液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂的制备工艺及专用设备

摘要

本发明公开液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂制备工艺及设备。该制备工艺包括如下步骤：将乳酸菌发酵液离心收集菌体，重悬至软水中洗涤，之后再离心收集；将收集的菌体重悬至含有冻干保护剂和物质X的水溶液中；将得到的菌体溶液以液滴形式喷淋至液氮中造粒即可。该设备包括一顶部设有一液体喷淋装置的密封腔体；在所述密封腔体内设有一颗粒导流槽和一传输带，所述颗粒导流槽包括一第一端部和一第二端部，第一端部位于液体喷淋装置的下方；传输带位于第二端部的下方，用于将第二端部传来的颗粒输出；液氮深冷造粒设备还包括一液氮输送装置，用于将液氮输送至所述颗粒导流槽的第一端部。获得的发酵剂菌种活力高，活菌数高，活力恢复时间短。

说明书

技术领域

本发明涉及液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂的制备工艺及专用设备。

背景技术

我国乳酸菌发酵食品市场发展迅猛，目前产业规模已经超过200亿元人 民币，产量突破160万吨，发酵乳制品产销量年增长速度更是超过25％。直 投式发酵剂(DVS)以其高浓度、高活力以及稳定的产香性、产粘性及产酸 性等生产性能而备受发酵乳制品生厂商的青睐。然而，即便是常规酸乳直投 式发酵剂(包含保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜热链球菌 (Streptococcus thermophilus)，也几乎完全被国外企业所垄断，如丹麦的丹 尼斯克公司、科汉森公司、荷兰的DSM公司等。

现有技术中，发酵剂领域以及乳酸菌发酵食品领域的最新研究热点是具 有特定功能的新型益生菌发酵剂和发酵食品。国内对自主知识产权菌株的选 育工作起步于上世纪八、九十年代，由我国科研机构筛选并研究比较透彻的 知名菌株有光明乳业股份有限公司的具降高血压功能的干酪乳杆菌 Lactobacillus casei LC2W(EP 1642963B1)、降血脂功能的干酪乳杆菌 Lactobacillus casei BD-II(US 7270994)、降血清胆固醇功能的植物乳杆菌 Lactobacillusplantarum ST-III(CN200410066891.7，CN03116377.7)、内蒙 古农业大学的干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang等。尽管上述菌种目前均 处于研究和小规模产业化阶段，距离大规模的产业化应用尚需进行的工业化 制备工艺研究和应用推广，但是为我国具有自主知识产权的、适合中国人群 生理特性乳酸菌产品的产业化提供了极大的发展基础。

根据乳酸菌发酵剂的形态及生产方法，可将发酵剂分为：液体发酵剂、 真空冷冻干燥发酵剂两种类型。

(1)液体发酵剂即传代型发酵剂，生产方式一般需要经过菌种活化、 母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂等工艺过程。主要弊端是：活菌含量低 (10⁷～10⁸cfu/g)，接种量大(2～3％)保藏期短(4℃，1～2d)；并且还存 在生产工序多、周期长；在发酵剂制备过程中，菌种经过多级扩大培养和繁 衍，批次间质量不够稳定，极易退化和污染。该种发酵剂在发酵食品行业基 本属于淘汰类型。

(2)真空冷冻干燥发酵剂，系乳酸菌经液体增殖培养，浓缩分离，之 后与保护剂混溶，再经真空冷冻干燥工艺制备的乳酸菌冻干菌粉。具有活菌 含量高、易保存管理、更强的稳定性和乳酸菌活力的特点，可直投式使用， 是当今发酵剂的主要产品形式。但是，由于在冻干过程中产生损伤，且能耗 较大等因素，冻干菌粉菌株存在复活时间较长和成本较高的弊端。

