苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-20及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-20及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白，名称为PpLEA3-20，来源于小立碗藓(Physcomitrellapatens)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。将本发明的PpLEA3-20的编码基因导入野生型水稻(Oryza sativa ssp.japonica)的实验可以证明：获得的T

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种苔藓植物耐逆蛋白PpLEA3-20及其编码 基因与应用。

背景技术

自然环境中的干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重 时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。当前，通过 基因工程育种获得具有耐逆性的作物品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键 的技术瓶颈问题是有效抗逆基因的筛选与功能发现。

苔藓植物是5亿年前古奥陶纪出现的陆地先锋植物，其生活史中以“茎叶体”的 配子体为主要营养生长阶段。“茎叶体”叶片由单层细胞组成，仅在其“中肋”处由 少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水 生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离水登陆 时，必然首先面对两大胁迫：水分亏损、温度骤变。巨大的选择压力迫使苔藓植物进 化出不同于“维管植物”(蕨类、种子植物)的逆境应对机制。事实表明：存在于苔 藓植物细胞内的一些基因承担着应对严重逆境的责任，它们可以保护细胞免于逆境伤 害。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白，名称为PpLEA3-20，来源于小立碗藓 (Physcomitrella patens)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表序列2为PpLEA3-20的氨基酸序列，包括208个氨基酸。

为了使1)中的PpLEA3-20便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

  标签   残基   序列   Poly-Arg   5-6(通常为5个)   RRRRR   Poly-His   2-10(通常为6个)   HHHHHH   FLAG   8   DYKDDDDK   Strep-tag II   8   WSHPQFEK   c-myc   10   EQKLISEEDL

上述2)中的PpLEA3-20可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。上述2)中的PpLEA3-20的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第118-744 位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个 碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

与植物抗逆性相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第118-744位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由829个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第118-744 位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的PpLEA3-20蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述PpLEA3-20基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系和 重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有PpLEA3-20基因的重组表达载体。所述植物表 达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植 物表达载体。

使用PpLEA3-20基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一 种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启 动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动 子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括 翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密 码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控 制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区 域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP 基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记 物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在插入玉米Ubiquitin启动子后的质粒pC1390的多克 隆位点间插入上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，是将上述与植物抗逆性相关 蛋白的编码基因PpLEA3-20导入目的植物中，得到抗逆性高于目的植物的转基因植物。

所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因PpLEA3-20是通过所述重组表达载体导入 植物中的。

上述抗逆性具体可为耐旱性。

携带有本发明的与植物抗逆性相关蛋白编码基因PpLEA3-20的植物表达载体可通 过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导 等常规生物学方法转化到植物中。所述植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是水稻。

本发明可获得对干旱耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

本发明通过多种分子生物学研究技术，从苔藓植物中发现了一个基因及其表达蛋 白PpLEA3-20具有显著的抗逆境能力。PpLEA3-20是胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)家 族中的一员。已经研究的LEA基因在不同的生命过程中均起到非常重要的作用，是有 机体对抗环境胁迫时的关键蛋白分子。

将本发明的PpLEA3-20基因导入野生型水稻(Oryza sativa ssp.japonica)的实 验可以证明：T₂代的4个转PpLEA3-20基因植株(20-1、20-2、20-3、20-4)，在干旱 胁迫实验中，存活率(44％、36％、60％和72％)和生长状态都要明显好于野生型对照与 空载体对照植株。说明本发明提供的PpLEA3-20基因与其编码的蛋白能够显著提高植 物的耐旱性。对培育耐逆植物品种，特别是培育耐非生物胁迫(耐旱和/或耐盐)的作 物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的 耐逆性植物品种的培育和鉴定。

附图说明

图1为小立碗藓茎叶体蛋白质的双向凝胶电泳图谱，箭头指示PpLEA3-20蛋白在 干旱处理的植株中丰度显著增加。A.未经干旱处理的对照植株；B.干旱处理3天的 植株。

