一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用

摘要

本发明公开了一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用。该酵母培养物按照包括如下步骤的方法制备：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去所述发酵液中的所述酿酒酵母细胞得到的无菌液体即为所述酵母培养物。使用本发明所提供的酵母培养物对反刍动物瘤胃液、乳酸利用菌和纤维素分解菌分别进行体外培养，可使反刍动物瘤胃液中氨态氮浓度和挥发性脂肪酸含量分别提高38.3-65.58％和29.8-39.4％，并显著促进乳酸利用菌和纤维素利用菌的增殖。本发明对提高反刍动物生产力水平、优化饲料的营养价值具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用。

背景技术

随着饲用抗生素的普及甚至滥用，其所带来的耐药性、药物残留等负面效应日益 突出。欧盟自2006年起全面禁止抗生素作为饲料添加剂；美国近年来几乎冻结了所有 新型抗生素的审批；我国政府也先后颁布了一系列饲料药物添加剂使用规范。饲用抗 生素的淡出是畜牧业发展的必然趋势，而开发利用可选择性促进肠道有益菌增殖、改 善肠道内环境、提高动物机体免疫力，同时不为肠道内酶所分解、不产生耐药性、无 残留的新型绿色饲料添加剂是畜牧业可持续发展的必然趋势，酵母培养物就是其中一 种。

酵母培养物(Yeast culture，YC)是指由酵母菌在特定工艺条件下经充分发酵后 所形成的微生态制品，主要包括酵母细胞代谢产物、经发酵后变异的培养基以及少量 已无活性的酵母细胞。酵母培养物的复杂成分主要包括酵母细胞内的营养物质和酵母 细胞的发酵代谢产物，有维生素、氨基酸、消化酶、有机酸、多糖以及未知的生长因 子等。作为集营养、保健于一体的新型饲料添加剂，酵母培养物通过调控瘤胃微生物 区系有效提高反刍动物对饲料的利用率，这也是近年来反刍动物学和营养学研究的热 点。

酵母培养物的质量受菌种、发酵生产工艺以及检测手段等因素的影响。酵母菌在 不同的培养环境下，如：不同的温度、湿度或酸碱环境尤其是底物成分，会产生不同 的发酵产物，而这其中又包含大量的未知生长因子。生产酵母培养物时所使用的培养 基和发酵工艺控制参数对其终端产品中代谢产物的组成、浓度及其生物利用率的稳定 性有着至关重要的影响。即便在使用相同酵母菌种的情况下，不同培养基组成或不同 的发酵生产控制工艺会导致酵母培养物产品中代谢产物组成和浓度出现明显的差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母培养物及其制备方法与改善瘤胃发酵中的应用。

本发明所提供的所述酵母培养物的制备方法，包括如下步骤：将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)进行液体发酵后，收集发酵液，除去 所述发酵液中的所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)细胞得 到的无菌液体即为所述酵母培养物。

在上述方法中，所述液体发酵在如下条件下进行：20-40℃、100-200转/分钟 振荡培养10-30小时后再静置培养10-60小时；该振荡培养是在有氧条件下进行的， 该静置培养是在厌氧条件下进行的。

在上述方法中，所述液体发酵所使用的发酵培养基的溶剂为水，溶质由如下1) -3)的物质组成：

1)碳源，所述碳源为如下A)-C)中的任一种：

A)葡萄糖、蔗糖和糖蜜；

B)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任两种；

C)葡萄糖、蔗糖和糖蜜中的任一种；

2)氮源，所述氮源为如下D)-F)中的任一种：

D)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵；

E)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任两种；

F)酵母膏、蛋白胨和硫酸铵中的任一种；

3)无机盐，所述无机盐为KH₂PO₄、MgSO₄、MnSO₄、CaCl₂、GuSO₄、ZnSO₄和FeSO₄；

所述碳源在所述发酵培养基中的总浓度为30-300g/L；所述碳源具体可由10g/L -100g/L葡萄糖、10g/L-100g/L蔗糖和10g/L-100g/L糖蜜组成；