其中，冷冻浓缩发酵剂制备过程中涉及的菌体浓缩技术是制备高活力乳 酸菌发酵剂极其关键的中间工艺环节，其目的不仅要将菌体与培养液分离， 而且要求在保持菌体活性的前提下，获得较高的浓缩倍数和菌体收得率。目 前，用于浓缩菌体的方法主要是离心分离法，根据所采用的离心机工作原理 的差异分为固体保留式和自清式。固体保留式离心方式的菌体损失率一般在 10％以上，由于菌体经受离心剪切作用时间较长，造成菌体的死亡率较高； 自清式离心方式，浓缩菌体以固体时间间隔排出离心机外，遭受的离心剪切 力较小，但是菌体的浓缩倍率不高，一般在10～30倍之间。现有直投式酸奶 发酵剂的现状各种问题亟待解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中真空冷冻干燥发酵 剂制备过程中离心收集菌体损失率和死亡率较高，真空冷冻干燥过程中能耗 高、制备时间长，菌株损伤较为严重和复活时间长等的缺陷，而提供了一种 菌种活力高，活菌数高，活力恢复时间短的液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵 剂的制备工艺及专用设备。

本发明提供一种乳酸菌直投式发酵剂的制备工艺包括如下步骤：

(1)将乳酸菌发酵液离心收集菌体，将收集的菌体重悬至软水中洗涤， 之后再离心收集菌体；其中，所述的离心的条件为1000g～5000g，10min～ 30min；

(2)将步骤(1)收集的菌体重悬至含有冻干保护剂和物质X的水溶液 中，所述的物质X为脱脂乳或乳清蛋白；

(3)将步骤(2)重悬得到的菌体溶液以液滴形式喷淋至液氮中造粒， 之后收集固体颗粒产品，即可。

下面，进一步本发明乳酸菌直投式发酵剂的制备工艺进行详细介绍：

(1)将乳酸菌发酵液离心收集菌体，将收集的菌体重悬至软水中洗涤， 之后再离心收集菌体；其中，所述的离心的条件为1000g～5000g，10min～ 30min。

本发明中，所述的乳酸菌的菌株可为本领域常规使用的菌株，较佳的为 嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、保加利亚乳杆菌Lactobacillus  bulgaricus、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、干酪乳杆菌Lactobacillus  casei或植物乳杆菌Lactobacillus plantarum；更佳的为干酪乳杆菌 Lactobacillus casei LC2W菌株(CGMCC No.0828)、干酪乳杆菌Lactobacillus  casei BD-II菌株(CGMCC No.0825)或者植物乳杆菌Lactobacillus plantarum  ST-III菌株(CGMCC No.0847)。

本发明中，所述的乳酸菌发酵液为本领域常规使用制备冷冻浓缩发酵剂 使用的乳酸菌发酵液，一般由乳酸菌菌株经过2～3次扩培获得。

本发明中，所述的扩培为本领域常规操作，一般在发酵罐中，在按常规 灭菌的乳酸菌培养基或脱脂乳中进行充氮厌氧培养，条件较佳的为：菌株接 种量为1％～5％，发酵温度30℃～45℃，发酵时间6h～24h；更佳的为：接 种量为2％～3％，发酵温度32℃～44℃，发酵时间8h～16h。

其中，所述的乳酸菌培养基的种类、含量具体使用和pH值，本领域技 术人员均知道根据使用的乳酸菌菌种而相应调整，如嗜热链球菌 Streptococcus thermophilus使用M17培养基pH恒定在6.5、保加利亚乳杆菌 Lactobacillus bulgaricus、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、干酪乳杆菌 Lactobacillus casei或植物乳杆菌Lactobacillus plantarum均使用MRS培养基 等等。