图2为植物表达载体pCU-PpLEA3-20的结构。

图3为转PpLEA3-20基因的水稻植株的PCR鉴定，图中WT为对照植株；20-1、20-2、 20-3、20-4为4个转基因水稻株系。

图4为PpLEA3-20基因在水稻植株中的表达分析，图中A.转PpLEA3-20基因水稻 植株的双向凝胶电泳图谱，箭头指示PpLEA3-20基因的表达产物，a.对照植株，b. 转基因植株；B.PpLEA3-20基因表达产物的PMF图谱；C.PpLEA3-20基因表达产物的 CID图谱；D.PpLEA3-20基因表达蛋白PpLEA3-20的全序列，CID图谱鉴定到的肽段序 列以黑体表示。

图5为显示转PpLEA3-20基因水稻植株和对照植株在生长45天时的植株高度。

图6为显示转PpLEA3-20基因水稻植株和对照植物在干旱胁迫处理后的存活率。

图7为转PpLLEA3-20基因植株耐旱性实验，对照植株(WT)和4个转基因株系(20-1， 20-2，20-3，20-4)在相同条件下干旱处理10天后复水，图示为复水15天后的植株， 其中野生型对照与空载体对照植株的实验结果表型一致，故仅显示一种对照的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、苔藓耐逆性相关蛋白PpLEA3-20编码基因PpLEA3-20的筛选及其cDNA 克隆。

小立碗藓干旱处理：将生长在BCD培养基上的小立碗藓(Physcomitrella patens) (耿旭珂等，2008植物基因打靶——模式植物小立碗藓的应用。生物学通报，43(4)： 13-15；公众可从首都师范大学获得)茎叶体转移至浸湿的滤纸上，放入500ml烧杯中， 用吸水纸封口。在温度24±1℃，相对湿度30±5％的培养室内进行干旱处理。3天后， 取出干旱的茎叶体用于蛋白质提取。取未干旱处理的茎叶体做对照实验。

小立碗藓茎叶体的蛋白质提取采用分步抽提与酚抽提相结合的方法。来自正常条 件下和干旱条件下的蛋白质通过经典的IEF/SDS-PAGE双向电泳(2DE)和荧光差异凝 胶电泳(DIGE)分离。具体步骤按照Amersham Bioscience提供的实验操作指南进行。

获得的蛋白质图谱分别经过ImageMaster 2D Platinum(Amersham Bioscience) 和DeCyder 2D Software，Version 6.5(Amersham Bioscience)分析。在干旱条件下 丰度变化超过2倍的蛋白质点被分离获得。将所有的差异蛋白点分别用胰蛋白酶处理， 所获多肽用质谱仪(MALDI TOF/TOF MS)和数据库(NCBI)鉴定。我们发现，在干旱 条件下，有一个蛋白质在经典的双向电泳(2DE)和荧光差异凝胶电泳(DIGE)凝胶上 分别被上调了4.45倍和5.99倍(图1A，B)。该蛋白质被命名为PpLEA3-20。

根据质谱鉴定所获序列，设计引物，获得PpLEA3-20基因的cDNA序列。具体操作 如下：首先按上述条件对小立碗藓茎叶体实施干旱处理以诱导PpLEA3-20基因的表达； 然后，提取小立碗藓茎叶体总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据质谱鉴定结果。

设计引物如下：5’-GGGGTACCCCTTCCCACTAAATACCGT-3’和5’ -GGACTAGTTCCAGAGCCAATGCTTG-3’。

以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电 泳检测，得到分子量约为829bp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒 (TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pMD19-T Simple(Takara)连接，将连接产 物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pMD19-T Simple载体上的羧卞青霉素抗性标 记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的通用引物M13 对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的基因(命名PpLEA3-20)由829个脱 氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5′末端第118至744 位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质。

实施例2、转PpLEA3-20基因培育耐旱植物及其检测分析

1)PpLEA3-20表达载体pCU-PpLEA3-20的构建

将将序列表中序列3所示的玉米Ubiquitin启动子(以5’-CCAAGCTTAAGCTTTCTAGTGC AGTGCAGCGTGAC-3’和5’-GGGGTACCCTGCAGCCTCTAGTGCAGAAGTAACACCA-3’为引物，从 玉米基因组DNA中扩增得到)插入植物双元表达载体pC1390(购自Cambia，Queenslan  d.Australia)的HindIII和Kpn I位点中，构成中间载体pC1390-Ubi。将上述实施例 1中扩增获得的PpLEA3-20基因的cDNA片段用Spe I和Kpn I双酶切，正向插入该 中间载体pC1390-Ubi的Ubiquitin启动子后，得到重组载体。将含有序列表中序列1 的自5′末端第1-829位脱氧核糖核苷酸的PpLEA3-20基因的重组表达载体命名为pCU -PpLEA3-20(如图2所示)。该载体具有卡纳和潮霉素两个筛选标记。

