利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法

摘要

利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法，包括丛枝菌根真菌菌剂的配制、菌根化烟苗的培养和菌根化烟苗的移栽与管理三个步骤。本发明通过试验证实，在土壤中添加丛枝菌根真菌和牛粪，协同促进植物生长，共同提高植被中磷含量、降低铅、镉对烟草的毒害和污染，促进烟草生长，从而降低烟草中镉和铅的残留。

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进烟草生长、降低烟草铅、镉残留的方法，具体的说是一种利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物，同时烟草又是一种特殊食品，我国吸烟人口众多，因此其质量安全广受重视，近年来，常有烟草重金属超标等质量安全问题的报道，这势必影响到我国烟草产业的竞争力和健康发展。我国，烟草的种植面积、烤烟产量和生产量均居世界首位，烟草中的重金属可以在抽吸过程中通过燃烧随主流烟气进入人体，对人体造成潜在危害。越来越多的研究证实，吸烟已成为烟民某些重金属的主要来源之一，烟草中重金属残留过高与烟草所生长的土壤有一定的关系，同时肥料和农药的不规范也会导致烟草的重金属含量过高，其中镉含量最高。

目前，对于降低烟草中重金属残留的方法，除了减少烟草种植环境污染之外，常用石灰、钙镁磷肥、粘土矿物等无机改良剂用来降低烟草重金属残留，中国发明专利（CN101724405A）发明了一种降低农作物镉、铅污染的土壤改良剂，采用Ca(OH)₂、Na₂SiO₇等无机组分用来降低烟草中重金属残留的问题，但存在在着工艺复杂，增加了生产成本，不能更好的应用于烟草产业中。

发明内容

本发明针对上述问题的不足，提供利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法，其工艺简单，操作方便，有效降低烟草中镉的残留，降低生产成本。

本发明为解决上述问题所采用的技术方案是：利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法，包括以下步骤：

步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的配制

1）按体积比取3份粒径为1mm的河沙和1份粒径为1mm的泥炭，混合均匀，形成混合物，后将混合物在121℃条件下，灭菌50—60分钟，取出冷却至30—40℃，制得混合基质，备用；

2）按每100kg混合基质中加入7.8g尿素和33g过磷酸钙的比例，在步骤1）中灭菌后的混合基质中加入尿素和过磷酸钙，混合均匀，形成底肥，备用；

3）按重量百分比取95—97%的底肥和3—5%的初始丛枝菌根真菌菌剂，混合均匀，形成培养混合物，以培养混合物重量为基准，在培养混合物中加入15—25%的水，后播种苜蓿草种子，按苜蓿草的常规培养方法，培养3—4个月，得到被丛枝菌根真菌侵染的苜蓿草和含有丛枝菌根真菌孢子及根外菌丝的基质，将苜蓿草的根剪成0.5—1mm的小段，然后与含有丛枝菌根真菌孢子及根外菌丝的基质混合，制得丛枝菌根真菌菌剂，备用；

步骤二、菌根化烟苗的培养

在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤一中制得的丛枝菌根真菌菌剂，后播种烟草种子，使育苗盘下部的1/3处浸入水中，待种子出苗后间苗，使每孔内留1棵烟草苗，并将水换成低磷营养液，每天补足低磷营养液中减少的水分，每2—3周更换一次低磷营养液，生长至50—60天后，取侵染率大于30%的菌根化烟苗，备用；

步骤三、菌根化烟苗的移栽与管理

在田间土壤中挖移栽穴，将步骤二中得到的菌根化烟苗种植在移栽穴中，然后采用撒施的方法在田间施加有机肥，施加量按15000—22500千克/公顷进行加入，对菌根化烟苗进行培育，在培育期间加入化肥，化肥的加入量按烟草种植的常规量进行施加，同时进行水分、杂草等田间管理，使烟草正常生长至收获；

所述的有机肥为腐熟的牛粪；

所述的丛枝菌根真菌菌剂的菌种为苏格兰球囊霉Glomus caledonium 90036、蜜色无梗囊霉Acaulospora mellea ZZ、摩西球囊霉Glomus mosseae BEG167或根内球囊霉Glomus intraradices BEG141中的任意一种。

所述的低磷营养液的组成成分：每升低磷营养液中含有11.3 mg的KH₂PO₄、126.3 mg的KNO₃、295 mg的Ca(NO₃)₂、123.3 mg的MgSO₄、0.715 mg的H₃BO₃、0.453 mg的MnCl₂·4H₂O、0.005 mg的H₂MoO₄·H₂O、0.055 mg的ZnSO₄·7H₂O和0.02 mg的CuSO₄·5H₂O，其中在低磷营养液中还加入由1.863 mg EDTA和1.393 mg FeSO₄·7H₂O构成的螯合态Fe-EDTA。

