用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II

摘要

提供了使用高分辨率/高准确度质谱法测定样品中IGF-I和/或IGF-II蛋白的量的方法。所述方法一般包括使样品中的IGF-I和/或IGF-II蛋白富集，电离来自所述样品的IGF-I和/或IGF-II蛋白以产生IGF-I和/或IGF-II蛋白离子，并用高分辨率/高准确度质谱法测定IGF-I和/或IGF-II蛋白离子的量。

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2009年11月5日提交的美国临时申请系列号 61/258,560和于2010年10月29日提交的美国临时申请系列号 61/408,535的优先权，其通过参考以其包括所有图和表的整体并入本 文。

发明领域

本发明涉及使用质谱法定量分析大的蛋白质。

背景技术

IGF-I是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是由肝产生的肽 并在具有三个分子内二硫键的单链中包含70个氨基酸。IGF-I的分子 量为约7,649Da，并且在血清中是高度蛋白结合的。通过生长激素刺 激产生并可由于营养不足、生长激素不敏感性、缺乏生长激素受体或 下游信号传导途径故障而阻止产生。IGF-I在儿童生长中起重要的作用 并在成人中持续具有合成代谢作用。

胰岛素样生长因子II(IGF-II)也是具有与胰岛素类似的分子结构的 激素。它是包含67个氨基酸的单链肽。IGF-II分子量为约7,505Da， 并且在血清中是高度蛋白结合的。IGF-II在与生长激素相关病症的临床 评估中用作胰岛素样生长因子I(IGF-I)的辅助物(adjunct)。IGF-II通过 与IGF-I和不同细胞表面受体相互作用并使结合蛋白循环以调节组织 生长，主要在胎儿生长和发育中起作用。由于生长激素缺乏或营养不 良，IGF-II在儿童和成人中的水平降低。在肢端巨大症或IGF-1的外源 给药可观察到增加的IGF-II血清水平。因此，测量循环的IGF-II水平(即 血浆/血清中)是控制数种生长激素相关病症的重要工具。另外，在各种 流行病学研究领域和临床试验中测量循环IGF-II也是有价值的工具。

已经证实用“颠倒(bottmom up)”方法(即，酶消化和量化一种或多 种所得肽)量化分析IGF-I和IGF-II尤其是有挑战性的。例如，de Kock 等报道典型的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶消化方法产生低的 消化产量和非特异性酶卵裂。de Kock等，Rapid Commun.Mass  Spectrom.,2001,15:1191-97。de Kock等建议，不令人满意的消化结果 可能是因为由IGF-I的三个二硫键造成的蛋白水解酶的空间限制性。Id。

已经努力开发分析IGF-I和IGF-II的方法，包括通过各种质谱技 术。例如，已经报道了使用具有单离子监测(SIM)的LC-离子阱MS分 析IGF-I。见，例如Id.；Bobin等，Analyst,2001,126:1996-2001；和 Popot等,Chromatographia,2001,54:737-741(Popot I)。这些参考文献公 开了SIM模式中电荷状态范围为4+至9+的完整IGF-I的LC-ESI-离子 阱MS。最近，已经公开了使用多反应监测(MRM)的LC-MS/MS技术。 Popot II报道使用具有SIM的LC-离子阱MS定量分析电荷状态范围为 4+至9+的IGF-I，随后用LC-离子阱MS/MS使用MRM定性确认分析 物。Popot等Anal Bioanal Chem,2008,390:1843-52(Popot II)。MRM 实验使用所选择的多电荷IGF-I离子(7+和8+)作为裂解实验中的前体 离子。等报道使用轨道阱质谱仪器定性测定IGF-I前体和产 物离子的质荷比，并使用确定的离子使用LC-三重四极杆MS/MS用于 随后的IGF-I定量。等Rapid Commun.Mass Spectrom.,2008, 22:477-485。

类似地，已经报道了使用酶消化随后质谱分析消化产物来分析 IGF-II。见，例如Smith等,J.Biol.Chem.,1989,16:9314-9321；和Bayne 等Peptide Research,1990,6:271-273。已经报道了用于分析完整IGF-II 质谱检测的其他研究。见，例如，Hampton等J.Biol.Chem.,1989,32: 19155-19160；Hayne等J.Chromatog.1991,52:391-402；Wadensten等 Biotech.and App.Biochem.,1991,13:412-421；Jespersen等J.Mass Spectrom.,1996,31:893-900；和Nelson等J.Proteome,2004,3: 851-855。这些参考文献报道用等离子体脱附和MALDI-TOF质谱技术 检测完整的IGF-II。Hampton等检测范围从1+至3+的电荷状态。除了 Hampton等之外都检测到1+电荷状态的IGF-II。

发明内容

本文描述的方法是用高分辨率/高准确度质谱法质谱测定样品中胰 岛素样生长因子I(IGF-I)蛋白和/或胰岛素样生长因子II(IGF-II)蛋白的 量。该方法具有简化的预分析步骤，其仅仅任选地包括蛋白质裂解、 消化和/或检测蛋白质片段。优选地，样品收集后不进行一种或多种完 整蛋白的裂解或消化。

在本发明的第一方面，通过质谱法测定样品中IGF-I蛋白或其片段 的量，所述质谱法包括使来自样品的IGF-I蛋白或其片段在适合产生质 谱法可检测的一种或多种IGF-I离子的条件下电离；和通过高分辨率/ 高准确度质谱法测定一种或多种IGF-I离子的量。所测定的一种或多种 IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白或其片段的量相关。在一些实施方 式中，IGF-I蛋白或其片段源于样品。在一些实施方式中，IGF-I蛋白 或其片段是完整的长R3IGF-I或其片段。在一些实施方式中，IGF-I 蛋白是完整的长R3IGF-I。

第二方面，通过质谱法测定样品中IGF-II蛋白或其片段的量，所 述质谱法包括将样品中的IGF-II蛋白或其片段在适合产生质谱法可检 测的一种或多种IGF-II离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度 质谱法测定一种或多种IGF-II离子的量。所测定的一种或多种IGF-II 离子的量与样品中IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选地，IGF-II蛋 白源于样品并且是完整的。

第三方面，IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段的量通过质 谱法同时测定，所述质谱法包括将来自样品的IGF-I蛋白或其片段和 IGF-II蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的一种或多种IGF-I离子 和一种或多种IGF-II离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度质 谱法测定一种或多种IGF-I离子和一种或多种IGF-II离子的量。所测 定的IGF-I和IGF-II离子的量与样品中IGF-I和IGF-II蛋白或其片段的 量相关。优选地，IGF-I和IGF-II蛋白源于样品并且是完整的。

在一些实施方式中，样品可在电离之前通过固相提取(SPE)纯化。 在一些实施方式中，样品可在电离之前通过高效液相色谱法(HPLC)纯 化。在相关实施方式中，样品可在电离之前用SPE和HPLC两者纯化， 并且纯化可任选地用联机处理进行。

在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法用大于或等于约 10,000的分辨本领(FWHM)进行，如大于或等于约15,000，如大于或等 于约20,000，如大于或等于约25,000。在一些实施方式中，高分辨率/ 高准确度质谱法以小于或等于约50ppm的准确度进行，如小于或等于 约20ppm，如小于或等于约10ppm，如小于或等于约5ppm；如小于 或等于约3ppm。在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法以大 于或等于约10,000的分辨本领(FWHM)和小于或等于约50ppm的准确 度进行。在一些实施方式中，分辨本领大于约15,000并且准确度小于 或等于约20ppm。在一些实施方式中，分辨本领大于或等于约20,000 并且准确度小于或等于约10ppm；优选地分辨本领大于或等于约 25,000并且准确度小于或等于约5ppm，如小于或等于约3ppm。

在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法可用轨道阱质谱仪、 飞行时间(TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(有时候称 为傅里叶变换质谱仪)进行。在一些实施方式中，样品可包括生物学样 品；优选血浆或血清。

在一些实施方式中，通过质谱法可检测的一种或多种IGF-I离子是 选自m/z在850.8±2、957.1±2、1093.7±2和1275.8±2范围内的离 子的一种或多种离子。这些范围内的离子分别对应于电荷为9+、8+、 7+和6+的IGF-I离子，并主要落在所述的m/z值±1的范围内。优选地 一种或多种IGF-I离子包括选自m/z在957.1±2和1093.7±2范围内 的IGF-I离子的一种或多种离子。1093.7±2范围内IGF-I离子优选地 包括选自具有下列m/z的IGF-I离子的一种或多种IGF-I离子：约 1091.94±0.1、1092.80±0.1、1092.94±0.1、1093.09±0.1、1093.23±0.1、 1093.37±0.1、1093.52±0.1、1093.66±0.1、1093.80±0.1、1093.95±0.1、 1094.09±0.1、1094.23±0.1、1094.38±0.1、1094.52±0.1、1094.66±0.1 和1095.37±0.1。在一些实施方式中，使通过质谱法检测的一种或多种 IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白的量相关联包括与内标比较；如人 IGF-I蛋白或非人IGF-I蛋白(例如，完整重组小鼠重组小鼠IGF-I)。内 标可任选地被同位素标记。

在一些实施方式中，质谱法可检测的一种或多种IGF-II离子是选 自具有下列m/z范围的IGF-II离子的一种或多种IGF-II离子：约934.69 ±2、1068.07±2、1245.92±2和1494.89±2。这些范围内的离子分别 对应于具有电荷8+、7+、6+和5+的IGF-II离子，并且主要落在所述的 m/z值±1的范围内。优选地一种或多种IGF-II离子包括选自具有下列 m/z的IGF-II离子的IGF-II离子：约1067.36±0.1、1067.51±0.1、1067.65 ±0.1、1067.80±0.1、1067.94±0.1、1068.08±0.1、1068.23±0.1、1068.37 ±0.1、1068.51±0.1、1068.65±0.1、1068.80±0.1、1068.94±0.1和 1069.08±0.1；优选地，一种或多种IGF-II离子选自具有下列m/z的离 子：约1067.94±0.1和1068.08±0.1。在一些实施方式中，使通过质谱 法检测的一种或多种IGF-II离子的量与样品中IGF-II蛋白的量相关联 包括与内标比较；如人IGF-II蛋白或非人IGF-II蛋白(例如，完整重组 小鼠IGF-II)。