本发明中，所述的离心的设备为本领域常规使用，较佳的为固体保留式 离心机或自清式离心机，更佳的为采用自清式离心机。

本发明中，所述的离心的条件较佳的为1500g～5000离心10min～ 20min，更佳的为2000g～3500g离心10min～15min。

本发明中，所述的软水为本领域常规所说的软水，较佳的为：有机物含 量＜8mg/kg，污染物指数＜3，二氧化硅＜5mg/kg，铁＜0.5mg/kg，锰＜ 0.5mg/kg。所述的洗涤的次数为本领域常规操作，较佳的为1～3次，更佳 的为1～2次。所述的软水中洗涤的软水体积为本领域常规，较佳的为乳酸 菌发酵液体积的1/10～1/40。

(2)将步骤(1)收集的菌体重悬至含有冻干保护剂和物质X的水溶液 中，所述的物质X为脱脂乳或乳清蛋白。

本发明中，所述的冻干保护剂为本领域常规的乳酸菌常规保护剂，较佳 的为乳糖、蔗糖和海藻糖的一种或多种。所述的冻干保护剂的含量按本领域 常规使用，较佳的为0～8％，百分比为冻干保护剂占含有冻干保护剂和物质 X的水溶液总量的质量百分比。

本发明中，所述的脱脂乳为本领域常规使用的脱脂乳。所述的脱脂乳的 含量为本领域常规使用，较佳的为8％～16％，百分比为脱脂乳占含有冻干 保护剂和物质X的水溶液总量的质量百分比。

本发明中，所述的乳清蛋白为本领域常规使用的乳清蛋白。所述的乳清 蛋白的含量为本领域常规使用，较佳的为8％～16％，百分比为乳清蛋白占 含有冻干保护剂和物质X的水溶液总量的质量百分比。

本发明中，所述的乳酸菌培养基的种类具体使用，如前所述，本领域技 术人员均知道根据使用的乳酸菌菌种而相应调整。

(3)将步骤(2)重悬得到的菌体溶液以液滴形式喷淋至液氮中造粒， 之后收集固体颗粒产品，即可。

本发明中，所述的步骤(2)重悬得到的菌体中的菌体浓度较佳的为 1.2×10¹⁰cfu/mL～9.9×10¹²cfu/mL。

本发明中，所述的以液滴形式喷淋的液滴大小较佳的为1～10mm，更 佳的为1～6mm，进一步更佳的为3～6mm。所述的以液滴形式喷淋的流量 较佳的为1～25L/min。

本发明中，所述的液氮中造粒的温度一般为-196℃。

本发明中，所述的收集固体颗粒产品之后存储入库。所述的存储入库为 本领域常规，一般将液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂颗粒置于-40～-80℃ 的冷柜中储存即可。

本发明中，所述的以液滴形式喷淋至液氮中造粒的设备较佳的为液氮深 冷造粒设备；

所述液氮深冷造粒设备包括：一顶部设有一液体喷淋装置的密封腔体；

在所述密封腔体内设有一颗粒导流槽和一传输带，所述颗粒导流槽包括 一第一端部和一第二端部，其中所述第一端部位于所述液体喷淋装置的下 方；所述传输带位于所述第二端部的下方，用于将所述第二端部传来的颗粒 输出；

所述液氮深冷造粒设备还包括一液氮输送装置，用于将液氮输送至所述 颗粒导流槽的第一端部。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述密封腔体内还设有 一液氮回收装置，所述液氮回收装置与所述液氮输送装置连通。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述液氮回收装置包括 一设置在所述传输带下方的液氮回收导流槽，用于传输未气化的液氮；及一 设置在所述液氮回收导流槽下方的液氮缓存罐，用于储存未气化的液氮。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述液氮输送装置包括 一将液氮输送至所述颗粒导流槽的第一端部的液氮泵，且所述液氮缓存罐与 所述液氮泵连通。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述密封腔体设有真空 保温夹层，顶部还包括一出气管路。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述液体喷淋设备包括 多个喷嘴，所述喷嘴直径为1～10mm，喷嘴排列方式采用正三角形排列。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述颗粒导流槽长度为 500～10000mm，宽度W为100～1000mm，高度H为100～400mm，底板 倾角θ为1°～30°。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述液氮回收导流槽长 度为500～10000mm，宽度W’为100～1000mm，高度H’为100～400mm， 底板倾角θ’为1°～30°。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述传输带采用稳定工 作温度范围为-196℃～380℃的食品级铁氟龙输送带。