所述氮源在所述发酵培养基中的总浓度为25-640g/L；所述氮源具体可由10g/L -300g/L酵母膏、10g/L-300g/L蛋白胨和5g/L-40g/L硫酸铵组成；

所述无机盐中的各组分在所述发酵培养基中的浓度分别为：KH₂PO₄0.1g/L- 10.0g/L、MgSO₄0.0488g/L-4.88g/L、MnSO₄0.089g/L-3.56g/L、FeSO₄0.068g/L- 2.714g/L、CaCl₂0.1g/L-4.0g/L、CuSO₄0.0639g/L-2.556g/L、ZnSO₄0.0561g/L- 2.244g/L；

所述发酵培养基的pH值为4.0-6.5。

在上述方法中，所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行：将所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)接种于种子培养基中，20-40℃、100 -200转/分钟振荡培养18-40小时，获得种子液；再将所述种子液按照(1-30)∶100 的体积比接种于所述发酵培养基中进行所述液体发酵。所述种子液中所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)的浓度为10⁶-10⁸cfu/L。

在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质为葡萄糖、酵母粉、蛋白胨和 MnSO₄，在所述种子培养基中各溶质的浓度分别为：葡萄糖10g/L-40g/L、酵母粉 5.0g/L-40g/L、蛋白胨5.0g/L-40g/L、MnSO₄0.089g/L-3.56g/L。

由上述方法制备得到的酵母培养物属于本发明保护的范围。

本发明所提供的所述酵母培养物可用于制备动物饲料添加剂。所述动物具体可为 反刍动物。

所述动物饲料添加剂具体可为改善反刍动物瘤胃发酵的制剂。

所述改善反刍动物瘤胃发酵体现为增加所述反刍动物瘤胃液中氨态氮的含量，和 /或增加所述反刍动物瘤胃液中挥发性脂肪酸浓度。

所述挥发性脂肪酸具体可为乙酸、丙酸和丁酸。

使用本发明所提供的发酵工艺得到的酵母培养物对反刍动物瘤胃液、乳酸利用菌 和纤维素分解菌分别进行体外培养，可使反刍动物瘤胃液中氨态氮浓度和挥发性脂肪 酸含量分别提高38.3-65.58％和29.8-39.4％，可使乳酸利用菌反刍兽月形单胞菌和埃 氏巨型球菌的生物量分别提高2.6-3.5倍和2.4-3.8倍，可使纤维素利用菌产琥珀 酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌的生物量分别提高75.6％-80.9％、69.89％- 82.75％和64.78％-76.76％。本发明对提高反刍动物生产力水平、优化饲料的营养价值 具有重要意义。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例所用的培养基、菌株的详细信息如下：

CDC培养基：青岛海博生物技术有限公司。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：CGMCC编号为2.1882。

产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp.succinogenes(Hungate))： ATCC编号为19169。

牛黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens Sijpesteijn)：ATCC编号为19208。

白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus Hungate)：ATCC编号为27210。

反刍兽月形单胞菌(Selenomonas ruminantium subsp.ruminantium Bryant)： ATCC编号为12561。

埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii(Gutierrez et al.)Rogosa)：ATCC编 号为17752。

实施例1、酵母培养物及其制备方法与应用

一、酵母培养物的制备

1、培养基的配制

液体种子培养基：称取10g葡萄糖、5g酵母粉、5g蛋白胨和0.1g MnSO₄·H₂O， 用1L蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

液体发酵培养基：称取10g葡萄糖，10g蔗糖，10g糖蜜，10g蛋白胨，10g酵母 膏，5g硫酸铵，0.1g KH₂PO₄，0.1g MgSO₄·7H₂O，0.1g MnSO₄·H₂O，0.1g CaCl₂，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.1g ZnSO₄·7H₂O和0.1g FeSO₄·4H₂O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L HCl 溶液调节pH值至4.0，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