在一些实施方式中，样品中天然完整IGF-I和/或IGF-II的量通过 质谱法测定，所述质谱法包括使完整的源于样品并通过固相提取(SPE) 和高效液相色谱法(HPLC)纯化的IGF-I和/或IGF-II，在适合产生质谱 法可检测的一种或多种IGF-I和/或IGF-II离子的条件下电离。如果天 然完整IGF-I的量被测定，一种或多种IGF-I离子包括选自具有下列范 围内m/z的IGF-I离子的一种或多种IGF-I离子：约850.8±2、957.1± 2、1093.7±2和1275.8±2。如果天然完整IGF-II的量被测定，一种或 多种IGF-II离子包括选自具有下列范围内m/z的IGF-II离子的一种或 多种IGF-II离子：约934.69±2、1068.07±2、1245.92±2和1494.89± 2。再一次，对于IGF-I和IGF-II，上述范围内的离子主要落在所述的 m/z值±1的范围内。一种或多种IGF-I和/或IGF-II离子接着通过高分 辨率/高准确度质谱法测定；其中一种或多种IGF-I和/或IGF-II离子的 量用于测定样品中天然完整IGF-I和/或IGF-II的量。在这些实施方式 中，高分辨率/高准确度质谱法用轨道阱或TOF质谱仪进行，并且SPE 和HPLC可以以联机方式进行。

上面列出的实施方式的特征可以没有限制地在本发明的方法中结 合使用。

在某些优选的实施方式中，质谱法以阳离子模式进行。可选地， 质谱法以阴离子模式进行。本文描述的方法中使用的优选的电离技术 是电喷雾电离(ESI)。电喷雾电离可以例如用热的电离源进行。

在优选的实施方式中，一种或多种分别可检测的内标提供在样品 中，其在样品中的量也被测定。在这些实施方式中，两种关注的分析 物和一种或多种内标的所有或部分被电离以产生多个质谱仪可检测的 离子，并且通过质谱法检测从每种物质产生的一种或多种离子。内标 可选自完整的非人IGF-I(例如，同位素标记的或未标记的完整重组小 鼠IGF-I)、同位素标记的完整人IGF-I蛋白、完整的非人IGF-II蛋白(例 如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠IGF-II)和同位素标记的完 整人IGF-II蛋白。

在其他实施方式中，样品中完整的IGF-I和/或IGF-II蛋白的量可 通过与一种或多种外部参考标准进行比较而被测定。示例性外部参考 标准包括用同位素标记的或未标记的、完整人或非人IGF-I和/或IGF-II 蛋白(例如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠IGF-I和或IGF-II) 掺入的空白血浆或血清。

在一些实施方式中，包括来自两种或多种分子同位素形式的分析 物的质谱峰的同位素“签字”可用于确认被研究分析物的同一性。在 其他实施方式中，来自一种或多种同位素形式的质谱峰可用于量化关 注的分析物。在一些相关实施方式中，来自一种同位素形式的单个质 谱峰可用于量化感兴趣的分析物。在其他相关实施方式中，多个同位 素峰可用于量化分析物。多个峰可经历任何合适的数学处理。数种数 学处理是本领域已知的，包括但不限于对多重峰下面积的求和，或平 均多重峰的响应。

如本文所使用，除非另外指出，单数形式“一个(a)”、“一个(an)” 和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“蛋白质”包括多个 蛋白质分子。

如本文所使用，术语“IGF-I蛋白”指全长IGF-I多肽或其片段， 以及全长IGF-I变体的多肽或其片段。IGF-I变体包括，例如长R3IGF-I， 其是IGF-I的83个氨基酸的类似物，其包括完全的人IGF-I序列—— 在3位(因此R3)具有Arg(R)对Glu(E)的取代，和在N末端的13个氨 基酸延伸肽(extension peptide)。为了提高IGF-I肽的生物活性，已经生 产了IGF-I的该类似物。该类似物的质量为约9111.4道尔顿，因此多 电荷长R3IGF-I离子可观察到具有的m/z比为约1014.1±1、1140.7± 1、1303.5±1和1520.6±1。本领域技术人员容易理解其他IGF-I变体 多肽，包括例如已经被化学改性的全长IGF-I多肽或其片段。示例性化 学改性可包括减少一个或多个二硫键或烷基化一个或多个胱氨酸。这 些示例性化学改性导致IGF-I变体多肽的质量相对于对应的未改性 IGF-I多肽的质量增加。减少一个或多个二硫键产生分子质量相对较少 的改变，所得质荷比落在本文描述的质荷比范围内。导致质量偏离未 改性的IGF-I多肽的其他化学改性也包括在IGF-I蛋白的意义之内。本 领域技术人员理解通过化学改性添加原子至IGF-I蛋白导致观察到质 谱法期间质荷比的增加。因此，化学改性产生的IGF-I蛋白变体包括在 IGF-I蛋白的意义内并根据本发明的方法可检测。

如本文所使用，术语“IGF-II蛋白”指全长IGF-II多肽或其片段， 以及全长IGF-II变体多肽或其片段。本领域技术人员容易理解IGF-II 变体多肽，包括例如已经被化学改性的全长IGF-II多肽或其片段。示 例性化学改性可包括减少一个或多个二硫键或烷基化一个或多个胱氨 酸。这些示例性化学改性导致IGF-II变体多肽的质量相对于对应的未 改性IGF-II多肽的质量增加。减少一个或多个二硫键产生分子质量相 对较少的改变，所得m/z落在本文描述的m/z范围内。导致质量偏离 未改性的IGF-II多肽的其他化学改性也包括在IGF-II蛋白的意义之内。 本领域技术人员理解通过化学改性添加原子至IGF-II蛋白导致观察到 质谱法期间质荷比的增加。因此，化学改性产生的IGF-II蛋白变体包 括在IGF-II蛋白的意义内并根据本发明的方法可检测。

如这里所使用，术语“完整”当描述多肽时指全长(即，未裂解的) 多肽。例如，完整IGF-I是包含70个氨基酸残基的多肽，并且完整长 R3IGF-I是IGF-I的83个氨基酸的类似物，其包括全部人IGF-I序列 ——在3位具有Arg(R)对Glu(E)的取代(因此R3)，和在N末端的13 个氨基酸延伸肽。非完整形式的IGF-I和/或IGF-II蛋白(即，片段)也可 通过本文描述的方法检测。例如，具有约1,000道尔顿或更大分子量的 IGF-I和/或IGF-II蛋白片段可通过本文描述的方法检测，如约1500道 尔顿或更大，如约2000道尔顿或更大，如约2500道尔顿或更大，如 约3000道尔顿或更大，如约4000道尔顿或更大，如约5000道尔顿或 更大，如约6000道尔顿或更大、如约7000道尔顿或更大。

术语“纯化”(“purification”或“purifying”)指相对于样品中可能干扰 关注分析物检测的其他组分富集一种或多种关注分析物的量的方法。 虽然不是必须的，“纯化”可完全清除所有干扰成分，或甚至除了关 注分析物之外的所有材料。通过多种方法纯化样品可使一种或多种干 扰物质——例如可能干扰或可能不干扰通过质谱法(质谱分析法)检测 选择的母离子或子离子的一种或多种物质——相对减少。当使用该术 语时，相对减少并不要求在待被纯化的物质中与关注分析物一起存在 的任何物质通过纯化被完全除去。

术语“样品”指可包含关注分析物的任何样品。如本文所使用， 术语“体液”意思是指可从个体的身体分离的任何流体。例如，“体液” 可包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液等。在优 选的实施方式中，样品包括体液样品；优选血浆或血清。

术语“固相提取”或“SPE”指一种方法，其中化学混合物由于溶 解或悬浮在溶液(即，流动相)中的组分对溶液所经过或围绕的固体(即， 固相)的亲和力被分成组分。在一些情况下，随着流动相经过或围绕固 相，不需要的流动相组分可被固相保留，导致流动相中分析物的纯化。 在其他情况下，分析物可被固相保留，允许不期望的流动相组分经过 或围绕固相。在这些情况下，第二流动相接着用于洗脱保留的分析物 离开固相用于进一步处理或分析。SPE可经单一或混合模式机制操作。 如本文所使用，例如，SPE可用提取柱或管如湍流液相色谱(turbulent  flow liquid chromatography,TFLC)柱进行。混合的模式机制使用同一柱 中的离子交换和疏水保留；例如，混合-模式SPE柱的固相可展示强的 阴离子交换和疏水保留；或可展示强的阳离子交换和疏水保留。

术语“色谱法”指如此方法，其中当由液体或气体携带的化学混 合物流过固定的固相时，由于化学个体的差别分布，它们被分离成组 分。

术语“液相色谱法”或“LC”意思是指当流体均匀渗滤通过细分 物质的柱或通过毛细管路径时，流体溶液的一种或多种组分选择性延 迟的方法。延迟是当流体相对于固定相(一种或多种)移动时，由混合物 组分在一种或多种固定相和主体流体(即，流动相)之间的分布产生的。 采用“液相色谱”的分离技术的例子包括反相液相色谱(RPLC)、高效 液相色谱(HPLC)和湍流液相色谱(TFLC)(有时称作高湍流液相色谱 (HTLC)或高通量液相色谱法)。在一些实施方式中，SPE柱可结合LC 柱使用。例如，样品可用TFLC提取柱纯化，随后用HPLC分析柱另 外纯化。

