用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法

摘要

本发明公开了一种用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方法。本发明提供了序列表的序列1、序列2所示DNA、兼并引物和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物；所述兼并引物为针对莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。应用本发明提供的引物组合物可以获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点。本发明提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的简并引物进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入突变基因侧翼序列。本发明对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于扩增产氢微藻莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方 法。

背景技术

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是50多年来用于研究光合作用机理的模 式生物。2007年全基因组序列信息的获得，为从基因组水平研究莱茵衣藻各种生命活 动特征及分子调控机理提供了可以利用的高通量分子操作平台。

在全基因组序列信息的基础上，如何确定各个基因的功能，研究基因与表型的关 系是当前的主要问题。与其它的模式光合生物相比，莱茵衣藻基因组序列具有GC含量 高、重复序列多等特点，采用传统的基因克隆方法不容易成功。所以研究单个基因与 表型的关系具有一定难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于扩增莱茵衣藻插入突变基因侧翼序列的引物及方 法。

本发明提供了序列表的序列1所示DNA(Sp0)、序列表的序列2所示DNA(Sp1)、 兼并引物和序列表的序列8所示DNA(AC1)组成的引物组合物；所述兼并引物为针对 莱茵衣藻的基因组DNA的兼并引物。

所述兼并引物具体可为序列表的序列7所示DNA(LAD-5-RMD227)、序列表的序 列3所示DNA(LAD1)、序列表的序列4所示DNA(LAD2)、序列表的序列5所示DNA (LAD3)或序列表的序列6所示DNA(LAD4)。

本发明还保护一种获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入 位点的方法，包括如下步骤：

(1)提取莱茵衣藻突变体的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，用序列表的序列1所示DNA和所述兼并引物作为引物 进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；

(3)以第一轮PCR扩增产物为模板，用序列表的序列2所示DNA和序列表的序列 8所示DNA作为引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物；

(4)将第二轮PCR扩增产物进行测序，通过与野生型莱茵衣藻的基因组序列进行 比对，得到莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的插入位点；

所述莱茵衣藻突变体是在莱茵衣藻中导入PSI103质粒得到的突变体。

所述第一轮PCR扩增的反应条件具体如下：

(1)93℃2分钟；

(2)95℃1分钟；

(3)94℃30秒，68℃1分钟，72℃3分钟，11个循环；

(4)94℃30秒，25℃2分钟，以0.5度/秒的速度升温至72℃，72℃3分钟；

(5)94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，26个循环；

(6)72℃5分钟。

所述第二轮PCR扩增的反应条件具体如下：

(1)94℃20秒，67℃1分钟，72℃3分钟，2个循环；

(2)94℃20秒，68℃1分钟，72℃3分钟，94℃20秒，68℃1分钟，72℃3 分钟，94℃20秒，50℃1分钟，72℃3分钟，14个循环；

(3)72℃5分钟。

巴龙霉素的蛋白序列具体可如序列表的序列15所示，其编码基因具体可如序列表 的序列16所示。

野生型莱茵衣藻的基因组序列可以从NCBI(美国生物信息学中心)获取，也可以从衣藻 基因网站(http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/runAlignment？db＝Chlre4&advanced＝1)中 获取。

所述引物组合物可用于获得莱茵衣藻突变体的基因组DNA中巴龙霉素编码基因的 插入位点。

所述引物组合物或所述方法可用于辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功 能。

本发明还保护一种辅助鉴定莱茵衣藻的基因组DNA中各基因功能的试剂盒，包括 PSI103质粒和所述引物组合物。

所述莱茵衣藻具体可为莱茵衣藻藻种CC400(mt-)。

本发明提供的方法，将设计的两条特异性引物与TAIL-PCR所用的兼并引物(简并 引物)进行组合，在优化的PCR反应条件下，可高效特异的扩增插入莱茵衣藻基因组 DNA的外源基因的侧翼序列。因此，可以将外源DNA随机插入莱茵衣藻的基因组DNA， 得到各种突变株，再采用本发明的引物和方法确定外源基因的插入位点，通过比较突 变株和野生株的表型差异辅助确定发生插入突变所在的基因的功能。采用本发明的引 物和方法的主要优点有：(1)高通量；如果采用96孔PCR仪，一次可完成数十个目 的片段的扩增；(2)引物特异性强；采用本发明的引物进行PCR扩增，第二轮反应后 就可以检测到特异的条带，与传统方法相比特异性明显提高；(3)操作简便快速；只 需在普通PCR仪上设定反应程序，在当天(一般约8小时内)就可完成一次扩增反应。 本发明对高通量克隆莱茵衣藻基因、研究基因功能具有重要意义。