2、种子液的获得

将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代 后接入上述液体种子培养基中，20℃、100转/分钟振摇培养18h，获得种子液，经检 测，该种子液经15倍稀释后的OD₆₀₀值为0.491，酿酒酵母的活细胞数为1.1×10⁹cfu/L。

3、发酵液的获得

将步骤2获得的种子液按1∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，20℃、100 转/分钟条件下发酵培养10h后转入20℃恒温箱中静置培养10h，获得发酵液。

4、酵母培养物的获得

将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清 液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌 酵母培养物。

二、利用酵母培养物对瘤胃液的体外批次培养

反刍动物瘤胃液中氨态氮浓度是反映其瘤胃代谢和微生态环境状况的重要指标之 一，利用这一指标对反刍动物进行氮的营养检测是现代动物营养学中采用的重要手段 之一。瘤胃挥发性脂肪酸是指碳水化合物在瘤胃微生物的作用下最后分解为短链脂肪 酸(VFA)包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、2-甲基丁酸、戊酸、异戊酸等，其 中，乙酸、丙酸、丁酸占90％以上，其他占不到10％，因此，平时挥发性脂肪酸是指乙 酸、丙酸、丁酸。本实验中所检测的挥发性脂肪酸即为乙酸、丙酸和丁酸。反刍动物 60％的消化能是由VFA提供的，因此，VFA是反刍动物重要的能量来源。

本实验利用步骤一得到的酵母培养物对瘤胃液进行体外批次培养的培养液进行氨 态氮浓度和挥发性脂肪酸测定。

1、瘤胃液的体外批次培养

从相同且正常条件下饲养的年龄相同、平均体重550kg左右、泌乳期相同的奶牛(平 均泌乳期64d)中随机取4头安装有永久性三位点瘘管的健康荷斯坦奶牛，晨饲(8:00) 前1h时，用硬质PVC管分别从每头奶牛瘤胃上下左右不同位点采集瘤胃液，分别装入 提前预热已达39℃并通有CO₂的保温瓶中，装满后立即盖严瓶口，迅速返回试验室。

将上述每头奶牛的瘤胃液分2组每组设3个重复，各组的培养方法如下：

处理组：用四层纱布过滤瘤胃液(期间温度保持在39±1℃，且尽量少与空气接触)， 持续通入约5min CO₂气体后，迅速分装至如上已提前预热并通有CO₂的保温瓶中，每 保温瓶中瘤胃液为20ml，再加入40ml缓冲液、0.5ml步骤一得到的酵母培养物、0.15g 精料(型号B211，长春博瑞饲料有限公司)和0.15g羊草后于39℃条件下培养24小 时得到培养液。

对照组：用四层纱布过滤瘤胃液(期间温度保持在39±1℃，且尽量少与空气接触)， 持续通入约5min CO₂气体后，迅速分装至如上已提前预热并通有CO₂的保温瓶中，每 保温瓶中瘤胃液为20ml，再加入40ml缓冲液、0.15g精料(型号B211，长春博瑞饲 料有限公司)和0.15g羊草后于39℃条件下培养24小时得到培养液。

上述缓冲液的配制方法如下：

于培养前1h准确量取988ml A液，10ml B液，2ml C液，充分混合，通CO₂至无色后将其分装于培养瓶内(每个培养瓶加40ml)，持续通入10min CO₂，盖上装有 塑料三通的橡皮塞，置于恒温水浴中预热至39℃待用。

上述A液、B液和C液的配制方法如下：

A液：称取382.5mg k₂HPO₄，292mg KH₂PO₄，480mg(NH₄)₂SO₄，200mg NaCl，100mg MgSO₄·7H₂O和4000mg Na₂CO₃，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。在使用前一天配制待 用。

B液：称取50mg EDTA，200mg FeSO₄·7H₂O，200mg MnCl₂·4H₂O，10mg ZnSO₄·7H₂O， 30mg H₃BO₃，20mg CoCl₂·6H₂O，1mg CuCl₂·2H₂O，2mg NiCl₂·6H₂O和3mg NaMoO₄，用 蒸馏水溶解后定容至1000ml，持续通入18小时CO₂后，盖严瓶口，置于4℃冰箱备用。