术语“高效液相色谱法”或“HPLC”(有时称作“高压液相色谱 法”)指通过在压力下迫使流动相通过固定相——通常为致密填充柱— —增加分离程度的液相色谱。

术语“湍流液相色谱法”或“TFLC”(有时称作高湍流液相色谱法 或高通量液相色谱法)指这样的色谱法形式，其利用物质的湍流，通过 作为进行分离的基础的柱填充分析物质。在通过质谱法以前，TFLC已 应用于含有两种不知名药物的样品的制备。参见，例如Zimmer等人， J Chromatogr A 854:23-35(1999)；也参见美国专利号5,968,367、 5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步解释TFLC。本领域普通 技术人员理解“湍流”。当流体缓慢且平稳地流动时，流体被称为“层流”。 例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层流的。在层流中，流体 的颗粒运动是有序的，其中颗粒大体上以直线移动。在较快的速度下， 水的惯性克服了流体摩擦力，并且湍流产生。不与不规则边界接触的 流体比被摩擦减慢或被不均匀表面转向的流体“移动更快(outruns)”。当 流体湍流地流动时，其以旋涡和回旋(或涡流)流动，其比流动为层流时 具有更大的“阻力(drag)”。许多参考文献可用于帮助确定何时流体流 动为层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis:Measurement and  Prediction,P.S.Bernard &J.M.Wallace,John Wiley &Sons,Inc.,(2000)； An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu &Julian Scott, Cambridge University Press(2001))。

术语“气相色谱”或“GC”指如此色谱法，其中样品混合物被汽 化并且注入移动通过含有由液体或颗粒固体组成的固定相的柱的载气 流(如氮气或氦气)中，并且样品混合物根据化合物对固定相的亲和力被 分离成其组分化合物。

术语“联机(on-line)”或“在线(inline)”，例如如在“联机自动方 式”或“联机提取”中使用的，指不需要操作员介入而进行的过程。 相反地，如本文使用的术语“脱机的(off-line)”指要求操作员手动介入 的过程。因此，如果样品经历沉淀并且然后将上清液手动加载到自动 采样器中，那么沉淀和加载步骤是与接下来的步骤脱机的。在该方法 的不同实施方式中，一个或多个步骤可以以联机自动方式进行。

术语“质谱法”或“MS”指通过其质量鉴定化合物的分析技术。MS 指基于其质荷比或“m/z”的过滤、检测和测量离子的方法。MS技术通 常包括(1)电离化合物以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子 量并计算质荷比。化合物可通过任何合适的方法电离并检测。“质谱仪” 一般包括电离器和离子检测器。一般而言，一种或多种关注分子被电 离，并且随后将离子引入质谱仪，在那里由于磁场和电场的组合，离 子遵从空间中沿依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。参见例如美国专 利号6,204,500，其名称为“Mass Spectrometry From Surfaces”； 6,107,623，其名称为“Methods and Apparatus for Tandem Mass  Spectrometry”；6,268,144，其名称为“DNA Diagnostics Based On Mass  Spectrometry”；6,124,137，其名称为“Surface-Enhanced Photolabile  Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes”； Wright等人，Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999,2:264-76；和 Merchant和Weinberger,Electrophoresis 2000,21:1164-67。

如本文所使用，“高分辨率/高准确度质谱法”指用能够测量带电 种质荷比的质量分析器进行的质谱法，具有足够的精确度和准确度以 确认独特化学离子。当来自该离子的单个同位素峰容易分辨时，可能 确认离子的独特化学离子。确认独特化学离子所需要的具体分辨本领 和质量准确度随着离子的质量和电荷状态而变化。

如本文所使用，术语“分辨本领”或“分辨本领(FWHM)”(本领 域也称为“m/Δm_50%”)指观察到的质荷比除以在50%最大高度时质量 峰的宽度(半宽度，极大值半处的全宽度，“FWHM”)。分辨本领的差 异效果图解在图1A-C中，其显示m/z为约1093的离子的理论质谱。 图1A显示来自分辨本领为约3000(常规四极质量分析器典型的操作条 件)的质量分析器的理论质谱。如图1A中所显示，没有单个同位素峰 是可分辨的。相较而言，图1B显示来自分辨本领为约10,000的质量 分析器的理论质谱，其具有清楚可分辨的单个同位素峰。图1C显示来 自分辨本领为约12,000的质量分析器的理论质谱。在该最高分辨本领 下，单个同位素峰包含离基线小于1%的分布。

如本文所使用，就质谱法而言，“独特化学离子”指具有单一原 子结构的单个离子。该单个离子可以是单电荷的或多电荷的。

如本文所使用，就质谱法而言，术语“准确度”(或“质量准确度”) 指仪器响应与所研究离子真实m/z的可能偏差。准确度典型地表示为 百万分之一(ppm)。质量准确度的差异效果图解在图2A-D中，其显示 m/z为1093.52094的理论峰所检测的m/z和真实m/z之间的可能差异 的边界。图2A显示在准确度120ppm时所检测的m/z可能范围。相对 照，图2B显示在准确度50ppm时所检测的m/z的可能范围。图2C 和2D显示在准确度20ppm和10ppm时所检测的m/z的甚至更窄的可 能范围。

本发明的高分辨率/高准确度质谱法方法可在能够以大于10,000、 15,000、20,000、25,000、50,000、100,000或甚至更大的FWHM进行 质量分析的仪器上进行。同样，本发明的方法可在能够以小于50ppm、 20ppm、15ppm、10ppm、5ppm、3ppm或甚至更小的准确度进行质 量分析的仪器上进行。具有这些性能特点的仪器可结合某些轨道阱质 量分析器、飞行时间(“TOF”)质量分析器、或傅里叶变换离子回旋共 振质量分析器。在优选的实施方式中，用包括轨道阱质量分析器或TOF 质量分析器的仪器执行方法。

术语“轨道阱”描述由外部桶样电极和同轴内部电极组成的离子 阱。离子切线注入电极之间的电场，并且当离子围绕同轴内部电极轨 道飞行时，因为离子和电极之间的静电作用被离心力平衡而使离子被 捕获。当离子围绕同轴内部电极轨道飞行时，捕获的离子的轨道路径 沿着中心电极的轴以相对于离子质荷比的谐振频率震动。探测轨道震 动频率允许轨道阱被用作高准确度(低至1-2ppm)和高分辨本领 (FWHM)(高至约200,000)的质量分析器。基于轨道阱的质量分析器详 细描述在美国专利号6,995,364中，通过参考以其整体并入本文。已经 报道使用轨道阱分析仪用于定性和定量分析各种分析物。见，例如美 国专利申请公开号2008/0118932(2007年11月9日提交);等Rapid Commun.Mass Spectrom.,2008,22:477-485;Le Breton等, Rapid Commun.Mass Spectrom.,2008,22:3130-36;Thevis等,Mass  Spectrom.Reviews,2008,27:35-50；Thomas等,J.Mass Spectrom.,2008, 43:908-15；Schenk等,BMC Medical Genomics,2008,1:41；和Olsen 等,Nature Methods,2007,4:709-12。

术语“以阴离子模式操作”指其中生成并检测阴离子的那些质谱 法。如本文使用的，术语“以阳离子模式操作”指其中生成并检测阳离 子的那些质谱法。

术语“离子化(ionization)”或“电离(ionizing)”指生成具有等于一个 或多个电子单位(electron unit)的净电荷的离子的过程。阴离子是具有 一个或多个电子单位的净负电荷的那些，而阳离子是具有一个或多个 电子单位的净正电荷的那些。

术语“选择性离子监测”是其中只有在相对窄、通常约一个质量 单元或更少的质量范围内的离子被检测的质谱仪器的检测模式。

“多反应模式”，有时称作“选择反应监测”是其中前体离子和 一种或多种片段离子被选择性检测的质谱仪器的检测模式。

术语“量化的低限”、“定量的低限”或“LLOQ”指其中测量是 量化上有意义的点。在该LLOQ下，分析物的反应是可鉴定的、离散 的和可重现的，相对标准偏差(RSD%)小于20%和准确度为85%至 115%。

术语“检测限”或“LOD”是如此点，在该点下测量值大于与其 测量相关的不确定度。LOD被定义为4乘以0浓度下平均值的RSD。

术语“同时”，当应用至同时检测来自样品的两个或多个分析物 的量，意思是获得反映来自同一样品注入的样品中两个或多个分析物 的量的数据。每个分析物的数据可顺序或平行获得，这取决于所使用 的仪器技术。例如，包含两个分析物如完整IGF-I和IGF-II蛋白的单 个样品可被注入HPLC柱，然后其可一个接着另一个洗脱每个分析物， 这导致将分析物顺序引入质谱仪。为了本文的目的，当两个分析物源 自注入HPLC的同一样品时，同时测定这两个分析物的每一个的量。

体液样品中分析物的“量”一般指反映样品体积中可检测分析物 的质量的绝对值。然而，量也考虑与其他分析物的量相比的相对量。 例如样品中的分析物的量可以是大于对照或正常存在于样品中的分析 物的正常水平的量。

如本文使用的，涉及定量测量——不包括离子质量测量——的术 语“大约”指所示出的值加或减10%。质谱仪在测定给定分析物的质量 时可以稍微变化。在离子质量或离子质/荷比的情况中，术语“大约”指 +/-0.50原子质量单位。

上述的发明内容是非限制性的，并且根据下面的具体实施方式和 权利要求书，本发明的其他特征和优点将是明显的。

附图简述

图1A-C显示m/z为约1093的离子的理论质谱，如通过分辨本领 为约3000(图1A)、约10,000(图1B)和约12,000(图1C)的质量分析器 所分析的。

图2A-D显示，对于m/z为1093.52094、120ppm的质量准确度(图 2A)、50ppm的质量准确度(图2B)、20ppm的质量准确度(图2C)和10 ppm的质量准确度(图2D)的理论峰，仪器响应与所研究离子的真实 m/z的可能偏差。

图3显示用轨道阱质谱仪产生的完整IGF-I的m/z范围为约800 至1300的示例性光谱。细节在实施例2中讨论。

图4显示用轨道阱质谱仪产生的完整IGF-I的m/z范围为约1091 至1096的示例性光谱。细节在实施例2中讨论。

图5显示完整IGF-I各种柱上数量的分析结果的图。细节在实施例 2中讨论。

图6A显示m/z范围为约1090至1098的约40fmol(柱上)完整IGF-I 的示例性光谱。图6B显示相应的提取离子色谱图(EIC)。细节在实施 例3中讨论。

图7A显示m/z范围为约1090至1098的约650fmol(柱上)完整 IGF-I的示例性光谱。图7B显示相应的提取离子色谱图(EIC)。细节在 实施例3中讨论。