附图说明

图1为TAIL-PCR扩增产物的电泳图；

1-1：以第一个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-1进行第一轮扩增，用 Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-2：以第一个突变体的基因组DNA为模 板，用Sp0和LAD-2进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物； 1-3：以第一个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-3进行第一轮扩增，用Sp1 和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-4：以第一个突变体的基因组DNA为模板， 用Sp0和LAD-4进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；1-5： 以第一个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用 Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；

2-1：以第二个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-1进行第一轮扩增，用 Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-2：以第二个突变体的基因组DNA为模 板，用Sp0和LAD-2进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物； 2-3：以第二个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-3进行第一轮扩增，用Sp1 和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-4：以第二个突变体的基因组DNA为模板， 用Sp0和LAD-4进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；2-5： 以第二个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用 Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；

3-1：以第三个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-1进行第一轮扩增，用 Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-2：以第三个突变体的基因组DNA为模 板，用Sp0和LAD-2进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物； 3-3：以第三个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-3进行第一轮扩增，用Sp1 和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-4：以第三个突变体的基因组DNA为模板， 用Sp0和LAD-4进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；3-5： 以第三个突变体的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-5-RMD227进行第一轮扩增，用 Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；

CC400-1：以莱茵衣藻藻种CC400(mt-)的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-1 进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-2：以莱茵衣 藻藻种CC400(mt-)的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-2进行第一轮扩增，用Sp1 和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-3：以莱茵衣藻藻种CC400(mt-)的 基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-3进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增 的PCR扩增产物；CC400-4：以莱茵衣藻藻种CC400(mt-)的基因组DNA为模板，用 Sp0和LAD-4进行第一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物；CC400-5： 以莱茵衣藻藻种CC400(mt-)的基因组DNA为模板，用Sp0和LAD-5-RMD227进行第 一轮扩增，用Sp1和AC1进行第二轮扩增的PCR扩增产物。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻种CC400(mt-)，从美国杜克大学 (Chlamy center，http://www.chlamy.org/)购买。

PSI103质粒购自美国杜克大学(Chlamy center，http://www.chlamy.org/)； PSI103质粒中含有巴龙霉素抗性基因。

正常TAP培养液：NH₄Cl 0.4g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1g/L；CaCl₂·2H₂O 0.05g/L；K₂HPO₄0.108g/L；KH₂PO₄ 0.056g/L；Trisbase 2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’s trace elements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，其余为水。

固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加1.5％的琼脂粉。

实施例1、各种突变体的获得

各种突变体均是将藻种CC400采用PSI103随机插入方法获得(Kindle，Journal of Applied Phycology，Volume 6，Number 2，231-238，1990)的，具体步骤如下：

(1)用限制性内切酶KpnI酶切PSI103质粒，得到线性化的质粒；

(2)用玻璃珠法将线性化的质粒转化莱茵衣藻藻种CC400(mt-)，在含有巴龙 霉素的TAP培养基中进行筛选，得到若干抗巴龙霉素的突变株，即为突变体库。

(3)通过IMAGING-PAM在突变体库中筛选Fv/Fm小于0.5的突变株系，取其中的 6株突变体株系作为实施例3的实验材料。

F0：初始荧光，初始荧光是光系统II(PS II)反应中心处于完全开放时的荧光产量， 它与叶片叶绿素浓度有关。Fm：最大荧光产量(maximalfluorescence)，是PS II反应 中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映经过PS II的电子传递情况，通常叶片经暗适 应20min后测得。Fv＝Fm-F0：为可变荧光，反映了QA的还原情况。Fv/Fm：是PS II最 大光化学量子产量反映PS II反应中心内荧光能转换效率或称最大PS II的光能转换效 率，叶暗适应20min后测得；非胁迫条件下该参数的变化极小，不受物种和生长条件 的影响，胁迫条件下该参数明显下降。

实施例2、TAIL-PCR引物设计

在巴龙霉素基因的3’序列端设计特异性引物Sp0和Sp1，设计针对于莱茵衣藻的兼 并引物LAD-5-RMD227，兼并引物中去除NotI酶切位点，降低引物合成成本。

合成表1所示的各引物。其中LAD1、LAD2、LAD3、LAD4和LAD-5-RMD227均为兼并引 物。

表1PCR扩增所用引物序列

  引物名称   引物序列(5’→3’)   Sp0(序列表的序列1)   AGGACCCGTGGTTCGGGCCGGAGTGTTC   Sp1(序列表的序列2)   GCGATGGACTCCAGTCCGGCCTTCCGCGGTGTTCCTGTGGGAGTAC   LAD1(序列表的序列3)   ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA   LAD2(序列表的序列4)   ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT   LAD3(序列表的序列5)   ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA   LAD4(序列表的序列6)   ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT   LAD-5-RMD227   (序列表的序列7)   ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCNTCGWGWTSCNAGC   AC1(序列表的序列8)   ACGATGGACTCCAGAG   M13F   TGTAAAACGACGGCCAGT   M13R   CAGGAAACAGCTATGACC

