g、香豆素-6储备液适量(使香豆素-6最终制剂浓度为10 μg/mL)，加入甲醇/二氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL溶解，旋转蒸发成膜，300mL去离 子水37℃水合30min，探头超声，过0.22μm微孔滤膜，即得普通靶向制剂，粒径54.5nm。

本发明改良的靶向制剂制备：

改良靶向制剂一：称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、S100-FA0.3g、香豆素-6储备 液适量(使香豆素-6最终制剂浓度为10μg/mL)，加入甲醇/二氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL 溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为7.8的碳酸氢钠水溶液，37℃水合30min，探头超 声，过0.22μm微孔滤膜，即得，粒径58.3nm。

改良靶向制剂二：称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、S100-FA0.3g、香豆素-6储备 液适量(使香豆素-6最终制剂浓度为10μg/mL)，加入甲醇/二氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL 溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为8.4的碳酸钠水溶液，37℃水合30min，探头超声， 过0.22μm微孔滤膜，即得，粒径54.8nm。

改良靶向制剂三：称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、S100-FA0.3g、香豆素-6储备 液适量(使香豆素-6最终制剂浓度为10μg/mL)，加入甲醇/二氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL 溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为9.0的氢氧化钠水溶液，37℃水合30min，探头超 声，过0.22μm微孔滤膜，即得，粒径55.1nm。

取对数生长期的人源K562细胞以1×10⁵个/孔接种于24孔板，完全培养基37℃培养24h， 移去培养液，用不含叶酸培养基清洗三次，再用不含叶酸培养基37℃培养24h，移去培养基， 每孔加入0.5mL用不含叶酸培养基稀释100倍的上述载香豆素-6的普通主动靶向制剂和改良 主动靶向制剂(n＝6)，分别于37℃孵育4h。弃去含制剂的培养液，用冰冷的PBS洗涤三遍， 采用荧光-HPLC法及BCA试剂盒法测定细胞中的香豆素-6和蛋白的浓度。实验结果表明本 发明改良靶向制剂一、二、三的细胞摄取量分别为普通靶向制剂的1.82、1.89、1.73倍。实 验结果见图1。

附图说明

图1是香豆素-6普通及本发明改良靶向制剂K562细胞摄取(n＝6)

具体实施方式

实施例1

称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、DSPE-PEG-FA 0.2g、阿霉素300mg，加入甲醇/二 氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为8.0的碳酸氢 钠水溶液，37℃水合30min，探头超声，过0.22μm微孔滤膜，即得改良主动靶向制剂，粒径 80.6nm。

实施例2

称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、DSPE-PEG-FA 0.2g、米托蒽醌200mg，加入甲醇/ 二氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为8.2的碳酸 钠水溶液，37℃水合30min，探头超声，过0.22μm微孔滤膜，即得改良主动靶向制剂，粒径 85.3nm。

实施例3

称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、Chol-PEG-FA 0.2g、喜树碱100mg，加入甲醇/二 氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为8.6的碳酸钠 水溶液，37℃水合30min，探头超声，过0.22μm微孔滤膜，即得改良主动靶向制剂，粒径75.4nm。

实施例4

称取PLGA-PEG 0.1g、PLGA-PEG-FA 0.01g，移取香豆素-6母液适量(使香豆素-6最终 制剂浓度为1μg/mL)，加入乙腈10mL溶解，逐滴加入100mLpH值为8.6的碳酸钠水溶液中 并剧烈搅拌，置8000-12000截留分子量透析袋中透析24h，即得改良主动靶向制剂，粒径 300.3nm。

实施例5

称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、PE-PEG-FA 0.2g、醋酸地塞米松100mg，加入甲醇 /二氯甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为8.0的磷酸 氢二钠水溶液，37℃水合30min，探头超声，过0.22μm微孔滤膜，即得改良主动靶向制剂， 粒径77.4nm。

实施例6

称取大豆磷脂8g、三月桂酸甘油酯1g、PE-PEG-FA 0.2g、布洛芬100mg，加入甲醇/二氯 甲烷(1∶1，v/v)混合溶剂200mL溶解，旋转蒸发成膜，加入300mLpH值为8.0的碳酸氢钠 水溶液，37℃水合30min，探头超声，过0.22μm微孔滤膜，即得改良主动靶向制剂，粒径72.3nm。