在上述技术方案中所用的烟草种子，为一般市售产品，本发明中所用的为烟草K326，购买于青岛中烟种子有限责任公司。

在上述技术方案中所用的丛枝菌根真菌菌种，为苏格兰球囊霉、蜜色无梗囊霉、摩西球囊霉或根内球囊霉中的任意一种，均能在市场上购买得到。

有益效果

1、在本发明中，铅、镉是植物毒性较强的两种重金属元素，会抑制根系发育及其对养分的吸收，从而影响整株植物的生长。本发明中添加丛枝菌根真菌和牛粪，能够显著降低铅、镉的毒害，促进烟草生长。

2、在本发明中施加牛粪和丛枝菌根真菌，协同促进植物生长，共同提高植被中磷含量、降低铅、镉对烟草的毒害和污染。牛粪除了给土壤供给养分以外，还增加土壤的缓冲性能和吸附能力，并通过吸附、络合、还原、挥发等作用，降低其生物有效性和植物毒害，促进植物生长，有利于重金属污染土壤的植物修复，为烟草提供磷源供植物吸收利用；丛枝菌根真菌可以通过螯合作用、菌丝固持作用等抑制重金属的移动性，通过改善植物营养状况、改变根际理化性状、改变根系形态、调节某些基因的表达及重金属诱导蛋白的合成等多种途径提高植物耐性，但是单独使用，效果较差，本发明中，同时添加牛粪和丛枝菌根真菌，能够更好的促使有机质与铅、镉发生各种理化作用，降低其生物有效性和植物毒性。

3、本发明初步证实了接种丛枝菌根真菌和施加牛粪能够提高烟叶产量、降低铅、镉残留，二者间具有协同作用，这对于重金属污染土壤中无公害烟叶的生产有重要意义。同时，烟草作为高生物量作物，对镉、铅、铜、锌、镍、汞重金属有较强的吸收、累积能力，也可以应用于重金属污染土壤的植物修复。

4、本发明提供的促进烟草生长、降低烟草重金属铅、镉残留的方法，其工艺简单，操作简单，能够有效降低烟草中铅、镉的残留，提高烟草质量安全，降低健康风险。

具体实施方式

利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法，包括以下步骤：

步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的配制

1）按体积比取3份粒径为1mm的河沙和1份粒径为1mm的泥炭，混合均匀，形成混合物，后将混合物在121℃条件下，灭菌50—60分钟，取出冷却至30—40℃，制得混合基质，备用；

2）按每100kg混合基质中加入7.8g尿素和33g过磷酸钙的比例，在步骤1）中灭菌后的混合基质中加入尿素和过磷酸钙，混合均匀，形成底肥，备用；

3）按重量百分比取95—97%的底肥和3—5%的初始丛枝菌根真菌菌剂，混合均匀，形成培养混合物，以培养混合物重量为基准，在培养混合物中加入15—25%的水，后播种苜蓿草种子，按苜蓿草的常规培养方法，培养3—4个月，得到被丛枝菌根真菌侵染的苜蓿草和含有丛枝菌根真菌孢子及根外菌丝的基质，将苜蓿草的根剪成0.5—1mm的小段，然后与含有丛枝菌根真菌孢子及根外菌丝的基质混合，制得丛枝菌根真菌菌剂，备用；

步骤二、菌根化烟苗的培养

在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤一中制得的丛枝菌根真菌菌剂，后播种烟草种子，使育苗盘下部的1/3处浸入水中，待种子出苗后间苗，使每孔内留1棵烟草苗，并将水换成低磷营养液，每天补足低磷营养液中减少的水分，每2—3周更换一次低磷营养液，生长至50—60天后，取侵染率大于30%的菌根化烟苗，备用；

步骤三、菌根化烟苗的移栽与管理

在田间土壤中挖移栽穴，将步骤二中得到的菌根化烟苗种植在移栽穴中，然后采用撒施的方法在田间施加有机肥，施加量按15000—22500千克/公顷进行加入，对菌根化烟苗进行培育，在培育期间加入化肥，化肥的加入量按烟草种植的常规量进行施加，同时进行水分、杂草等田间管理，使烟草正常生长至收获；

所述的有机肥为腐熟的牛粪；

所述的丛枝菌根真菌菌剂的菌种为苏格兰球囊霉Glomus caledonium 90036、蜜色无梗囊霉Acaulospora mellea ZZ、摩西球囊霉Glomus mosseae BEG167或根内球囊霉Glomus intraradices BEG141中的任意一种；