V代表A、C或G；N代表A、G、C或T；B代表C、G或T；W代表A或T；S代表C 或G；D代表A、G或T。

实施例3、应用实施例2的引物检测衣藻基因组DNA中插入位点的侧翼序列

一、基因组DNA提取

使用天根生化科技(北京)有限公司植物总DNA提取试剂盒参照试剂盒的使用说 明提取莱茵衣藻藻种CC400(mt-)以及实施例1得到的6株突变体的总DNA。

具体提取步骤：取1ml藻液于1.5ml eppendorf管中，7000rpm 1分钟，除上清； 加入含有0.1％巯基乙醇的GP1溶液700ul，65℃20分钟，期间上下颠倒数次；之后 加入700ul氯仿，12000rpm 5分钟，小心的将所得上清水相转移到新的1.5ml eppendorf 管中，充分混匀；将混匀液体转移至吸附柱CB3中，12000rpm 30秒，弃掉废液，将 吸附柱放回到收集管中；向吸附柱中加入500ul GD去蛋白液，12000rpm 30秒，弃掉 废液，将吸附柱放回到收集管中；向吸附柱中加入700ul漂洗液，12000rpm 30秒， 弃掉废液，将吸附柱放回到收集管中；向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm 30 秒，弃掉废液，将吸附柱放回到收集管中；12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附 柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱转移至一个 干净的离心管中，向吸附膜的中央部位滴加50ul TE缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

二、TAIL-PCR反应

以步骤一提取的基因组DNA为模板，用实施例2合成的引物(见表1)进行TAIL-PCR 反应，得到PCR扩增产物。TAIL-PCR反应体系见表2。TAIL-PCR反应条件见表3。PCR反 应中将第一轮扩增后的PCR产物稀释50倍，取一微升作为第二轮反应的模板。

表2TAIL-PCR反应体系

  组分   第一轮的扩增体系(ul)   第二轮的扩增体系(ul)   Sp0(10uM)   0.5   0   LAD(10uM)   2.5   0   Sp1(10uM)   0   0.5   AC1(10uM)   0   0.5   dNTP(2.5mM)   2   2   2×GC Buffer I   12.5   12.5   LA-Taq   0.2   0.2   H₂O   6.3   8.3   DNA(20-30ng/ul)   1   1

LAD即实施例2中合成的LAD1、LAD2、LAD3、LAD4或LAD-5-RMD227。

表3TAIL-PCR反应条件

三、PCR产物克隆及测序

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，其中莱茵衣藻藻种CC400(mt-)和三个突变 体的电泳结果见图1。如图1所示，用Sp0/LAD和Sp1/AC1作为引物，对随机挑取的三个 突变体扩增均可得到至少一条较为特异的条带，说明设计的特异性引物是有效的。其 中LAD-5-RMD227作为兼并引物在三个突变体中配合Sp0、Sp1和AC1使用，均能得到特异 条带，说明该引物较为适合于莱茵衣藻TAIL-PCR扩增。

用Tiangen(Beijing，China)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209-03)回收纯化 目的条带，与pEasyT1-Simple vector(购自Transgen公司)连接，转化大肠杆菌 (Escherichia coli)Trans-T1感受态细胞(购自Transgen公司)，用蓝白斑方法筛 选阳性克隆。挑取单克隆培养，用M13F和M13R组成的引物对进行PCR鉴定，阳性克隆进 行测序，6个突变体采用Sp0/LAD-5-RMD227和Sp1/AC1的测序结果分别如序列表的序列 9至序列14所示。

将序列9至序列14与莱茵衣藻的基因组序列进行同源比对后，各个突变体中巴龙霉 素的插入位点见表4。莱茵衣藻的基因组序列可以从NCBI(美国生物信息学中心)上获 取，也可以从衣藻基因网站

(http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/runAlignment？db＝Chlre4&advanced＝1)中获 取。本实施例中是从衣藻基因网站上直接输入测序结果进行BLAST的。

表4个突变体中巴龙霉素的插入位点

  突变体编号   侧翼序列   染色体编号   插入位点   1   序列表的序列9   12   9186649   2   序列表的序列10   10   3874368   3   序列表的序列11   18   378078   4   序列表的序列12   2   4236019   5   序列表的序列13   8   2423243   6   序列表的序列14   7   5636165

在获得插入位点后，可以结合基因组序列设计特异性引物找到插入质粒的另一端， 最终确定删除的基因，为后续的互补及功能分析奠定基础。通过确定质粒的插入位点， 结合突变体的表型，可以初步判断插入位点所在基因的功能。