C液：称取25g Na₂S·9H₂O置于100ml容量瓶中加80ml蒸馏水溶解后定容至100ml， 持续通入20min CO₂后，盖好瓶口，置于4℃冰箱备用。

2、氨态氮浓度的测定

采用亚硝基铁氰化钠比色法测定，步骤如下：

1)氨氮标准系列溶液的配制

①准确称量0.382g氯化铵，用0.2mol/L盐酸溶液溶解并定容到100ml，作为保存 液，于4℃冰箱保存。

②取步骤①的保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，作为工作液，其含氮量 为10mg/100ml。

③一次量取步骤②的工作液0、1、2、4、6ml分别置于5个编号的50ml容量瓶内， 接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、4ml，再用0.2mol/L盐酸溶液定容，得到每100ml 溶液中含氮量分别为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。

2)准确量取上述氨氮标准系列各溶液0.4ml于10ml试管中，再依次加入2ml A 液和2ml B液，摇匀后静置10min，用TU-1901紫外可见分光光度计比色，波长700 nm，用不含氮的标准溶液作空白对照。记录各系列标准溶液的消光值。

3)用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程：回归方程为 y＝0.9062-0.0084，R²为0.9998。

4)样品处理：取步骤1得到的培养液10ml在3500-4000转/分钟下，离心10 min，量取2ml上清液(若氨氮含量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水)，置于 15ml试管内，再加入8ml 0.2mol/L盐酸至10ml摇匀(稀释倍数为5或10)。比 色操作同步骤2)。把各样品测得的消光值代入步骤3)的回归方程中，算得的结果乘 以样品的稀释倍数就是原样中氨态氮的浓度。将组内的各样品取平均值，结果如表1 所示。

3、挥发性脂肪酸(VFA)的测定

1)标准液的配制

VFA标准溶液(混标)：用移液枪取344μL乙酸，373μL丙酸和184μL正丁酸，置于 100mL容量瓶中，用超纯水定容，即60mmol/L(3.60g/L)乙酸，50mmol/L(3.72g/L) 丙酸和20mmol/L(1.76g/L)正丁酸混合标准溶液。乙酸(色谱纯，ρ＝1.049，广州自力 色谱公司)，丙酸(色谱纯，ρ＝0.993，广州自力色谱公司)，正丁酸(色谱纯，ρ＝0.959，同 上)，偏磷酸(分析纯)，实验用水全部为超纯水(18.2M Ω·cm)。

2)样品的预处理

取步骤1得到的培养液1.5ml于10000转/分钟，10min离心后，取1ml上清液， 加25％偏磷酸溶液0.2ml，用涡漩振荡器混合均匀，以10000转/分钟离心10-15min， 得到上清液，用于检测。

3)气相色谱条件

采用Agilent Technologies 7890A气相色谱仪进行测定；色谱柱：Nukol毛细管 柱(30m×0.32mm×0.25μm)；进样口220℃；检测器250℃；柱温升温程序：初始温 度60℃，然后以20℃/min升温速率升至190℃，保持3min，进样口压力：100kPa； SPL分流比：20∶1；气体流速：载气氮气N₂75ml/min；氢气H₂70ml/min；空气50 ml/min；进样量：1μL。

4)上样检测及定量分析

色谱柱的选择：实验比较了非极性色谱柱DB-1柱和极性色谱柱Nukol柱对挥发性 脂肪酸分离效果的影响。结果表明，用非极性柱DB-1柱对标准溶液中的乙酸、丙酸、 丁酸进行分析，各组分不易分开，峰重叠现象严重，分离效果不理想。而用Nukol极性柱 进行分析，各组分实现完全分离，且峰形良好。这可能是由于乙酸、丙酸、丁酸本身为 强极性物质，符合相似相溶原理，因此实验选强极性的Nukol柱用于实际样品分析。