图8A和8B显示观察的和计算的m/z范围为约1092至1095.3的 完整IGF-I光谱。细节在实施例3中讨论。

图9A-B显示完整IGF-I各种柱上量的分析结果图。测试的全浓度 范围描绘在图9A中，浓度范围的下端的放大图描绘在图9B中。细节 在实施例3中讨论。

图10显示对在浓度范围从15ng/mL至2000ng/mL的完整IGF-I 响应的线性图。细节在实施例4中讨论。

图11显示用高分辨率/高准确度TOF质谱仪产生的完整IGF-II的 m/z范围为约500至1900的示例性光谱。细节在实施例11中讨论。

图12显示用高分辨率/高准确度TOF质谱仪产生的完整IGF-II的 m/z范围为约1066至1070的示例性光谱。细节在实施例11中讨论。

图13显示完整IGF-II在浓度范围从15ng/mL至2000ng/mL线性 响应的图。细节在实施例11中讨论。

图14显示通过即时LC-MS方法量化完整IGF-II的分析结果与通 过IRMA分析的比较。细节在实施例15中讨论。

图15A、15B和15C显示来自同时量化IGF-II和IGF-I的示例性 总离子色谱图(TIC)和提取离子色谱图(EIC)。图15A显示TIC，图15B 显示IGF-II的EIC，和图15C显示IGF-I的EIC。细节在实施例18中 讨论。

具体实施方式

描述了测量IGF-I和/或IGF-II蛋白的量的方法。更具体而言，高 准确度/高分辨率质谱方法被描述为电离完整IGF-I和/或完整IGF-II， 或其片段，并检测从而产生的离子。这些方法可包括在电离和质谱法 之前纯化样品中的完整IGF-I和/或完整IGF-II，或其片段。但是，可 以不使用色谱法纯化样品实施该方法。优选的实施方式尤其非常适合 应用于大的临床实验室用于自动量化完整IGF-I和/或完整IGF-II，或 片段。另外，本文出现的某些实施方式提供用于IGF-I和/或IGF-II定 量的方法，该方法对于也存在样品中的结合蛋白的干扰不敏感，如， 例如IGFBP-3。

虽然下面讨论的实施例表明量化完整的人IGF-I和/或IGF-II，但 是其他IGF-I和/或IGF-II蛋白可也通过本文描述的方法分析。例如， 完整非人IGF-I和/或IGF-II(例如，同位素标记的或未标记的完整重组 鼠IGF-I和/或IGF-II)、同位素标记的完整人IGF-I和/或IGF-II，或长 R3IGF-I，或其片段，在合适的测试样品中可都用下面的方法量化。

用于本发明方法的合适的测试样品包括可包含关注分析物的任何 测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任 何生物来源如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些 优选的实施方式中，样品从哺乳动物，如狗、猫、马等获得。尤其优 选的哺乳动物是灵长类，最优选男性人类或女性人类。优选的样品包 括体液如血液、血浆、血清、唾液、脑脊液、或组织样品；优选血浆 和血清。这种样品可获得自，例如患者；即，诊断、预后的临床条件 中或疾病或病症的治疗中存在的活体本身，男性或女性。

本发明也考虑IGF-I和/或IGF-II蛋白定量分析的试剂盒。IGF-I 和/或IGF-II蛋白定量分析的试剂盒可包括含有本文提供的组合物的试 剂盒。例如，试剂盒可包括包装材料和量足够至少一次分析的测量量 的同位素标记内标。通常，试剂盒也包括以有形形式记录的说明书(例 如，包含在纸上或电子介质上)：使用包装的试剂用于IGF-I和/或IGF-II 蛋白定量分析。

用在本发明实施方式中的、具有已知浓度的质量控制(QC)库(pools) 优选地使用与期望的样品基质类似的基质制备。

用于质谱分析的样品制备

在准备质谱分析时，可通过本领域已知的各种方法相对于样品中 的一种或多种其他组分(例如其他蛋白质)富集IGF-I蛋白，所述方法包 括例如，固相提取(SPE)、LC、过滤、离心、薄层层析(TLC)、电泳— —包括毛细管电泳、亲和分离——包括免疫亲和分离、提取法——包 括乙酸乙酯或甲醇提取、和使用离液剂或任何上述组合等。在一些实 施方式中，可结合使用液相色谱法和/或SPE，和/或蛋白质沉淀。

蛋白质沉淀是制备测试样品特别是生物学样品例如血清或血浆的 一种方法。蛋白纯化方法是本领域熟知的，例如Polson等,Journal of  Chromatography B2003,785:263-275，描述适合用于本发明方法的蛋白 质沉淀技术。蛋白质沉淀可用于从样品除去大多数蛋白质，在上清液 中留下IGF-I和/或IGF-II蛋白。样品可被离心以将液体上清液与沉淀 蛋白质分离；可选地，可过滤样品以除去沉淀蛋白质。然后，所得到 的上清液或滤液可直接应用到质谱法；或可选地，应用到固相提取和/ 或液相色谱和随后的质谱法。在某些实施方式中，利用蛋白质沉淀例 如酸乙醇蛋白质沉淀可避免在质谱法或HPLC和质谱法之前对TFLC、 SPE或其他联机提取的需要。

在优选的实施方式中，液液提取方法(如酸乙醇提取)用于从样品中 提取天然完整IGF-I和/或IGF-II。在这些实施方式中，10μl和500μl 之间，如25μl和250μl之间，如约100μl的样品被添加至部分提取溶 剂。提取溶剂的量与样品体积相称并可根据使用的提取溶剂而变化， 但优选地在约50μl和1000μl之间。样品/溶剂混合物被混合并离心， 并且部分上清液或有机相(取决于使用的溶剂)被取出用于进一步分析。 溶剂可从取出部分清除，例如在氮气流下，并且残余物在用于液液提 取的不同溶剂中中重构。至少部分所得溶液在质谱法之前可接着经历 另外的处理步骤，如SPE和/或LC。

可在质谱法之前使用的其他样品纯化方法是液相色谱(LC)。液相 色谱的某些方法，包括HPLC，依赖于相对慢的层流技术。传统的HPLC 分析依赖于柱填充物，其中通过该柱的样品的层流是将关注分析物从 样品分离的基础。本领域普通技术人员将理解在这类柱中的分离是扩 散过程，并且可选择LC，包括适用于IGF-I和/或IGF-II使用的HPLC 仪器和柱。一般地，色谱柱包括介质(即填充材料)以促进化学部分的分 离(即分级)。介质可包括微小的颗粒，或可包括具有多孔通道的单片材 料。介质的表面通常包括与不同的化学部分相互作用以促进化学部分 分离的键合表面(bonded surface)。一种适当的键合表面是疏水键合表 面，例如烷基键合或氰基键合表面。烷基键合表面可包括C-4、C-8、 C-12或C-18键合的烷基。在优选的实施方式中，柱是C-18烷基键合 柱(如Phenomenex Onyx单片C-18柱)。色谱柱包括用于接收样品的入 口和用于排放包括分馏样品的流出液的出口。样品可直接，或从SPE 柱，如联机SPE保护柱体或TFLC柱供应至入口。

在一个实施方式中，样品可在入口处被施加到LC柱，用溶剂或溶 剂混合物洗脱，并在出口处排放。可选择不同的溶剂模式以洗脱关注 分析物(一种或多种)。例如，可使用梯度模式、等度模式或多型 (polytyptic)(即混合的)模式进行液相色谱。在色谱法期间，物质的分离 通过多个变量例如洗脱液(也称为“流动相”)、洗脱方式、梯度条件、 温度等的选择来实现。

在某些实施方式中，可在关注分析物通过柱填充物质可逆地保留 而一种或多种其他物质不保留的条件下，通过将样品施加到柱来纯化 分析物。在这些实施方式中，可以使用第一流动相条件，其中关注分 析物被柱保留，并且在未保留物质被洗涤通过后，可随后使用第二流 动相条件以从柱移出保留的物质。可选地，可以在其中关注分析物以 与一种或多种其他物质相比的差别速度下洗脱的流动相条件下，通过 将样品施加到柱来纯化分析物。这类过程可相对于样品的一种或多种 其他组分，富集一种或多种关注分析物的量。

在一些实施方式中，HPLC用烷基键合的分析柱色谱系统进行。在 某些实施方式中，使用C-18分析柱(例如，Phenomenex Onyx单片C18， 或等价物)。在某些实施方式中，使用在水中HPLC级0.2%甲酸作为流 动相A和乙腈中0.2%的甲酸作为流动相B进行HPLC和/或TFLC。

通过小心选择阀和连接器管道(connector plumbing)，两个或更多色 谱柱可根据需要连接，以便物质从一个通过到下一个，而无需任何手 动步骤。在优选的实施方式中，阀和管道的选择通过预编程的计算机 控制，以进行必要的步骤。最优选地，也以这样的联机方式连接色谱 系统至检测器系统，例如MS系统。因此，操作员可将样品托盘置于 自动采样器中，并且剩余操作在计算机控制下进行，这导致所有选择 的样品的纯化和分析。

在一些实施方式中，TFTLC可被用于在质谱法之前纯化IGF-I蛋 白或片段。在这类实施方式中，可以使用俘获分析物的TFLC柱提取 样品，然后洗脱并在第二TFLC柱或分析HPLC柱上进行色谱，然后 离子化。例如，用TFLC提取柱的样品提取可用大粒子尺寸的(50μm) 填充柱完成。然后，该柱洗脱出的样品可被转移到HPLC分析柱，以 在质谱法之前进一步纯化。因为涉及这些色谱过程的步骤可以以自动 方式连接，所以在分析物纯化期间操作员介入的需要可被最小化。该 特征可导致节约时间和成本，并且消除操作员错误的机会。

在一些实施方式中，蛋白质沉淀用来自血清的酸乙醇提取完成， 并且所得溶液进行SPE，优选地用C-18提取柱(例如，Phenomenex Onyx C-18保护柱体，或等价物)联机进行。在质谱分析之前，来自SPE柱的 洗脱液可接着施加至分析LC柱，如以联机方式的HPLC柱。