2)转PpLEA3-20基因植株的获得和检测鉴定

将pCU-PpLEA3-20载体用电击的方式转入农杆菌LBA4404中。挑取阳性克隆于28 ℃培养。待农杆菌浓度达到OD600值为0.120～0.140之间时，用该菌液侵染水稻(Oryza  sativa ssp.japonica)愈伤组织，侵染30min，期间不时用手轻摇。

然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，避光共培养3～4d。共培养结束后，将愈 伤组织转移到选择培养基上培养10～15d后继代一次。挑取从原愈伤组织表面生长出 来的新的HYG(潮霉素)抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，28℃黑暗下预分化培 养7d。选择奶白色，表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28℃分化培养：先在 黑暗下培养3d，然后在持续冷光照下培养15～20d。将从抗性愈伤组织再生出的幼苗 转移到根诱导培养基上，持续光照培养15d，生长状况良好的幼苗直接转移到大田种植。 当年秋季收获转基因水稻种子。

种子收获后，播于含潮霉素(30mg/L)的MS筛选培养基上筛选。待T1代植株长 至4-6叶时移到大田中生长。将T1代单株收获后，各单株种子分别播种，用潮霉素继 续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得稳定的转PpLEA3-20株系。

选择上述筛选获得的稳定遗传的转PpLEA3-20株系中PpLEA3-20基因表达高的4 个株系，分别进行PCR、蛋白质双向凝胶电泳和质谱验证。

PCR验证：用CTAB法提取水稻基因组DNA，使用正向引物(5’-CCTTCCCACTAAATA  CCGT-3’)和反向引物(5’-TCCAGAGCCAATGCTTG-3’)进行PCR扩增。上述4个株系中 均可扩增出829bp的目的条带(如图3所示)。

蛋白质双向凝胶电泳验证：先使用分级抽提法(Cui等，2005)提取转PpLEA3-20 基因水稻植株和野生型对照水稻植株的全蛋白。按常规方法获得蛋白质双向凝胶电泳 图谱。比较分析发现，在转PpLEA3-20基因水稻植株中出现可能的PpLEA3-20基因表 达产物(如图4中A所示)。

质谱验证：上述切下凝胶中的可能的PpLEA3-20基因表达产物，用胰蛋白酶酶解。 经MALDI TOF/TOF质谱鉴定，确认该蛋白质正是PpLEA3-20基因的表达蛋白(如图4 中B、C、D所示)。

3)转PpLEA3-20基因株系的耐旱性鉴定

按照获得转PpLEA3-20基因株系的方法将空载体pC1390-Ubi导入野生型水稻中， 制备得到空载体对照。

本步骤设置空载体对照和野生型对照。

将上述通过鉴定确认为转PpLEA3-20基因水稻的4个株系(20-1，20-2，20-3和 20-4)和对照植株(空载体对照和野生型对照)分别种植于25孔穴盆内。培养介质为 市售营养土，培养温度为26±1℃。在充分供水条件下生长45天。转PpLEA3-20植株 表现出的非常好的生长一致性，但株高比对照植株降低约8.1％(如图5所示，空载体 对照和野生型对照植株表型一致，省略了空载体对照图)；进行干旱处理：停止供水， 待水稻叶片完成卷曲并萎蔫时，恢复供水。恢复供水15天后，分别观察不同株系水稻 的存活状况并照相(如图6、图7所示，空载体对照和野生型对照植株表型一致，省略 了空载体对照图)。

实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为25株。结果表明： 对照植株在干旱处理并复水后，存活率为0，即在上述干旱处理条件下完全死亡；而4 个转PpLEA3-20基因的株系的存活率分别为44％、36％、60％和72％(图6)。说明转 PpLEA3-20基因植株的耐旱性明显优于对照植株。

将上述干旱处理后存活的转PpLEA3-20基因水稻植株种于大田之中，观察其发育 状况直至籽粒成熟。结果发现：转PpLEA3-20基因的水稻植株在其株形、抽穗时期方 面与对照植株并没有明显差别，但植株高度却下降约10厘米。