柱温的选择：柱温通常有两种方式，一种为恒温分析，另一种为程序升温。本实验 采用Nukol毛细柱，分别比较了恒温分析和多种程序升温条件对分离效果的影响。结果 表明：程序升温分析在分离效果和灵敏度两方面都明显优于恒温分析；采用柱温升温 程序：初始温度60℃，然后以20℃/min速率升温至190℃，保持3min，可实现对VFA 的良好分离。

标准曲线：将混合标准溶液稀释制备一系列不同浓度的标准溶液，分别取1mL混合 标准溶液置于1.5mL离心管中，加入0.200mL 25％偏磷酸溶液，用涡漩振荡器混合均 匀，以10000转/分钟离心15min，用微量注射器取上清液1μL，注入气相色谱仪中， 进行分析，记录峰面积，以峰面积y对浓度x作标准曲线。结果表明，乙酸、丙酸、丁酸 峰面积与其浓度呈良好线性关系，回归方程分别为 y＝338.96x+84.185，y＝832.3x+464.32，y＝1556.6x+645.94，线性相关系数R²分别为 0.9998、0.9993、0.9968。按照相同的方法检测步骤2)经过预处理的样品，将得到 的乙酸、丙酸和丁酸峰面积数值分别代入上述三个回归方程，得出各样品中乙酸、丙 酸和丁酸的浓度，计算总浓度，组内样品取平均值，结果如表1所示。

4、表1结果表明：与对照组相比，处理组培养液的氨态氮浓度提高45.1％，挥发 性脂肪酸含量提高31.6％。

表1.氨态氮和挥发性脂肪酸含量测定结果

  氨态氮(mg/100ml)   挥发性脂肪酸(mmol/L)   对照组   10.14±0.03   45.78±0.02   处理组   14.71±0.05   60.25±0.06

三、利用酵母培养物对乳酸利用菌进行增殖培养

将冻干保藏的两种乳酸利用菌反刍兽月形单胞菌和埃氏巨型球菌分别进行如下步 骤1-4的实验：

1、活化后分别接入CDC培养基，20℃严格厌氧培养20h，获得菌悬液；

2、制备如下培养基：乳酸钠15ml、硫酸铵0.6g、NaCl 0.5g、KH₂PO₄0.1g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.2g/L、CaCl₂ 2g/L、CuSO₄·5H₂O 2g/L、ZnSO₄·7H₂O 1g/L、FeSO₄·4H₂O 0.3g/L，pH值为4.5。

3、设置如下两组处理，每种处理3次重复：

处理1(实验组)：取5ml步骤2制备的培养基、0.025ml步骤一制备的酵母培养 物和0.005ml的乳酸利用菌菌悬液(约1×10⁷cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后 密封，37℃恒温培养24h，得到乳酸利用菌培养液。

处理2(对照组)：取5ml步骤2制备的培养基、0.025ml无菌水和0.005ml的乳 酸利用菌菌悬液(约1×10⁷cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后密封，37℃恒温培养 24h，得到乳酸利用菌培养液。

4、培养液中乳酸利用菌的生物量测定

以乳酸利用菌培养基(即步骤2制备的培养基)为调零空白对照，将步骤3培养 的乳酸利用菌培养液直接用TU-1901紫外可见分光光度计测定其在600nm波长条件下 的吸光值即OD₆₀₀值，结果如表2所示。

表2.培养液中乳酸利用菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   反刍兽月单胞菌   1.992±0.01   0.498±0.02   埃氏巨型球菌   1.843±0.03   0.483±0.03

与对照组相比，实验组获得的培养液中反刍兽月形单胞菌生物量提高3.0倍，埃 氏巨型球菌生物量提高2.82倍。

四、利用酵母培养物对纤维素分解菌进行增殖培养

将冻干保藏的三种纤维素分解菌产琥珀酸拟杆菌、牛黄瘤胃球菌和白色瘤胃球菌 分别进行如下步骤1-4的实验：

1、活化后分别接入CDC培养基，30℃严格厌氧培养30h，获得菌悬液；

2、制备如下培养基：羧甲基纤维素钠25ml、硫酸铵10g、NaCl 10g、KH₂PO₄5.0g、 MgSO₄·7H₂O 5.0g/L、MnSO₄·H₂O 2.0g/L、CaCl₂ 2.0g/L、CuSO₄·5H₂O 2.0g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.0g/L和FeSO₄·4H₂O 2.0g/L，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L HCl调节pH值至5.0，， 定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