通过质谱法检测和定量

使用质谱仪进行质谱法，所述质谱仪包括用于电离样品和产生带 电分子以进行进一步分析的离子源。在各种实施方式中，IGF-I和/或 IGF-II蛋白可通过技术人员已知的任何合适的方法电离。例如，样品的 电离可通过如下进行：电子电离、化学电离、电喷射电离(ESI)、光子 电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快 原子轰击(FAB)、液体次级电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、 场致电离、场解吸、热喷射/等离子体喷射电离、表面增强的激光解吸 电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离。本领域普通技术 人员将理解选择电离方法可基于待被测量的分析物、样品类型、检测 器类型、正对负模式的选择等进行确定。根据使用的具体电离方法和 条件，IGF-I和IGF-II蛋白可被电离为许多不同的电荷状态。可选择电 离源以使所产生的电荷状态的分散最小化。在一些实施方式中，ESI(任 选地加热)被用作电离源，并且电离条件被最优化以使观察到的多电荷 IGF-I和/或IGF-II蛋白离子的分配最小化。

可以以正模式或负模式电离IGF-I和/或IGF-II蛋白。在优选的实 施方式中，一种或多种IGF-I和/或IGF-II蛋白以正模式被电离。在一 些实施方式中，产生m/z比在下列范围内的多电荷完整IGF-I离子：约 850.8±2、957.1±2、1093.7±2和1275.8±2。在一些实施方式中，产 生m/z比在下列范围内的多电荷完整IGF-II离子：约934.69±2、1068.07 ±2、1245.92±2和1494.89±2。大部分产生的在这些范围内的多电荷 离子可落在更窄的子范围内，如所述的m/z±1。

在质谱法技术中，一般而言，样品已经被电离之后，从而产生的 带正电的离子或带负电的离子可被分析以检测质荷比(m/z)。用于测定 m/z的各种分析仪包括四极分析仪、离子阱分析仪，和飞行时间分析仪， 和轨道阱分析仪。根据本发明的方法，高分辨率/高准确度质谱法用于 定量分析IGF-I和/或IGF-II蛋白。即，质谱法用对于关注的离子能够 展示至少10,000的分辨本领(FWHM)、约50ppm或更小的准确度的质 谱仪进行；优选地用展示下列分辨本领和准确度的质谱仪进行：分辨 本领(FWHM)为20,000或更好和准确度为约20ppm或更小；如分辨本 领(FWHM)为25,000或更好和准确度为约5ppm或更小；如分辨本领 (FWHM)为25,000或更好和准确度为约3ppm或更小。对于IGF-I和/ 或IGF-II蛋白离子能够展示性能必要水平的三个示例性质谱仪是包括 轨道阱质量分析器、某些TOF质量分析器或傅里叶变换离子共振质量 分析器的那些。

在生物活性分子中出现的元素，如碳、氧和氮以许多不同的同位 素形式自然存在。例如，大部分碳以¹²C出现，但所有天然存在的碳的 约1%以¹³C存在。因此，一部分天然存在的含碳分子包含至少一个¹³C 原子。分子中包含天然存在的元素同位素产生多重分子同位素形式。 分子同位素形式的质量差是至少1个原子质量单位(amu)。这是因为元 素同位素至少有一个中子的不同(一个中子的质量≈1amu)。当分子同 位素形式被电离为多电荷状态，同位素形式之间的质量差别可变得难 以区分，因为质谱检测基于质荷比(m/z)。例如，都被电离为5+状态的 质量差别1amu的两种同位素形式，它们的m/z差仅为0.2(1amu的差 别/5的电荷状态)。高分辨率/高准确度质谱仪能够在高度多重带电荷离 子的同位素形式(如带电荷±5、±6、±7、±8、±9或更高的离子)之间进 行区分。

由于天然存在元素同位素，多重同位素形式通常存在于每种分子 离子中(如果用足够灵敏的质谱仪器分析，其每个可产生可分开检测的 光谱峰)。多重同位素形式的m/z比和相对丰度共同包括分子离子的同 位素“签字”。在一些实施方式中，两种或多种分子同位素形式的m/z 比和相对丰度可用于确认所研究的分子离子的同一性。在一些实施方 式中，来自一种或多种同位素形式的质谱峰用于量化分子离子。在一 些相关实施方式中，来自一种同位素形式的单个质谱峰用于量化分子 离子。在其他相关实施方式中，多个同位素峰用于量化分子离子。在 这些后面的实施方式中，多个同位素峰可进行任何合适的数学处理。 数种数学处理是本领域已知的，包括但不限于对多重峰下面积的求和， 或对来自多重峰的响应平均。

表明m/z范围为约1091-1095.5的这种多重同位素形式的IGF-I离 子的示例性光谱见图4。如在示例性光谱中所见，来自各种同位素形式 的峰在m/z约1091.9447、1092.8031、1092.9445、1093.0881、1093.2308、 1093.3740、1093.5167、1093.6597、1093.8028、1093.9458、1094.0889、 1094.2319、1094.3754、1094.5185、1094.6606、和1095.3717被观察到。 但是，注意因为仪器的不同，观察到的任何离子的同位素变体的精确 质量可能稍微不同(例如，±0.1)。

表明m/z范围在约1067.0-1069.5内的、这种多重同位素形式的 IGF-II离子的另一示例性光谱见图12。如示例性光谱所见，在下列m/z 观察到来自各种同位素形式的峰：约1067.36、1067.51、1067.65、 1067.80、1067.94、1068.08、1068.23、1068.37、1068.51、1068.65、1068.80、 1068.94和1068.08。再一次，因为仪器的不同，观察到的任何离子的 同位素变体的精确质量可能稍微不同。

在质谱技术中，一般而言，可使用数种检测模式检测离子。例如， 所选择的离子可被检测，即，使用选择性离子监测模式(SIM)，或可选 地，可使用扫描模式检测离子。当以扫描模式操作时，质谱仪通常向 使用者提供离子扫描；即，具体质量/电荷在给定范围(例如，100至1000 amu)的每种离子的相对丰度。进一步，当使用能够成倍增加质谱事件 (mass spectrometric event)的仪器如某些离子阱或三重四极仪器时，源自 碰撞诱导的离解或中性损失的质量转移可被监测，例如，多反应监测 (MRM)或选择反应监测(SRM)。

分析物分析的结果，即，通过本领域已知的许多方法，质量光谱 可与初始样品中分析物的量相关。例如，假设取样和分析参数被小心 地控制，给定离子的相对丰度可与将该相对丰度转换为初始分子的绝 对量的表相比较。可选地，内标或外标可与样品一起过柱，并且基于 从这些标准所产生的离子构建标准曲线。使用这种标准曲线，给定离 子的相对丰度可转换成初始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中， 一种或多种标准用于产生标准曲线，用来计算IGF-I和/或IGF-II蛋白 的数量。产生和使用这种标准曲线的方法是本领域已知的并且技术人 员能够选择合适的内标。例如，在优选的实施方式中同位素标记的或 未标记的完整非人IGF-I和/或IGF-II(例如，重组小鼠IGF-I和/或IGF-II) 或同位素标记的完整人IGF-I和/或IGF-II可用作标准。将离子的量与 初始分子的量关联的许多其他方法是本领域技术人员熟知的。

如本文所使用，当通过质谱技术分析时，“同位素标记”在标记 的分子中相对于未标记的分子产生质量移动。合适的标记的例子包括 氘(²H)、¹³C和¹⁵N。同位素标记可结合在分子的一种或多种位置上并 且一种或多种类型的同位素标记可用在相同的同位素标记的分子上。

方法的一个或多个步骤可使用自动化机器实施。在某些实施方式 中，一种或多种纯化步骤联机实施，并且更优选地所有纯化和质谱法 步骤可以以联机方式进行。

在一些实施方式中，如下使用MS检测和/或量化样品中的完整 IGF-I和/或IGF-II。样品进行液相色谱法，优选地HPLC；来自色谱柱 的液体溶剂流进入ESI电离源的加热的喷雾器界面；和在界面的加热 的带电管中，将溶剂/分析物混合物转变为蒸汽。通过施加大电压至溶 剂/分析物混合物，包含在溶剂中的分析物(例如，完整IGF-I和/或IGF-II) 被电离。随着分析物离开界面的带电管，溶剂/分析物混合物雾化并且 溶剂蒸发，留下各种电荷状态的分析物离子。接着收集一种或多种离 子的强度的定量数据。接着收集一种或多种离子的信号强度的定量数 据并且与样品中完整IGF-I和/或IGF-II的数量相关联。

对于完整IGF-I，可观察下列m/z范围的各种电荷状态的离子：约 850.8±2(9+)、957.1±2(8+)、1093.7±2(7+)和1275.8±2(6+)。在一 些实施方式中，收集m/z在约1093.7±2范围内的一种或多种IGF-I离 子的数据并用于定量。该m/z范围内的示例性离子包括下列m/z的 IGF-I离子：约1091.9±0.1、1092.8±0.1、1092.9±0.1、1093.1±0.1、 1093.2±0.1、1093.4±0.1、1093.5±0.1、1093.7±0.1、1093.8±0.1、 1093.9±0.1、1094.1±0.1、1094.2±0.1、1094.4±0.1、1094.5±0.1、 1094.7±0.1和1095.4±0.1。该列举并不意味着是限制性的。许多其他 离子可适合用于该即时方法(instant method)，如显示在图3中的光谱所 表明(其表明检测m/z为下列的同位素离子组：约828.0509±2、850.7373 ±2、871.8730±2、920.5544±2、939.6930±2、956.9532±2、975.4576 ±2、1034.8128±2、1051.6337±2、1073.9335±2、1093.6597±2、 1114.5219±2、1207.9401±2、1226.5705±2、1252.5871±2和1275.6019 ±2；但是，注意如上在这些范围内单个同位素的离子主要落在所叙述 m/z±1的范围内。而且，在该精确度水平上，因为仪器的不同，观察 到的任何离子的质量可能稍微不同，例如±0.1)。