本发明中，所述的液氮深冷造粒设备，较佳地，所述传输带的输出端还 与一颗粒包装机匹配。

本发明还提供如前所述的液氮深冷造粒设备。

本发明所用试剂和原料除特殊说明外均市售可得。

在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征的优选条件可 以任意组合得到本发明较佳实例。

本发明的积极进步效果在于：本发明的液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵 剂的制备工艺可广泛用于发酵乳、蔬菜及饲料等行业，制备液氮深冷造粒乳 酸菌直投式发酵剂，具有制备工艺简单、能耗低、成本低等优势。本发明液 氮深冷造粒设备结构简单，生产率高。制得液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵 剂菌种活力高，存活率可达90％以上，远高于真空冷冻干燥制备的发酵剂 50％存活率，活菌数可达1.2×10¹⁰cfu/mL～9.9×10¹²cfu/mL，且发酵剂活力恢 复较真空冷冻干燥制备的发酵剂的活力恢复时间2.0h～2.5h短0.5h～1.0h。

附图说明

图1为本发明一个具体设备实施例中液氮深冷造粒设备的结构示意图。

图2为图1中液体喷淋设备的放大示意图。

图3为图2所示液体喷淋设备的仰视图。

图4为图1中颗粒导流槽的结构示意图。

图5为图1中液氮回收导流槽的结构示意图。

图6为本发明实施例1的液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂的制备工艺 流程示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。

下述实施例中，百分比均为质量百分比。

所用原料的来源和设备的名称规格为：

脱脂乳粉：新西兰恒天然集团；

乳酸菌培养基：德国Merck公司；

实施例中，未注明具体条件的实验方法，均按照常规操作条件，或按照 制造厂商所建议的操作条件。

设备实施例

图1是本发明液氮深冷造粒设备的一个实施例的结构示意图。

在该实施例中，液氮深冷造粒设备包括：顶部设有液体喷淋装置10的 密封腔体30。液体喷淋装置10的结构如图2和图3所示，喷淋口采用圆形 设计，根据产能设计其直径范围可以为50～500mm，可通过螺口、螺母对 接的方法实现其与管路连接，方便拆洗。喷淋口设置多个喷嘴12，根据所需 乳酸菌液氮深冷发酵剂颗粒的需求，喷嘴12直径可以为1～10mm。喷嘴排 列方式采用正三角形排列，比正方形排列更为紧凑，相同面积比正方形多排 10％左右。本领域的技术人员可以理解，喷淋口也可以根据要求采用方形或 其它形状的设计。

在密封腔体30内设有颗粒导流槽70和传输带40，颗粒导流槽70包括 第一端部和第二端部，其中所述第一端部位于液体喷淋装置10的下方；传 输带40位于所述第二端部的下方，用于将所述第二端部传来的颗粒输出。

其中，颗粒导流槽70与水平面形成倾角θ，在具体实施例中，颗粒导流 槽长度可以为500～10000mm，宽度可以为100～1000mm，高度可以为100～ 400mm，底板倾角θ可以为1°～30°(如图4所示)。在一个较佳实施例 中，传输带40采用稳定工作温度范围为-196℃～380℃的食品级铁氟龙输送 带，传输带40的输出端还与一颗粒包装机60匹配，颗粒50从传输带40落 入包装机60进行包装。

液氮深冷造粒设备还包括液氮输送装置80，用于将液氮输送至所述颗粒 导流槽的第一端部；液氮输送装置80包括将液氮输送至颗粒导流槽70的第 一端部的液氮泵81。其中，液氮输送装置80可外部连接液氮存储装置来提 供液氮源。