3、设置如下两组处理，每种处理3次重复：

处理1(实验组)：取5.0ml步骤2制备的培养基、0.5ml步骤一制备的酵母培养 物和0.5ml的纤维素分解菌菌悬液(约1×10⁷cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后 密封，37℃恒温培养24h，得到纤维素分解菌培养液。

处理2(对照组)：取5.0ml步骤2制备的培养基、0.5ml无菌水和0.5ml的纤维 素分解菌菌悬液(约1×10⁷cfu/ml)在10ml无菌离心管中混合后密封，37℃恒温培养 24h，得到纤维素分解菌培养液。

4、培养液中纤维素分解菌的生物量测定

以纤维分解菌培养基(即步骤2制备的培养基)为调零空白对照，将步骤3培养的 纤维素分解菌培养液直接用TU-1901紫外可见分光光度计测定其在600nm波长条件下 的吸光值即OD₆₀₀值，结果如表3所示。

表3.培养液中纤维素分解菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   产琥珀酸拟杆菌   0.975±0.02   0.539±0.01   牛黄瘤胃球菌   0.943±0.03   0.516±0.02   白色瘤胃球菌   0.903±0.03   0.548±0.02

与对照组相比，实验组获得的培养液中产琥珀酸拟杆菌生物量提高80.9％，牛黄 瘤胃球菌生物量提高82.75％，白色瘤胃球菌生物量提高64.78％。

实施例2、酵母培养物及其制备方法与应用

一、酵母培养物的制备

1、培养基的配制

液体种子培养基：称取40g葡萄糖、40g酵母粉、40g蛋白胨和4.0g MnSO₄·H₂O， 用1L蒸馏水加热溶解后，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

液体发酵培养基：100g葡萄糖，100g蔗糖，100g糖蜜，300g蛋白胨，300g酵母 膏，40g硫酸铵，10g KH₂PO₄，10g MgSO₄·7H₂O，4.0g MnSO₄·H₂O，4.0g CaCl₂，4.0g CuSO₄·5H₂O，4.0g ZnSO₄·7H₂O和4.0g FeSO₄·4H₂O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L NaOH 溶液调节pH值至6.5，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

2、种子液的获得

将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代 后接入上述液体种子培养基中，40℃、200转/分钟振摇培养40h，获得种子液，经检 测，该种子液经10倍稀释后的OD₆₀₀值为0.591，酿酒酵母的活细胞数为8.9×10⁸cfu/L。

3、发酵液的获得

将步骤2获得的种子液按30∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，40℃、200 转/分钟条件下发酵培养30h后转入40℃恒温箱中静置培养60h，获得发酵液。

4、酵母培养物的获得

将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清 液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌 酵母培养物。

二、利用酵母培养物对瘤胃液的体外批次培养

方法同实施例1中的步骤二，结果如表4所示。

表4结果表明：与对照组相比，处理组培养液的氨态氮浓度提高38.3％，挥发性 脂肪酸含量提高29.8％。

表4.氨态氮和挥发性脂肪酸含量测定结果

  氨态氮(mg/100ml)   挥发性脂肪酸(mmol/L)   对照组   11.23±0.06   46.87±0.01   处理组   15.53±0.03   60.83±0.05

三、利用酵母培养物对乳酸利用菌进行增殖培养

方法同实施例1中的步骤三，结果如表5所示。

表5.培养液中乳酸利用菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   反刍兽月单胞菌   1.724±0.04   0.479±0.01   埃氏巨型球菌   1.581±0.03   0.462±0.02