对于完整IGF-II，可观察m/z在下列范围内的各种电荷状态的离 子：约934.69±2(8+)、1068.07±2(7+)、1245.92±2(6+)和1494.89± 2(5+)。在一些实施方式中，收集来自m/z范围在约1068.07±2内的一 种或多种IGF-II离子的数据并用于定量。该m/z范围内的示例性离子 包括具有下列m/z的IGF-II离子：约1067.36±0.1、1067.51±0.1、 1067.65±0.1、1067.80±0.1、1067.94±0.1、1068.08±0.1、1068.23±0.1、 1068.37±0.1、1068.51±0.1、1068.65±0.1、1068.80±0.1、1068.94±0.1 和1069.08±0.1。在一些实施方式中，一种或多种IGF-II离子选自m/z 为约1067.94±0.1和1068.08±0.1的IGF-II离子。该列举并不意味着 是限制性的，并且其他离子可适合用于该即时方法。

在一些实施方式中，使用高分辨率/高准确度质谱仪可允许选择来 自单个离子单个同位素形式的峰的信号强度(如显示在图4中单个 IGF-I离子峰的m/z为约1093.66，或显示在图12中的单个IGF-II峰的 m/z为约1067.80)用于获取数据。可选地，来自单个离子的一种或多种 同位素形式(如图4和12中所表明的一种或多种IGF-I或IGF-II同位素 形式)的信号强度的定量数据，或窄m/z范围的信号强度(如m/z范围为 约1093.7±1的所有IGF-I信号强度，或m/z范围为约1068.2±1的所 有IGF-II信号强度)可被收集并与样品中完整IGF-I和/或IGF-II的数量 相关联。

在一些实施方式中，收集来自至少两个不同电荷状态的一种或多 种IGF-I和/或IGF-II离子的信号强度的定量数据。这些离子的强度可 接着用于量化评估样品中的完整IGF-I和/或IGF-II。例如，IGF-I可用 一种或多种8+电荷状态的IGF-I离子(即，m/z范围为约957.1±2内的 IGF-I离子)和一种或多种7+电荷状态的IGF-I离子(即，m/z范围1093.7 ±2内的IGF-I离子)的信号强度量化。在收集两个或多个离子的信号强 度的定量数据的实施方式中，该强度可结合本领域任何数学方法(如求 和，或平均曲线下面积)，用于量化评估样品中完整IGF-I和/或IGF-II。

当离子碰撞探测器时，它们产生电子脉冲，其被转变成数字信号。 获得的数据依赖于计算机，其绘制所收集离子的计数对时间的图。所 得质量色谱图类似于传统HPLC-MS方法产生的色谱图。可测量对应于 具体离子的峰下面积，或这种峰的振幅，并使之与关注分析物的量相 关联。在某些实施方式中，测量曲线下面积，或峰的振幅以确定IGF-I 和/或IGF-II蛋白或片段的量。如上述，可基于内分子标的一种或多种 离子的峰，使用校准标准曲线将给定离子的相对丰度转化为初始分析 物的绝对量。

在一些实施方式中，IGF-I和IGF-II同时被量化。在这些实施方式 中，IGF-I和IGF-II每个可通过上面提供的任何方法量化。

在某些优选的实施方式中，对于IGF-I，定量的下限(LLOQ)在约 15.0ng/mL至200ng/dL范围内，包括15.0ng/mL和200ng/dL；优选 地在约15.0ng/dL至100ng/mL范围内，包括15.0ng/dL和100 ng/mL；优选地在约15.0ng/mL至50ng/mL范围内，包括15.0ng/mL 和50ng/mL；优选地在约15.0ng/mL至25ng/mL范围内，包括15.0 ng/mL和25ng/mL；优选地在约15.0ng/mL至15ng/mL范围内，包括 15.0ng/mL和15ng/mL；优选地在约15.0ng/mL至10ng/mL范围内， 包括15.0ng/mL和10ng/mL；优选地约15.0ng/mL。

在某些优选的实施方式中，对于IGF-II，定量的下限(LLOQ)在约 30.0ng/mL至200ng/dL范围内，包括30.0ng/mL和200ng/dL；优选 地在约30.0ng/dL至100ng/mL范围内，包括30.0ng/dL和100ng/mL； 优选地在约30.0ng/mL至50ng/mL范围内，包括30.0ng/mL和50 ng/mL；优选地在约30.0ng/mL至25ng/mL范围内，包括30.0ng/mL 和25ng/mL；优选地在约30.0ng/mL至15ng/mL范围内，包括约30.0 ng/mL和15ng/mL；优选地在约30.0ng/mL至10ng/mL范围内，包括 30.0ng/mL和10ng/mL；优选地约30.0ng/mL。

在某些优选的实施方式中，对于IGF-I，检测限(LOD)在约4.9 ng/mL至200ng/mL范围内，包括4.9ng/mL和200ng/mL；优选地在 约4.9ng/mL至100ng/mL范围内，包括4.9ng/mL和100ng/mL；优 选地在约4.9ng/mL至50ng/mL范围内，包括4.9ng/mL和50ng/mL； 优选地在约4.9ng/mL至25ng/mL范围内，包括4.9ng/mL和25ng/mL； 优选地在约4.9ng/mL至20ng/mL范围内，包括4.9ng/mL和20ng/mL； 优选地约4.9ng/mL。

在某些优选的实施方式中，对于IGF-II，检测限(LOD)在约8.2 ng/mL至200ng/mL范围内，包括8.2ng/mL和200ng/mL；优选地在 约8.2ng/mL至100ng/mL范围内，包括8.2ng/mL和100ng/mL；优 选地在约8.2ng/mL至50ng/mL范围内，包括8.2ng/mL和50ng/mL； 优选地在约8.2ng/mL至25ng/mL范围内，包括8.2ng/mL和25ng/mL； 优选地在约8.2ng/mL至20ng/mL范围内，包括8.2ng/mL和20ng/mL； 优选地约8.2ng/mL。

下列实施例用于图解本发明。这些实施例绝不打算限制本方法的 范围。尤其，下列实施例通过使用具体内标的质谱法表明IGF-I和IGF-II 蛋白或片段的量化。使用所指出的内标并不意味着以任何方式是限制 性的。容易被本领域人员测定的任何合适的化学种类可用作内标。

实施例

实施例1： 富集IGF-I蛋白或片段

使用简单制备和随后的联机SPE的组合从血清样品中提取完整的 IGF-I。如下进行酸乙醇提取。

100μL的每个血清样品用400μL的酸/乙醇(87.5%EtOH/12.5% 2M HCl)处理以形成沉淀。混合物进行离心以获得上清液和颗粒状物 (沉淀，pellet)。接着取出400μL的上清液并与60μL1.5M Tris碱混合。 添加Tris碱形成的任何沉淀被滤除并丢弃。滤出液通过联机稀释系统 用水中5%的甲酸稀释以降低乙醇浓度至溶液中的IGF-I可结合至提取 柱的足够水平。

稀释的提取样品被注入Cohesive LC系统用于联机SPE和HPLC 处理，然后进行质谱分析。使用Phenomenex单片Onyx C18保护柱体 (10×4.6mm)作为联机SPE柱完成IGF-I的联机提取和富集。通过 HPLC用Phenomenex Onyx单片C18柱(50×2.0mm)完成分析分离。

实施例2：用高分辨率/高准确度轨道阱MS检测和量化完整IGF-I

使用Thermo Exactive MS系统(Thermo Electron公司)进行MS。 该系统采用具有高分辨率/高准确度MS的轨道阱MS分析仪。当测量 完整IGF-I时，该仪器展示的分辨本领为约25,000FWHM，并且质量 准确度为约1ppm。

用ESI源以阳离子模式，进行电离。用约851、957、1094和1275 的m/z，对应于[IGF-I+nH]ⁿ⁺(n分别=9+、8+、7+和6+)的离子，观察 多电荷完整IGF-I离子的种类。显示1094离子的同位素“签字”的全 扫描光谱和该光谱的放大部分分别出现在图3和4中。

单个同位素形式的两个最强离子——对应于m/z为约956.9532和 1093.6592的离子同位素形式——所收集的数据被求和并用于量化评 估样品中完整IGF-I的量。从柱上31fmol至4000fmol的完整IGF-I 制作的校准曲线中，观察到了线性。该曲线显示在图5中。天然完整 IGF-I的拟合优度(R²)值是0.9984。

实施例3：用高分辨率/高准确度TOF MS检测和量化完整IGF-I

也使用Agilent 6530Accurate-Mass Q-TOF MS系统(Agilent  Technologies，Inc.)进行MS。该系统采用具有高分辨率/高准确度MS 的高分辨率/高准确度TOF MS分析仪。当测量完整IGF-I时，该仪器 展示的分辨本领为约25,000FWHM，并且质量准确度为约3ppm。下 列软件用于这些实验：Agilent MassHunter Workstation Acquisition  B.02.01；Agilent MassHunter Quantitative Software B.03.02；Agilent  MassHunter Qualitative software B.02.00；和Cohesive Aria OS v.1.5.1。

100μL空白血清中40fmol和650fmol样品产生的、m/z范围为约 1090至1098的示例性光谱分别显示在图6A和7A中。对应图6A和 7A中所示光谱的提取离子色谱图(EIC)分别显示在图6B和7B中。

收集m/z为约1093.7±2的同位素形式的IGF-I离子的数据，并定 性和定量评估样品中完整IGF-I的量。通过比较观察到的m/z范围为约 1092至1095.3的光谱与根据天然存在的同位素分布计算的光谱，进行 定性评估(即，基于同位素“签字”确认IGF-I的同一性)。观察的和计 算的光谱分别显示在图8A和8B中。

用来自单同位素形式(对应的理论m/z为约1093.5209)的数据和来 自多同位素形式的求和数据进行量化评估。来自单同位素形式的数据 用于产生柱上20fmol至2600fmol完整IGF-I的线性校准曲线。这对 应于样品浓度为约8.2ng/mL至约1054ng/mL(样品大小为100μL)的 线性观察。完整IGF-I和内标收集的数据呈现在下面表1中。校准曲线 显示在图9A(测试的整个浓度范围)和9B(浓度范围下端的放大图)。完 整IGF-I的拟合优度(R²)值为0.9996。