在一较佳实施例中，密封腔体30内还设有液氮回收装置90，液氮回收 装置90与所述液氮输送装置80连通。液氮回收装置90包括设置在传输带 40下方的液氮回收导流槽91，用于传输未气化的液氮；及设置在液氮回收 导流槽91下方的液氮缓存罐92，用于储存未气化的液氮。此时，液氮缓存 罐92与液氮泵81连通。在优选实施例中，液氮回收导流槽91的长度可以 为500～10000mm，宽度可以为100～1000mm，高度可以为100～400mm， 底板倾角η可以为1°～30°(如图5所示)。另外，传输带40靠近液氮回 收导流槽91的这一端可以略向下倾斜，便于未气化的液氮流向液氮回收导 流槽91。

在一个优选实施例中，密封腔体30设有真空保温夹层，顶部还包括一 出气管路20，出气管路20用于排出气体。

液氮深冷造粒设备具体使用时，将重悬得到的菌体溶液(浓缩菌悬液) 通过液体喷淋设备10迅速以液滴的形式喷入至装有一定倾角的颗粒导流槽 70中，在来自液氮输送装置80输送的液氮作用下瞬间实现乳酸菌的液氮深 冷造粒；乳酸菌深冷发酵剂颗粒在液氮流冲击和重力势能作用下，顺着颗粒 导流槽70滑落至传输带40上，由传输带40将成型的液氮深冷造粒乳酸菌 直投式发酵剂颗粒传送至颗粒包装机60中，进行定量分装；分装好的液氮 深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂颗粒，迅速放置于-40～-80℃的冷柜中储存。 其中，气化液氮通过密封腔体顶部的出气管路20直接排入室外，避免因室 内氮气浓度过高所造成的人身伤害。

实施例1液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂(嗜热链球菌)

本实施例的液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂的制备工艺流程示意图 如图6所示，使用设备实施例公开的设备。

制备方法包括下列步骤：

(1)按厂商所建议的培养条件，将实验室培养好得到的含有嗜热链球 菌(Streptococcus thermophilus)菌株(来源于丹尼斯克商业化菌株)的M17 培养基，按3％的接种量接种于8L含有12％脱脂乳粉的水溶液体系中，进行 第1次扩培，培养温度45℃，培养时间8h；再按2％的接种于392L含有12％ 脱脂乳粉的水溶液体系中，进行第2次扩培，培养温度44℃，培养时间16h， pH恒定在6.5；扩培好的发酵液按2％的接种量接入19600L含有12％脱脂乳 粉的灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度44℃，培养时间16h，pH 恒定在6.5。培养过程中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵；

(2)将步骤(1)的液体采用自清式离心机，进行2000g，10min的离 心菌体收集，得到的菌体重悬至500L的软水中并洗涤1次；其中，软水指 标为：有机物含量＜8mg/kg，污染物指数＜3，二氧化硅＜5mg/kg，铁＜ 0.5mg/kg，锰＜0.5mg/kg；

(3)将步骤(2)的液体采用自清式离心机，进行3500g，15min的离 心，收集菌体；

(4)将步骤(3)的菌体重悬至100L的含有8％脱脂奶粉和8％蔗糖的 灭菌脱脂乳水溶液中，搅拌均匀；

(5)将步骤(4)重悬得到的菌体溶液(浓缩菌悬液)以液滴喷淋的方 式喷入-196℃液氮中，液滴大小为3mm，流量为1L/min；

(6)收集发酵剂固体颗粒，采用灭菌铝箔袋包装后，迅速放置于-40～ -80℃的冷柜中储存。

实施例2液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂(保加利亚乳杆菌)

