利用TRAIL和HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用

摘要

本发明公开了一种利用TRAIL和HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用，使双基因在抑制肿瘤细胞生长方面发挥协同作用。采用从鸡脾细胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分别扩增出TRAIL和HN基因序列，通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因以柔性氨基酸的linker连接；将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭载体中，经与pAd-Easy骨架载体共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-linker-HN；将重组腺病毒质粒由PacI酶切后，经脂质体介导，转染AD293细胞，包装后获得重组腺病毒；并对双基因抑瘤作用的协同效应进行评价。

说明书

技术领域

本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用TRAIL和HN 基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用。

背景技术

近年来，随着某些重要动物疫源性疾病和普通病相继得到有效控制，畜 禽肿瘤性疾病的防治越发显得重要。如禽白血病(avian leukosis，AL)作为 一类禽类肿瘤性疾病，在许多国家和地区均有报道，常给养禽业造成较大的经 济损失。AL是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒(avian  leukosis/sarcoma virus，AL/SV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称。以病 禽造血组织发生恶性、无限制增生和全身许多器官组织出现肿瘤性病灶为主 要病理变化特征。迄今为止，兽医临诊上还未研制出能有效预防该病的疫苗， 故尚无切实可行的防治措施。在生产实践中主要通过病原检测、淘汰阳性鸡 和净化种群等方法控制该病的发生。因此，如何突破畜禽肿瘤性疾病防治过 程中的技术桎梏，已成为动物医学界在该研究领域一直努力和亟待解决的难 题，而目前兴起的基因疗法无疑为此类疾病的防治提供了崭新的研究思路。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，将TRAIL对肿瘤细胞的靶向性、HN基因 的细胞凋亡作用与腺病毒表达载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结 合，构建融合表达上述基因的重组腺病毒Ad-TRAIL-linker-HN，使双基因在 抑制肿瘤细胞生长方面发挥协同作用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用TRAIL和 HN基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，包括以下步骤：

1)鸡TRAIL和新城疫病毒HN基因的克隆与序列分析；

2)TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重组腺病毒质粒的构建；

3)TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重组腺病毒的构建；

4)重组腺病毒介导禽淋巴白血病DT40细胞凋亡的体外实验。

具体包括步骤如下：

本试验从鸡脾细胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中分别扩增出TRAIL 和HN基因序列，通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因以5-15 个柔性氨基酸的linker连接；将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭 载体中，经与pAd-Easy骨架载体共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其 在BJ5183内进行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒 pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-linker-HN；将重组腺病毒质粒由PacI酶切后，经 脂质体介导，转染AD293细胞，包装后获得重组腺病毒；应用RT-PCR对重组 腺病毒在AD293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术和细胞毒试验 检测病毒感染AD293细胞后的形态变化；利用氯化铯(CsCl)密度梯度离心 法纯化病毒并测定其滴度；将获得的重组腺病毒体外转染禽淋巴白血病DT40 细胞，通过RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的感染性和外源基 因的表达情况；分别采用MTT和流式细胞仪检测重组腺病毒对DT40细胞生长 的影响以及TRAIL和TRAIL-linker-HN基因对DT40细胞的凋亡作用，并对双 基因抑瘤作用的协同效应进行评价。

本发明的有益效果是：将TRAIL对肿瘤细胞的靶向性、HN基因的细胞凋 亡作用与腺病毒表达载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结合，构建融 合表达上述基因的重组腺病毒Ad-TRAIL-linker-HN，使双基因在抑制肿瘤细 胞生长方面发挥协同作用。通过对重组腺病毒在DT40细胞中的病毒滴度、外 源基因的蛋白表达、细胞活力和细胞凋亡的检测，综合评价了重组腺病毒对 DT40细胞的抑瘤作用，阐明重组腺病毒在DT40细胞中的表达规律及杀伤肿 瘤细胞的生物学效应，结果显示TRAIL和TRAIL-linker-HN基因均可抑制 DT40细胞的生长并诱导肿瘤细胞凋亡(P＜0.01)，并且TRAIL-linker-HN基因 的抑瘤作用(凋亡率为29.52％)显著优于TRAIL基因(凋亡率为4.86％)。本 发明最终研制出一种针对动物肿瘤性疾病的广谱疫苗。

附图说明

图1是TRAIL和HN基因RT-PCR扩增结果(1.DL15000；2.HN基因； 3.TRAIL基因)。

图2是TRAIL基因Blast结果。

图3是HN基因Blast结果。

图4是PCR扩增结果(1.DL2000；2.对照；3、DL15000；4.linker-HN基 因；5.TRAIL-linker；6.TRAIL-linker-HN基因)。