所述的低磷营养液的组成成分：每升低磷营养液中含有11.3 mg的KH₂PO₄、126.3 mg的KNO₃、295 mg的Ca(NO₃)₂、123.3 mg的MgSO₄、0.715 mg的H₃BO₃、0.453 mg的MnCl₂·4H₂O、0.005 mg的H₂MoO₄·H₂O、0.055 mg的ZnSO₄·7H₂O和0.02 mg的CuSO₄·5H₂O，其中在低磷营养液中还加入由1.863 mg EDTA和1.393 mg FeSO₄·7H₂O构成的螯合态Fe-EDTA；

实施例一

利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅残留的方法，包括以下步骤：

步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的配制

1）按体积比取3份粒径为1mm的河沙和1份粒径为1mm的泥炭，混合均匀，形成混合物，后将混合物在121℃条件下，灭菌50分钟，取出冷却至30℃，制得混合基质，备用；

2）按每100kg混合基质中加入7.8g尿素和33g过磷酸钙的比例，在步骤1）中灭菌后的混合基质中加入尿素和过磷酸钙，混合均匀，形成底肥，备用；

3）按重量百分比取95—97%的底肥和3—5%的初始丛枝菌根真菌菌剂，混合均匀，形成培养混合物，以培养混合物重量为基准，在培养混合物中加入15—25%的水，后播种苜蓿草种子，按苜蓿草的常规培养方法，培养3—4个月，得到被丛枝菌根真菌侵染的苜蓿草和含有丛枝菌根真菌孢子及根外菌丝的基质，将苜蓿草的根剪成0.5—1mm的小段，然后与含有丛枝菌根真菌孢子及根外菌丝的基质混合，制得丛枝菌根真菌菌剂，备用；

步骤二、菌根化烟苗的培养

在泡沫漂浮孔穴育苗盘中加入步骤一中制得的丛枝菌根真菌菌剂，后播种烟草种子，使育苗盘下部的1/3处浸入水中，待种子出苗后间苗，使每孔内留1棵烟草苗，并将水换成低磷营养液，每天补足低磷营养液中减少的水分，每2周更换一次低磷营养液，生长至50天后，得到侵染率大于30%的菌根化烟苗，然后用灭菌河沙代替丛枝菌根真菌菌剂，播种烟草种子，依据菌根化烟苗的栽培方法，培育得到非菌根化烟苗，将非菌根化烟苗做为对照处理，备用；

步骤三、菌根化烟苗的移栽与管理

取田间土壤，粉碎过筛，用甲醛熏蒸灭菌处理，风干5天后备用；向风干后的土壤中混入适量的硝酸铅，形成铅污染水平分别为0、350、500、1000 mg/kg的四种不同污染程度的土壤，分别代表无污染、轻度污染、中度污染、重度污染；向不同污染程度的土壤中分别施加相应的硝酸钙，使各污染水平下的硝态氮含量相同；将每种污染程度的土壤均分成4组分装在不同的盆中，将每一个铅污染水平设为4个处理，分别为1个非菌根化烟苗做对照处理（不接菌剂、不加牛粪），1个菌根化烟苗处理，1个非菌根化烟苗施加牛粪处理，1个菌根化烟苗施加牛粪处理。装盆时的具体操作为：在1.8升的塑料盆中，每盆装配置好的污染或者未污染的土壤1.5 kg，每盆只装1种污染水平的土壤，其中两个需要施加牛粪的处理中牛粪的添加量为土壤质量的1%，即15 g，将牛粪与整盆土壤混匀。4个铅污染水平，每个污染水平设置4个处理，共计16个处理，每个处理做4盆重复，每盆栽烟苗1株，共计64盆；塑料盆在日光温室内随机排列进行培育，在培育期间加入化肥，化肥的加入量按烟草种植的常规量进行施加，同时烟苗进行病虫害管理，浇自来水，维持土壤持水量在70%左右；移栽70天后收获测定烟草生物量和铅含量；

结果显示：从表1中得到，在所有铅污染水平下，在接种丛枝菌根真菌和牛粪的处理组中均能促进烟草生长，三个试验组中的平均植株干重是对照组的2.5、2.3和2.5倍，三个试验组中的平均根系干重是对照组的2.6、2.7和2.7倍，在未污染水平下，对照组中促进烟草生长效果最好，而在污染水平下，试验组C中促进烟草生长效果最显著，

从表2得到，在铅污染土壤中，施加菌剂和牛粪混合物的处理组中降低了烟草植株中铅的残留，但在没有污染的土壤中，施加菌剂和牛粪混合物的处理组中均能降低烟草植株中的铅残留。

表1烟草植株部分干重（克）

                 表2烟草植株部分的铅含量(mg/kg)