表1.用于校准曲线的完整IGF-I和内标(完整重组小鼠IGF-I)测定

实施例4：高分辨率/高准确度TOF MS量化完整IGF-I的准确度和精确度

分析来自6个QC库(室内QC库和Bio-Rad肿瘤标记对照)的每个 的10个重复样品，产生分析间精确度(intra-assay precision)。通过以100 ng/mL、400ng/mL和741ng/mL的水平将已知量的IGF-I掺入处理血 清(stripped serum)制备3个QC库。样品的10个重复的变异系数(CV) 用于评估定量的再现性。来自这些分析的数据呈现在表2(室内QC库) 和表3(Bio-Rad肿瘤标记对照)中。

表2.使用室内QC库的完整IGF-I分析间变异

表3.使用Bio-Rad肿瘤标记对照的完整IGF-I分析间变异

对定量结果进行的统计表明6个QC库的再现性(CV)对于掺入的 室内QC库范围为从2.4%至4.4%而对于Bio-Rad肿瘤标记对照范围为 从1.8%至2.2%。

分析间变异定义为分析之间测量的再现性。与上面相同的6个QC 库评估5天。来自这些分析的数据呈现在表4(室内QC库)和表 5(Bio-Rad肿瘤标记对照)中。

表4.室内QC样品的完整IGF-I分析间变异

表5.Bio-Rad肿瘤标记对照的完整IGF-I分析间变异

这些测量的结果表明库的分析间变异(%CV)，对于掺入的室内QC 库范围为从1.3%至6.1%并且对于Bio-Rad肿瘤标记对照范围为从0.8% 至3.3%。对于低、中和高度掺入的室内QC样品，总体变异分别为5.0%、 5.2%和3.5%，而对于低、中和高度的Bio-Rad QC材料，总体变异分 别为3.3%、3.1%和2.8%。

分析间准确度定义为单个分析内测量的准确度。每个室内QC库 被重复10次分析，以测定重复测量完整IGF-I的准确度。QC库的结 果为3个库分别产生约103%、99%和102%的准确度。

分析间准确度定义为分析之间的测量准确度。4天5次试验7次重 复分析3个QC库，以测定测量完整IGF-I的准确度。QC库的分析结 果为3个库分别产生104%、103%和103%的总体准确度。这些结果在 可接受的准确度范围80%至120%内。

实施例4：用高分辨率/高准确度TOF MS量化完整IGF-I的分析物测量范围

制备9个掺入浓度范围为15ng/mL至2000ng/mL的完整IGF-I的 处理血清样品。这些样品接着在分开的5天进行分析以评估分析物检 测范围和检测的线性。来自5个连续分析的加权线性回归产生0.995 或更大的相关系数，准确度±20%。因此，分析可量化的范围是至少 15ng/mL至2000ng/mL。表明反应线性的结果图显示在图10中。

实施例5：用高分辨率/高准确度TOF MS限定完整IGF-I量化的检测限/下限

检测限(LOD)是如此点，在该点下测量值大于与其相关的不确定度 并被任意地定义为与零浓度的四倍的标准差(SD)。空白被测量22次并 且所得面积比被反算，以确定完整IGF-I的LOD为4.9ng/mL。

定量的下限(LLOQ)是测量的值是量化上有意义的点。在该LLOQ 下，分析物的响应是可鉴定的、离散的和可重现的，精确度优于或等 于20%，准确度在85%至120%之间。通过在接近期望的LLOQ浓度(4.9 ng/mL、7.8ng/mL、15.6ng/mL、31.2ng/mL和62.5ng/mL)分析5个不 同样品确定LLOQ，并在5天7个试验中评估分析间再现性。这些分 析表明对于完整IGF-I，LLOQ是15ng/mL。

实施例6：用高分辨率/高准确度TOF MS掺入回收(加标回收，spike recovery)完整IGF-I

通过用具有另外的完整IGF-I的已知低水平的完整IGF-I掺入患者 血清达到50ng/mL、100ng/mL、400ng/mL和1000ng/mL的最终浓度， 进行回收研究。分析掺入的样品，并且结果对完整IGF-I的背景水平进 行校正。对每个掺入的浓度计算回收，平均回收分别是约100%、96%、 97%和92%。来自这些研究的数据显示在表6中。

表6.患者血清中完整IGF-I的掺入回收研究

实施例7：量化完整IGF-I的方法间相关性(Inter-method correlation)

分开来自100个患者的样品并用上述LC-MS方法分析。部分样品 也使用下列进行分析：Siemens IMMULITE 2000免疫分析系统 (Siemens Healthcare Diagnostics，Inc.)、the Meso Scale Discovery  SECTOR系统(Meso Scale Discovery)和RIA方法(通过Esoterix,Inc.， 测试编号500282，酸:醇提取后阻断RIA)。100个分开的样品中，60 个用IMMULITE系统分析。

通过Deming回归分析来自4种方法的数据。比较的结果显示在表 7中。LC-MS分析被表明与RIA方法具有最好的一致性(agreement)。

表7.比较4个完整IGF-I分析方法的Deming回归分析

实施例8：完整IGF-I干扰研究

通过滴定溶解的红血细胞至患者血清，确定评估的血红蛋白浓度 为0mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL， 来评估溶血对完整IGF-I测定的影响。如所描述滴定3个不同患者样品， 并提取用于完整IGF-I分析。结果与非掺入库结果相比较并且计算差值 百分数。该比较产生的数据呈现在表8中。

表8.患者血清样品中完整IGF-I的溶血性干扰研究

如在表8中可见，所有全血掺入的样品产生可接受的结果 (80%-120%的对照值)并且表明完整IGF-I检测和血红蛋白浓度之间没 有依赖性。因此，显示轻微至中度溶血的样品是可接受的。

通过滴定脑脂质提取物至患者血清中，确定评估的脂质浓度为0 mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL， 来评估脂血对完整IGF-I测定的影响。如所描述的，滴定3个不同患者 样品，并提取用于IGF-I分析。结果与非掺入库结果相比较并且计算差 值百分数。该比较产生的数据呈现在表9中。

表9.患者血清样品中完整IGF-I的脂血性干扰研究

如在表9中可见，所有脂质掺入的样品产生可接受的结果(对照值 的80%-120%)并且表明完整IGF-I检测和脂质浓度之间没有依赖性。因 此，显示轻微至中度脂血的样品是可接受的。

通过滴定胆红素至患者血清，以确定评估的胆红素浓度为0 mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL和2mg/mL， 而评估胆红素对完整IGF-I测定的影响。如所描述的，滴定3个不同患 者样品，并提取用于完整IGF-I分析。结果与非掺入库结果相比较并且 计算差异百分数。该比较产生的数据呈现在表10中。

表10.患者血清样品中完整IGF-I的胆红素干扰研究

如在表10中可见，所有胆红素掺入的样品产生可接受的结果(对照 值的80%-120%)并且表明完整IGF-I检测和胆红素浓度之间没有依赖 性。因此，显示轻微至中度胆红素的样品是可接受的。

通过滴定重组IGFBP-3至患者血清，确定评估的IGFBP-3浓度为 0mg/L、2mg/L、5mg/L、8mg/L和9mg/L，来评估IGFBP-3对完整 IGF-I测定的影响。如所描述的，滴定3个不同患者样品，并提取，在 它们制备的3小时内进行完整IGF-I分析。另一组15个患者样品用 IGFBP-3掺入至最终浓度为5mg/L并在4℃下平衡3天然后提取。在 两个实验中，结果与非掺入库结果相比较并且计算差值百分数。这些 比较产生的数据分别呈现在表11和12中。

表11.患者血清样品(制备后3小时提取)中IGFBP-3对完整IGF-I的干 扰研究

表12.患者血清样品(制备后3天提取)中IGFBP-3对完整IGF-I的干扰 研究

  样品   与对照(5mg/L IGFBP-3)相比较的回收%   1   96.7   2   111.7   3   117.0   4   116.2   5   105.9

  6   115.2   7   100.6   8   102.3   9   104.6   10   113.4   11   99.9   12   109.8   13   94.2   14   109.7   15   90.4   平均   105%

如在表11和12中可见，所有IGFBP-3掺入的样品产生可接受的 结果(对照值的80%-120%)并且表明完整IGF-I检测和IGFBP-3浓度之 间没有依赖性。因此，IGFBP-3没有显示出对IGF-I分析的干扰。

实施例9：IGF-I样品类型研究

在4个类型：血清、柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA 血浆中收集10个患者库。检测来自每个样品类型的样品中的完整IGF-I 水平。成双方差分析(ANOVA)仅指出血清和柠檬酸盐血浆之间的统计 学显著差异。这指示血清、肝素血浆和EDTA血浆是可接受的样品类 型。来自这些研究的数据呈现在表13中。

表13.样品类型对IGF-I定量的影响

实施例10：富集IGF-II蛋白或片段

使用脱机样品制备和随后的联机SPE和HPLC的组合从校准样品、 QC样品和患者血清样品中提取完整人IGF-II。如下进行酸乙醇提取。

100μL的每个样品用400μL的酸/乙醇(87.5%EtOH/12.5%2M HCl)处理以形成沉淀。混合物进行离心以获得上清液和颗粒状物。接 着取出350μL的上清液，与60μL1.5M Tris碱混合，并在-20℃下温 育1小时。温育的混合物接着进行离心并丢弃用添加Tris碱形成的任 何沉淀。上清液接着直接施加至HPLC柱用于质谱分析。

上面的样品制备后，所得溶液被注入Cohesive LC系统用于联机 SPE和HPLC处理，然后进行质谱分析。使用Phenomenex单片Onyx C18保护柱体(10×4.6mm)作为联机SPE柱完成联机提取和富集完整 人IGF-II。通过HPLC用Phenomenex Onyx单片C18柱(50×2.0mm) 完成分析分离。

实施例11：用高分辨率/高准确度TOF MS检测和量化完整IGF-II

使用Agilent 6530Accurate-Mass Q-TOF MS系统(Agilent  Technologies，Inc.)进行MS。该系统采用具有高分辨率/高准确度MS 的高分辨率/高准确度TOF MS分析仪。当测量完整IGF-II时，该仪器 展示的分辨本领为约21,000FWHM，并且质量准确度为约3ppm。下 列软件用于这些实验：Agilent MassHunter Workstation Acquisition  B.02.01；Agilent MassHunter Quantitative Software B.03.02；Agilent  MassHunter Qualitative software B.02.00；和Cohesive Aria OS v.1.5.1。