图5是pShuttle-TRAIL双酶切结果(1.DL2000；2.pShuttle-TRAIL酶 切产物；3.pShuttle-TRAIL)。

图6是pShuttle-TRAIL-linker-HN双酶切结果(1.pShuttle-TRAIL- linker-HN酶切产物；2.pShuttle-TRAIL-linker-HN；3.DL15000)。

图7是重组腺病毒质粒酶切结果(1.pAd-TRAIL-linker-HN；2. pAd-TRAIL-linker-HN酶切产物；3.DL15000；4.对照；5.pAd-TRAIL酶切产 物；6.pAd-TRAIL)。

图8是pAd-GFP酶切结果(1.pAd-GFP酶切产物；2.pAd-GFP；3. DL15000)。

图9是重组腺病毒感染AD293细胞后RT-PCR检测目的基因(1.λ -DNA/Eco1301；2.TRAIL RT-PCR产物；3.HN RT-PCR产物；4.TRAIL-linker-HN  RT-PCR产物)。

图10是重组腺病毒对DT40的细胞毒作用(A.Control 1d；B.Control 2d；C.Ad-TRAIL 1d；D.Ad-TRAIL-linker-HN 1d；E.Ad-TRAIL 2d；F.Ad- TRAIL-linker-HN 2d；G.Ad-TRAIL 3d；H.Ad-TRAIL-linker-HN 3d)。

图11是Western blotting检测重组腺病毒感染DT40细胞后TRAIL和 TRAIL-linker-HN蛋白的变化。

图12是重组腺病毒感染DT40细胞后的生长曲线。

图13是重组腺病毒诱导DT40细胞凋亡(A.Ad-GFP组；B.Ad-TRAIL 组；C.Ad-TRAIL-linker-HN组；D.三组重组腺病毒诱导DT40细胞凋亡率)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

1材料与方法

1.1TRAIL和HN基因的扩增

取健康SPF鸡，按照《现代动物免疫学》中的实验方法制备淋巴细胞， 加入1mlTrizol试剂，按照产品说明书操作，提取总RNA。根据GeneBank中 鸡TRAIL基因序列(GI 45383401)，设计一对RT-PCR扩增引物。

按Takara公司PrimeScript TM One Step RT-PCR kit说明书采用一步 法进行扩增TRAIL基因序列。扩增产物克隆到pMD18-T载体上。将鉴定正确 的重组质粒命名为pMD-TRAIL，于-20℃保存备用。

用灭菌生理盐水溶解冻干保存的NDV LaSota系毒株(1∶1000倍稀释)， 经双抗(青霉素∶链霉素＝1∶1配成100万U/ml溶液)处理后，提取总RNA。 根据GeneBank中已发表的NDV HN cDNA序列(GI：124295088)设计如下引物。 经RT-PCR扩增(反应体系见表1)和T-A克隆(反应体系见表2)，将鉴定正 确的重组质粒命名为pMD-HN。引物序列见下表3。

表1RT-PCR反应体系

注：反应条件为：50℃1h，94℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃2min，35 个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。

表2T-A克隆连接体系

表3引物序列

1.2TRAIL基因的定点突变

在对pMD-TRAIL测序结果分析时发现，TRAIL基因中含有PacI酶切位点， 由于PacI为腺病毒载体构建中必须用到的限制性内切酶，因此，采用重叠 延伸拼接法(gene splicing by overlap extension，SOE)对TRAIL序列进 行修饰。分别以CMVtrF和CMVtrMR、CMVtrMF和CMVtrR为引物，以pMD-TRAIL 为模板，扩增突变TRAIL上、下节片段。1％琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物， 切胶回收目的片段。

以CMVtrF和CMVtrR为引物，以回收纯化的TRAIL上、下节段为模板， 扩增突变TRAIL基因。1％琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，切胶回收目的片段。

1.3TRAIL-linker-HN融合基因的扩增

以CMVtrF和linkerR为引物，以突变TRAIL回收纯化产物为模板，扩增 TRAIL-linker。以linkerF和CMVhnR为引物，以pMD-HN为模板，扩增 linker-HN。反应体系见表1。1％琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，切胶回收目 的片段。

以CMVtrF和CMVhnR为引物，以回收纯化的TRAIL-linkerr和linker-HN 为模板，扩增TRAIL-linker-HN。反应体系见表1。1％琼脂糖凝胶电泳PCR 扩增产物，切胶回收目的片段。

1.4TRAIL和TRAIL-linker-HN重组穿梭载体的构建

回收纯化产物TRAIL和TRAIL-linker-HN及载体pShuttle-CMV分别用 Kpn I和Xho I进行双酶切。将双酶切获得的目的基因TRAIL和 TRAIL-linker-HN分别与pShuttle-CMV相连，16℃连接过夜。连接反应体系 为10×T₄DNA Ligase Buffer1.0μl，载体片段3.0μl，目的片段5.5μl， T₄DNA Ligase 0.5μl。卡那霉素抗性筛选，菌液PCR筛选，酶切及测序鉴定， 构建pShuttle-CMV-TRAIL和pShuttle-CMV-TRAIL-linker-HN重组穿梭质粒。