                 实施例二

利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草镉残留的方法，包括以下步骤：

步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的配制

同实施例1中步骤一的配制方法；

步骤二、菌根化烟苗的培养

同实施例1中的步骤二的培养方法；

步骤三、菌根化烟苗的移栽与管理

依据实施例1中步骤三的移栽方法，将硝酸铅替换为硝酸镉，形成镉污染水平分别为0、1、10、100 mg/kg的四种不同污染程度的土壤，分别代表无污染、轻度污染、中度污染、重度污染，在不同的镉污染水平下分别施加相应的硝酸钙，后依据实施例1中的步骤三的管理方法，得到移栽70天后烟草中的生物量和镉含量；

结果显示：从表3中得到，在所有镉污染水平下，在接种丛枝菌根真菌和牛粪的处理组中均能促进烟草生长，三个试验组中的平均植株干重是对照组的2.8—6.0倍，试验组C的平均植株干重是对照组的5.2倍，在污染水平下，试验组C促进烟草生长效果最显著；

从表4中得到，同一镉污染水平下，在接种菌剂处理组以及施加菌剂和牛粪混合物处理组中均能降低烟草植株部分的镉含量，试验组中接种菌剂的处理组中的植株部分镉含量是对照组的34—89%，试验组中施加菌剂和牛粪混合物处理组中的植株部分镉含量是对照组的40—78%。

表3烟草植株部分干重（克）

                 表4烟草植株部分的铅含量(mg/kg)

                 实施例三

利用丛枝菌根真菌和有机肥降低烟草铅、镉残留的方法，包括以下步骤：

步骤一、丛枝菌根真菌菌剂的配制

同实施例1中的步骤一；

步骤二、菌根化烟苗的培养

同实施例1中的步骤二；

步骤三、菌根化烟苗的移栽与管理

依据实施例1中步骤三的移栽方法，在风干的土壤中加入硝酸铅和硝酸镉，形成铅/镉污染水平分别为0/0、350/1、500/10、1000 /100mg/kg的四种不同污染程度的土壤，分别代表无污染、轻度污染、中度污染、重度污染，在不同的铅/镉污染水平下分别施加相应的硝酸钙，后依据实施例1中的步骤三的管理方法，得到移栽70天后烟草中的生物量、铅含量和镉含量；

结果显示：从表5中得到，在所有铅镉复合污染水平条件下，接种菌剂、施用牛粪以及施用菌剂和牛粪混合物均促进烟草生长，在每个试验组的平均植株干重分别是对照组的3.1、1.9和4.0倍；

从表6得到，在同一污染水平下，接种菌剂、施加牛粪以及施用菌剂和牛粪混合物均使烟草植株部分的铅含量降低，在试验组C中施加牛粪、接种菌剂和接种菌剂的同时施加牛粪的铅含量降低50%以上。

从表7得到，在同一污染水平下，施加牛粪、接种菌剂以及施用菌剂和牛粪混合物均使烟草植株部分的镉含量降低，对照组的降低镉残留效果高于其他三组；

表5烟草植株部分干重（克）

                  表6烟草根系干重（克）

                 表7烟草植株部分的铅含量(mg/kg)

                  在上述技术方案中所用的牛粪为腐熟的牛粪；

在上述技术方案中所用的低磷营养液的组成成分：每升低磷营养液中含有11.3 mg的KH₂PO₄、126.3 mg的KNO₃、295mg的Ca(NO₃)₂、123.3 mg的MgSO₄、0.715 mg的H₃BO₃、0.453 mg的MnCl₂·4H₂O、0.005 mg的H₂MoO₄·H₂O、0.055 mg的ZnSO₄·7H₂O和0.02 mg的CuSO₄·5H₂O，其中在低磷营养液中还加入由1.863 mg EDTA和1.393 mg FeSO₄·7H₂O构成的螯合态Fe-EDTA；

在上述技术方案中所用的烟草种子，为一般市售产品，本发明中所用的为烟草K326，购买于青岛中烟种子有限责任公司；

在上述技术方案中所用的丛枝菌根真菌菌种，为苏格兰球囊霉、蜜色无梗囊霉、摩西球囊霉或根内球囊霉中的任意一种，均能在市场上买到。

由以上实施例可以看出，无论是在铅污染、镉污染还是铅镉复合污染土壤中，接种丛枝菌根真菌菌剂和施加牛粪均能够促进烟草生长、降低铅镉残留。即使在未污染的土壤中，接种丛枝菌根真菌菌剂和施加牛粪也能显著促进烟草生长，表明无论土壤中是否存在重金属污染，本发明中的丛枝菌根真菌菌剂和牛粪均能应用于烟草的种植过程中。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。