从完整人IGF-II的高分辨率/高准确度质谱分析产生的、表明完整 IGF-II离子处于8+、7+、6+和5+电荷状态的示例性光谱显示在图11 中。在约400至2000的m/z范围收集该光谱。如在图11中所显示， 来自不同电荷状态的峰出现在约934.57、1067.94、1245.76和1494.71 的m/z处。

从完整人IGF-II的高分辨率/高准确度质谱分析产生的、表明完整 IGF-II离子处于7+电荷状态的示例性光谱显示在图12中。在约1066 至1070的m/z范围收集该光谱。如在图12中所显示，来自天然存在 的同位素的峰出现在约1067.36、1067.51、1067.65、1067.80、1067.94、 1068.08、1068.23、1068.37、1068.51、1068.65、1068.80、1068.94和 1068.08的m/z比处。

收集m/z为约1067.94和1068.08的两个同位素形式的完整人 IGF-II离子的数据，并且定性和定量评估样品中完整人IGF-II的量。 通过将在106.94和1068.08处峰的实验同位素比例与从天然存在的同 位素分布计算的理论比例进行比较，进行定性评估(即，基于同位素“签 字”确认IGF-II的同一性)。

用上面所指出的两种同位素形式的求和进行量化评估。产生约15 ng/mL至约2000ng/mL的完整人IGF-II的校准库浓度的线性校准曲线。 对完整人IGF-II收集的数据呈现在下面表14中。所测试的全浓度范围 的校准曲线显示在图13中。完整人IGF-II的拟合优度(R²)值是0.9998。

表14.用于校准曲线的完整人IGF-II测定

实施例12：用高分辨率/高准确度TOF MS量化完整IGF-II的准确度和精确度

分析来自6个QC库(3个室内QC库和3off-the-clot(未凝结的)人 血清样品)的每个的8个重复样品产生分析间精确度。样品的8次重复 的变异系数(CV)用于评估定量的再现性。来自这些分析的数据呈现在 表15(室内QC库)和表16(off-the-clot人血清样品)中。

表15.使用室内QC库的完整IGF-II分析间变异

表16.使用Off-the-Clot人血清样品的完整IGF-II分析间变异

对定量结果进行的统计表明6个QC库的再现性(CV)对于掺入的 室内QC库范围为从2.1%至4.7%和对于off-the-clot人血清样品范围从 2.0%至7.7%。

分析间准确度定义为单个分析内测量的准确度。室内QC库中完 整人IGF-II的重复测量对于200ng/mL、500ng/mL和1200ng/mL的库 分别产生约100.7%、100.7%和100.4%的精确度。

分析间变异定义为分析之间测量的再现性。与上面相同的6个QC 库被评估5天。来自这些分析的数据呈现在表17(室内QC库)和表18 (off-the-clot人血清样品)中。

表17.室内QC样品的完整IGF-II分析间变异。

表18.Off-the-Clot人血清样品的完整IGF-II分析间变异。

这些测量的结果表明库的分析间变异(%CV)对于掺入的室内QC 库范围为从3.2%至6.1%和对于off-the-clot人血清样品范围为从2.0% 至6.5%。

分析间准确度定义为分析之间测量的准确度。室内QC库中完整 人IGF-II的重复测量对于200ng/mL、500ng/mL和1200ng/mL的库分 别产生约102.2%、99.1%和99.1%的精确度。这些结果在80%至120% 的可接受准确度范围内。

实施例13：用高分辨率/高准确度TOF MS定量完整IGF-II的检测限/下限

空白限(LOB)是如此点，在该点下测量值大于与其相关的不确定度 并被任意定义为与零浓度的2倍的标准差(SD)。获得合适的生物基质 (处理血清)的空白样品并测量15次。所得面积比被反算，以确定处理 血清中完整人IGF-II的LOB为4.9ng/mL。

检测限(LOD)是如此点，在该点下测量值大于与其相关的不确定度 并被任意定义为与零浓度的4倍的标准差(SD)。空白被测量15次并且 所得面积比被反算，以确定完整IGF-II的LOD为8.2ng/mL。

定量的下限(LLOQ)是测量的值是量化上有意义的点。在LLOQ 下，分析物的响应是可鉴定的、离散的和可重现的，精确度优于或等 于20%，准确度在80%至120%之间。通过在接近期望的LLOQ浓度(4.9 ng/mL、7.8ng/mL、15.6ng/mL、31.2ng/mL和62.5ng/mL)分析5个不 同样品确定LLOQ，并在5天6个试验中评估分析间再现性。这些分 析表明对于完整IGF-II，LLOQ是30ng/mL。

实施例14：用高分辨率/高准确度TOF MS掺入回收完整IGF-II

通过用完整人IGF-II掺入处理血清达到最终浓度62.5ng/mL、125 ng/mL、500ng/mL和1200ng/mL进行回收研究。分析掺入的样品，并 且结果对完整人IGF-II的背景水平进行校正。对每个掺入的浓度计算 回收，平均回收分别为约106%、104%、99%和99%。来自这些研究的 结果显示在表19中。

表19.患者血清中完整IGF-II的掺入回收研究

实施例15：量化完整IGF-II的方法间相关性

分开来自42个患者的样品并用上述LC-MS方法分析，部分样品 也使用由Quest Diagnostics Nichols Institute进行的IRMA方法进行分 析。

通过线性回归和Deming回归分析来自这两种方法的数据。比较的 结果显示在表20和图13中。表明LC-MS分析与IRMA方法有良好 的一致性。

表20.对于完整IGF-II，LC-MS和IRMA分析方法的比较

实施例16：IGF-II干扰研究

通过滴定溶解的红血细胞至患者血清，确定评估的血红蛋白浓度 为0mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL， 来评估溶血对完整人IGF-II测定的影响。如所描述的，滴定3个不同 患者样品，并提取用于完整人IGF-II分析。结果与非掺入库结果相比 较并且计算差值百分数。该比较产生的数据呈现在表21中。

表21.患者血清样品中完整人IGF-II的溶血性干扰研究

如在表21中可见，所有全血掺入样品产生可接受的结果(对照值的 80%-120%)并且表明完整人IGF-II检测和血红蛋白浓度之间没有依赖 性。因此，显示轻微至中度溶血的样品是可接受的。

通过滴定脑脂质提取物至患者血清中，确定评估的脂质浓度为0 mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、7.5mg/mL、10mg/mL和20mg/mL， 来评估脂血对完整人IGF-II测定的影响。如所描述的，滴定3个不同 患者样品，并提取用于人IGF-II分析。结果与非掺入库结果相比较并 且计算差值百分数。该比较产生的数据呈现在表22中。

表22.患者血清样品中完整人IGF-II的脂血性干扰研究

如在表22中可见，所有脂质掺入的样品产生可接受的结果(对照值 的80%-120%)并且表明完整人IGF-II检测和脂质浓度之间没有依赖性。 因此，显示轻微至中度脂血的样品是可接受的。

通过滴定胆红素至患者血清，确定评估的胆红素浓度为0mg/mL、 0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL和2mg/mL，来评估 胆红素对完整人IGF-II测定的影响。如所描述的，滴定3个不同患者 样品，并提取用于完整人IGF-II分析。结果与非掺入库结果相比较并 且计算差值百分数。该比较产生的数据呈现在表23中。

表23.患者血清样品中完整人IGF-II的胆红素干扰研究

如在表23中可见，所有胆红素掺入的样品产生可接受的结果(对照 值的80%-120%)并且表明完整人IGF-II检测和胆红素浓度之间没有依 赖性。因此，显示轻微至中度胆红素的样品是可接受的。

通过滴定重组IGFBP-3至患者血清，确定评估的IGFBP-3浓度为 5mg/L、10mg/L和20mg/L，来评估IGFBP-3对完整IGF-II测定的影 响。如所描述的，滴定3个不同患者样品，并提取，在它们制备的3 小时内用于完整人IGF-II分析。另一组15个患者样品用IGFBP-3掺入 至最终浓度为5mg/L并在4℃下平衡3天，然后提取。在两个实验中， 结果与非掺入库结果相比较并且计算差值百分数。这些比较产生的数 据分别呈现在表24和25中。

表24.患者血清样品(制备后3小时提取)中IGFBP-3对完整人IGF-II 的干扰研究

表25.患者血清样品(制备后3天提取)中IGFBP-3对完整人IGF-II的 干扰研究

  样品   与对照(5mg/L IGFBP-3)相比较的回收%   1   102.6   2   111.0   3   117.5   4   105.6   5   91.9   6   87.5   7   111.2   8   105.9   9   99.1   10   111.8   11   104.6   12   95.5   13   99.9   14   87.7   15   99.3   平均   102%

如在表24和25中可见，所有IGFBP-3掺入的样品产生可接受的 结果(对照值的80%-120%)并且表明完整人IGF-II检测和IGFBP-3浓度 之间没有依赖性。因此，IGFBP-3没有显示出干扰完整人IGF-II的分 析。

实施例17：IGF-II样品类型研究

在4个类型：血清、柠檬酸盐血浆、肝素血浆和EDTA 血浆中收集10个患者库。检测来自每个样品类型的样品中的完整人 IGF-II的水平。成双方差分析(ANOVA)仅指出血清和柠檬酸盐血浆之 间的统计学显著差异。这指示血清、肝素血浆和EDTA血浆是可接受 的样品类型。来自这些研究的数据呈现在表26中。

表26.样品类型对IGF-II定量的影响

实施例18：同时量化IGF-II和IGF-I

制备来自12个患者的样品，并用上述LC-MS方法分析。对每个 样品同时量化完整人IGF-I和IGF-II。同时分析的结果呈现在表27中。

表27.同时量化IGF-II和IGF-I

  患者  IGF-II(ng/mL)   IGF-I(ng/mL)   1   316   371   2   207   1107   3   389   416   4   495   279   5   297   836   6   408   353   7   301   45   8   339   227   9   83   35   10   339   214   11   291   731   12   477   216   6   408   353

来自这些研究的IGF-II和IGF-I的示例性总离子色谱图和提取的 离子色谱图分别显示在图15A、15B和15C中。

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