1.5重组腺病毒质粒的构建

用Pme I分别酶切pShuttle-TRAIL、pShuttle-TRAIL-linker-HN和 pShuttle-CMV，使其线性化。37℃酶切过夜，用1％琼脂糖凝胶电泳酶切产物 ，切胶回收目的片段(去离子水洗脱)。将线性化的1μl穿梭载体与1μl pAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性筛选，挑取针尖样 小菌落进行菌液PCR筛选及Pac I酶切鉴定，获得同源重组腺病毒质粒，命 名为pAd-TRAIL、pAd-TRAIL-linker-HN和pAd-GFP。

1.6TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重组腺病毒的构建

重组腺病毒质粒大提操作方法见Hispeed Plasmid Purification  Handbook。将大提后的重组腺病毒质粒由Pac I酶切后，经6.0μl脂质体 Lipofectamine2000介导，转染AD293细胞，包装后获得重组腺病毒 Ad-TRAIL-Linker-HN。

利用RT-PCR检测目的基因mRNA转录，对重组腺病毒进行鉴定；通过荧 光显微镜检测对照腺病毒的细胞转染情况；采用氯化铯(CsCl)密度梯度离 心法纯化前期所扩增的病毒，参照AdEasyTM XL Adenovirus Vector System 试剂盒说明书进行病毒滴度测定。

1.7重组腺病毒介导禽白血病淋巴细胞DT40凋亡的体外实验

为了评价TRAIL和HN基因融合表达后在动物肿瘤基因治疗中的作用，本 研究选择了禽白血病淋巴细胞DT40株为研究对象，转染Ad-TRAIL-linker-HN 到DT40细胞，观察Ad-TRAIL-linker-HN对DT40细胞的体外抑制作用，并探 讨其诱导DT40细胞凋亡的生物学效应。

将呈对数生长期，细胞密度为70％的DT40细胞分为3组，分别用20MOI 的Ad-TRAIL、Ad-TRAIL-linker-HN和空病毒载体Ad-GFP感染三组细胞。48h 后在倒置显微镜及倒置荧光显微镜下观察各组细胞的形态变化。

采用Western blotting法检测重组腺病毒在DT40细胞中的表达情况， 采用流式细胞术检测重组腺病毒对DT40细胞的凋亡作用。

2结果与分析

2.1鸡TRAIL和新城疫病毒HN基因的克隆与序列分析

利用特异性引物，分别以鸡脾细胞总RNA和LaSota株NDV核酸为模板， 通过RT-PCR方法，分别扩增出915bp的TRAIL基因条带和1716bp的HN基因 条带，均与预期相符(见图1)。

测序结果与GeneBank中的数据进行Blast分析，表明TRAIL基因及HN 基因序列同源性均为99％。通过DNAMAN软件对该同源序列做进一步分析，比 对结果见图2、3。

2.2TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重组腺病毒质粒的构建

通过降落PCR方法，实现了TRAIL基因与HN基因通过linker序列相连， 得到了2.7kb的目的片段(见图4)。

pShuttle-TRAIL和pShuttle-TRAIL-linker-HN经过Kpn I和Xho I双酶 切，分别得到900bp和2.7kb的目的片段，表明重组穿梭载体构建成功(见 图5、6)。

Pac I酶切pAd-TRAIL、pAd-TRAIL-linker-HN和pAd-GFP，分别得到 4.5kb、3kb和4.5kb的片段(见图7、8)，表明pAd-TRAIL和pAd-GFP的同 源重组发生在复制起点，pAd-TRAIL-linker-HN的同源重组发生在左臂。

采用定点突变方法对TRAIL基因进行修饰，将原TRAIL序列中Pac I酶 切位点TTAATTAA定点突变为TTGATCAA，其他编码氨基酸序列不变。

模板序列为TRAIL基因、HN基因及Linker序列叠加而成，经DNAMAN比 对，同源性为100％。

2.3TRAIL和TRAIL-linker-HN基因重组腺病毒的构建

将线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹后，转染AD293细胞，用DMEM 维持液(含有2％胎牛血清)在37℃ 5％CO₂培养箱内培养，每日于倒置显微 镜下观察细胞变化，约第7d，经pAd-TRAIL、pAd-TRAIL-linker-HN和pAd-GFP 转染的AD293细胞出现肿胀、圆缩等典型病毒感染病变(CPE)，而未感染组 细胞未见变化。