与对照组相比，实验组获得的培养液中反刍兽月形单胞菌生物量提高2.6倍，埃 氏巨型球菌生物量提高2.4倍。

四、利用酵母培养物对纤维素分解菌进行增殖培养

方法同实施例1中的步骤四，结果如表6所示。

表6.培养液中纤维素分解菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   产琥珀酸拟杆菌   0.962±0.02   0.548±0.04   牛黄瘤胃球菌   0.890±0.02   0.524±0.03   白色瘤胃球菌   0.867±0.03   0.498±0.03

与对照组相比，实验组获得的培养液中产琥珀酸拟杆菌生物量提高75.6％，牛黄 瘤胃球菌生物量提高69.85％，白色瘤胃球菌生物量提高74.10％。

实施例3、酵母培养物及其制备方法与应用

一、酵母培养物的制备

1、培养基的配制

液体种子培养基：20g葡萄糖、20g酵母粉、20g蛋白胨和2.0g MnSO₄·H₂O。

液体发酵培养基：50g葡萄糖，50g蔗糖，50g糖蜜，50g蛋白胨，50g酵母膏， 20g硫酸铵，5.0g KH₂PO₄，5.0g MgSO₄·7H₂O，2.0g MnSO₄·H₂O，2.0g CaCl₂，2.0g CuSO₄·5H₂O，2.0g ZnSO₄·7H₂O和2.0g FeSO₄·4H₂O，蒸馏水溶解后，用0.1mol/L NaOH 溶液调节pH值至5.5，定容至1L，121℃、0.1Mpa高温灭菌15min，备用。

2、种子液的获得

将冻干保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No.2.1882)活化三代 后接入上述液体种子培养基中，30℃、150转/分钟振摇培养20h，获得种子液，经检 测，该种子液经13倍稀释后的OD₆₀₀值为0.572，酿酒酵母的活细胞数为1.1×10⁹cfu/L。

3、发酵液的获得

将步骤2获得的种子液按15∶100的体积比接种于液体发酵培养基中，30℃、150 转/分钟条件下发酵培养24h后转入30℃恒温箱中静置培养40h，获得发酵液。

4、酵母培养物的获得

将步骤3获得的发酵液于4000转/分钟条件下离心5min除去菌体，将获得的上清 液用细菌过滤器(0.22μm)过滤，经平板检验无菌长出，得到的无细胞滤液即为无菌 酵母培养物。

二、利用酵母培养物对瘤胃液的体外批次培养

方法同实施例1中的步骤二，结果如表7所示。

表7结果表明：与对照组相比，处理组培养液的氨态氮浓度提高65.58％，挥发性 脂肪酸含量提高39.4％。

表7.氨态氮和挥发性脂肪酸含量测定结果

  氨态氮(mg/100ml)   挥发性脂肪酸(mmol/L)   对照组   10.17±0.03   45.12±0.04   处理组   16.58±0.01   62.89±0.07

三、利用酵母培养物对乳酸利用菌进行增殖培养

方法同实施例1中的步骤三，结果如表8所示。

表8.培养液中乳酸利用菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   反刍兽月单胞菌   2.210±0.04   0.491±0.03   埃氏巨型球菌   2.455±0.05   0.512±0.02

与对照组相比，实验组获得的培养液中反刍兽月形单胞菌生物量提高3.5倍，埃 氏巨型球菌生物量提高3.8倍。

四、利用酵母培养物对纤维素分解菌进行增殖培养

方法同实施例1中的步骤四，结果如表9所示。

表9.培养液中纤维素分解菌生物量的测定结果

  实验组的OD₆₀₀结果   对照组的OD₆₀₀结果   产琥珀酸拟杆菌   0.989±0.03   0.551±0.02   牛黄瘤胃球菌   0.913±0.02   0.532±0.02   白色瘤胃球菌   0.905±0.02   0.512±0.03

与对照组相比，产琥珀酸拟杆菌提高79.49％，牛黄瘤胃球菌提高71.62％，白色 瘤胃球菌提高76.76％。