本实施例使用设备实施例公开的设备。

制备方法包括下列步骤：

(1)按厂商所建议的培养条件，将实验室培养好得到的含有保加利亚 乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)菌株(来源于丹尼斯克商业化菌株)的 MRS培养基，按5％的接种量接种于5L含有12％脱脂乳粉的水溶液体系中， 进行第1次扩培，培养温度37℃，培养时间6h；再按2％的接种于245L含 有12％脱脂乳粉的水溶液体系中，进行第2次扩培，培养温度37C，培养 时间24h；扩培好的发酵液按5％的接种量接入4750L含有12％脱脂乳粉的 灭菌水溶液中，进行第3次扩培，培养温度37℃，培养时间18h；扩培过程 中，发酵罐均充入氮气，维持厌氧发酵；

(2)将步骤(1)的液体采用固体保留式离心机，进行1000g，30min 的离心菌体收集，并重悬至500L的软水中并洗涤3次；

(3)将步骤(2)的液体采用固体保留式离心机，进行5000g，10min 的离心，收集菌体；

(4)将步骤(3)的菌体重悬至500L的含有16％脱脂奶粉的灭菌水溶 液中，搅拌均匀；

(5)将步骤(4)重悬得到的菌体溶液(浓缩菌悬液)以液滴喷淋的方 式喷入-196℃液氮中，液滴大小为6mm，流量为25L/min；

(6)收集发酵剂固体颗粒，采用灭菌铝箔袋包装后，迅速放置于-40～ -80℃的冷柜中储存。

实施例3液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂(干酪乳杆菌)

本实施例使用设备实施例公开的设备。

制备方法包括下列步骤：

(1)按光明乳业股份有限公司研究院发酵剂研究部所建议的培养条件， 将实验室培养好得到的含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC2W菌株 (CGMCC No.0828，光明乳业股份有限公司)的MRS培养基，按3％的接 种量接种于1L含有12％脱脂乳粉的水溶液体系中，进行第1次扩培，培养 温度30℃，培养时间8h；再按4％的接种于24L含有12％脱脂乳粉的水溶液 体系中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间16h；扩培好的发酵液 按2％的接种量接入1225L含有12％脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次 扩培，培养温度32℃，培养时间16h；扩培过程中，发酵罐均充入氮气，维 持厌氧发酵；

(2)将步骤(1)的液体采用自清式离心机，进行2000g，20min的离 心菌体收集，得到的菌体重悬至100L的软水中并洗涤2次；

(3)将步骤(2)的液体采用自清式离心机，进行3000g，15min的离 心，收集菌体；

(4)将步骤(3)的菌体重悬至100L的含有8％乳清蛋白、3％蔗糖、 3％乳糖和2％海藻糖的灭菌水溶液中，搅拌均匀；

(5)将步骤(4)重悬得到的菌体溶液(浓缩菌悬液)以液滴喷淋的方 式喷入-196℃液氮中，液滴大小为1mm，流量为2L/min；

(6)收集发酵剂固体颗粒，采用灭菌铝箔袋包装后，迅速放置于-40～ -80℃的冷柜中储存。

实施例4液氮深冷造粒乳酸菌直投式发酵剂(干酪乳杆菌)

本实施例使用设备实施例公开的设备。

制备方法包括下列步骤：

(1)按光明乳业股份有限公司研究院发酵剂研究部所建议的培养条件， 将实验室培养好得到的含有干酪乳杆菌Lactobacillus casei BD-II菌株 (CGMCC No.0825，光明乳业股份有限公司)的MRS培养基，按1％的接 种量接种于1L含有12％脱脂乳粉的水溶液体系中，进行第1次扩培，培养 温度30℃，培养时间8h；再按4％的接种于24L含有12％脱脂乳粉的水溶液 体系中，进行第2次扩培，培养温度32℃，培养时间16h；扩培好的发酵液 按2％的接种量接入1225L含有12％脱脂乳粉的灭菌水溶液中，进行第3次 扩培，培养温度32℃，培养时间16h；扩培过程中，发酵罐均充入氮气，维 持厌氧发酵；