RT-PCR产物的电泳结果显示，900bp和2.7kb处出现特异性扩增条带(见 图9)。

将对照组腺病毒质粒线性化，经脂质体法包裹后，转染293细胞，每日 于倒置显微镜下观察细胞变化，约经7d后，经转染的293细胞出现典型的 CPE(细胞出现聚集成团或呈串珠样等腺病毒感染的特有形状)，在荧光显微镜 下可见感染细胞出现绿色荧光。实验组腺病毒未加GFP标签的原因是避免后 续检测时其他荧光试剂的干扰。

感染第7d后，对稀释度10^-5～10^-9范围病毒液进行蚀斑数统计，依据公 式：病毒滴度(PFU/ml)＝平均数×10⁹，对各感染组病毒滴度进行计算，得 到Ad-TRAIL病毒滴度为1.8×10¹⁰，Ad-TRAIL-linker-HN病毒滴度为1.9× 10¹⁰，Ad-GFP病毒滴度为1.5×10¹⁰，表明各感染组均获得较高滴度的病毒液。

2.4重组腺病毒介导禽白血病淋巴细胞株DT40的凋亡

DT40细胞被20MOI Ad-GFP、Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-linker-HN感染48h 后，在倒置显微镜下观察细胞形态。可见经Ad-GFP处理的细胞形态完整，与 PBS处理组相同，未见细胞病变；而Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-linker-HN感染 的DT40细胞呈现细胞漂浮、肿胀等显著细胞病变(CPE)(见图10)。

用20MOI的Ad-GFP、Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-linker-HN分别感染DT40 细胞，48h后收取细胞，Western blotting检测TRAIL和TRAIL-linker-HN 基因的蛋白表达，可见相应的目的条带：TRAIL为34kD，HN为62kD(见图 11)。

用20MOI Ad-TRAIL、Ad-TRAIL-linker-HN和Ad-GFP、病毒分别感染DT40 细胞，MTT检测细胞的生长活力。结果显示：Ad-GFP对肿瘤细胞的生长无明 显影响(P＞0.05)，细胞感染Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-linker-HN后，细胞存活 率随时间的延长逐渐下降，对DT40细胞的生长有明显抑制作用，感染后5d 细胞存活率缓慢下降。在相同时间点，Ad-TRAIL-linker-HN感染组细胞的存 活率最低，且不同组细胞生长抑制与Ad-TRAIL-linker-HN感染呈现明显的时 间依赖性。故Ad-TRAIL-linker-HN组对DT40细胞的抑制作用显著(P＜0.05) (见图12)。

分别被20MOI的Ad-GFP、Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-linker-HN病毒感染 48h后，用流式细胞仪检测DT40细胞凋亡和细胞周期的变化。Ad-GFP组细胞 凋亡率为0.95％；Ad-TRAIL组凋亡率为4.86％；而Ad-TRAIL-linker-HN组 细胞凋亡率为29.52％，说明Ad-AIL-linker-HN可直接诱导DT40细胞的凋 亡(见图13)。

3结论

3.1本发明从鸡脾细胞和NDV(LaSota弱毒株)中分别扩增出TRAIL和 HN基因序列。利用Linker序列串联扩增出带有5-15个柔性氨基酸的 TRAIL-Linker-HN基因，实现了双基因的串联。

3.2利用TRAIL对肿瘤细胞的靶向性、HN基因的细胞凋亡作用和腺病毒 表达载体系统高效稳定表达外源基因的特性，构建融合表达上述基因的重组 腺病毒Ad-TRAIL-Linker-HN。通过转染293细胞，包装获得高滴度的重组腺 病毒。

3.3重组腺病毒感染293细胞的实验结果显示：目的基因在靶细胞中能 够有效表达，包装后的腺病毒载体具有良好的感染性，可以在293细胞中形 成病毒颗粒。并成功构建了重组腺病毒Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-Linker-HN以 及对照重组腺病毒Ad-GFP。

3.4重组腺病毒体外转染DT40肿瘤细胞的实验结果显示：TRAIL和 TRAIL-Linker-HN基因可在DT40细胞中稳定表达并对DT40细胞产生细胞毒 作用。其中，Ad-TRAIL-Linker-HN可以明显抑制DT40细胞的生长并诱导肿 瘤细胞凋亡。

本发明首次将TRAIL对肿瘤细胞的靶向性、HN基因的细胞凋亡作用与腺 病毒表达载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结合，构建融合表达上述 基因的重组腺病毒Ad-TRAIL-linker-HN，使双基因在抑制肿瘤细胞生长方面 发挥协同作用。通过对重组腺病毒在DT40细胞中的病毒滴度、外源基因的蛋 白表达、细胞活力和细胞凋亡的检测，综合评价了重组腺病毒对DT40细胞的 抑瘤作用，阐明重组腺病毒在DT40肿瘤细胞中的表达规律及杀伤肿瘤细胞的 生物学效应，探讨重组腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡及基因治疗的临床应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。