(2)将步骤(1)的液体采用自清式离心机，进行2000g，20min的离 心菌体收集，得到的菌体重悬至100L的软水中并洗涤2次；

(3)将步骤(2)的液体采用自清式离心机，进行3000g，15min的离 心，收集菌体；

(4)将步骤(3)的菌体重悬至100L的含有16％乳清蛋白灭菌水溶液 中，搅拌均匀；

(5)将步骤(4)重悬得到的菌体溶液(浓缩菌悬液)以液滴喷淋的方 式喷入-196℃液氮中，液滴大小为10mm，流量为25L/min；

(6)收集发酵剂固体颗粒，采用灭菌铝箔袋包装后，迅速放置于-40～ -80℃的冷柜中储存。

效果实施例1验证实施例1、2、3活菌数和菌种存活率

菌体计数方式采用平板浇注法，即将浓缩菌悬液或深冷造粒发酵剂用无 菌生理盐水(0.85％的NaCl溶液)进行1/10的梯度稀释，至合适稀释梯度， 吸取1mL菌体稀释液并转移至无菌平板上，待无菌琼脂培养基(嗜热链球菌 采用M17琼脂培养基计数，保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌用MRS琼脂培养基 计数)冷却至45～50℃时，倾倒15～25mL于含有菌体稀释液的平板上，混 匀并静止冷却。每个样品进行3次平行试验。冷却、凝固的平板放置于厌氧 培养箱中倒置培养(培养温度和时间依据菌种而定)。培养结束后进行计数。

液氮深冷造粒过程中，菌体存活率＝N₁/N₀×100％。其中，N₀为浓缩菌悬 液中菌体浓度；N₁为液氮深冷造粒后发酵剂中菌体浓度。浓缩菌悬液和液氮 深冷造粒过程中的存活率见表1。

表1液氮深冷造粒过程中的乳酸菌存活率试验

由上表实验数据可知，嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌菌株 在液氮深冷造粒过程中存活率较高，可实现90％以上的存活率。

效果实施例2验证实施例菌种发酵酸奶复活时间

微生物典型的生长曲线分为延滞期(适应期)、指数期、稳定期和衰 亡期4个时期，适应期是指微生物刚刚被放进一个新环境里的适应过程， 适应期的长短又称微生物复活时间，在此阶段生长速率为零。发酵乳中酸 度(°T)增高，主要是乳酸菌增殖产酸的结果，所以测定乳中酸度，反映发 酵剂在乳体系中生长情况和复活时间。

分别称取已巴氏杀菌的无抗鲜奶830g两份，一份用本发明(实施例1 和2的产品)的液氮深冷造粒嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵剂按接种量 6×10⁶cfu/mL发酵，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种数量为1∶1；一份用丹 尼斯克YO-MIX300冻干型发酵剂(真空冷冻干燥发酵剂)发酵，同样控制 接种量6×10⁶cfu/mL发酵，嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌种数量为1∶1。 发酵温度均控制在42±1℃，自接种后每隔30min测定一次滴定酸度。滴定 酸度测定方法：取10ml发酵乳于150mL三角瓶中，加入20mL去离子水和 0.5％酚酞酒精溶液0.5mL，摇匀；用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至微红色并 30秒不褪色，计算所消耗的NaOH溶液的体积V。滴定酸度(°T)＝V×10。

表2乳酸菌直投式发酵剂复活时间试验

由上表实验数据可知，由发酵剂发酵的酸奶在接种后1h内酸度未发生 明显变化，1h后酸度迅速上升，因此可以判断本发明发酵剂的复活时间约为 1h；由市售真空冷冻干燥发酵剂发酵的酸奶在接种后2h内酸度未发生明显 变化，2h后酸度迅速上升，因此可以判断真空冷冻干燥发酵剂的复活时间约 为2h。本发明发酵剂的菌种复活时间较市售冻干型发酵剂要短。