利用VIGS技术研究棉花三个锌指蛋白基因的耐逆性

摘要

棉花作为一种主要的经济作物，与国计民生密切相关，在农业经济发展中处于重要地位。我国棉花生产位居世界前列，同时也是最大的棉花消耗国。随着环境不断恶化，干旱、盐碱、极端温度等各种非生物逆境危害严重制约着棉花产量和品质的提高;全球可耕土地减少，而且近年来，国家调整种植业产业结构，棉花种植面积逐年减少。棉花是耐逆性较强的作物，因此进一步提高棉花耐逆能力，是提高土地利用率，保证棉花产量的重要措施。
　　锌指蛋白(zinc finger protein)是一类和锌离子结合后能折叠成手指状结构域的转录因子，在动植物和微生物中广泛存在。这类蛋白通过与DNA、RNA结合或与其他蛋白质的相互作用来调控下游基因的表达，其作用贯穿于生命活动的各个过程。锌指蛋白在植物体内发挥着重要的作用，可以调节生长发育、增强耐病耐逆性等。
　　病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术是指在病毒载体中插入一段目的基因序列，利用重组载体侵染宿主植物，使宿主目的基因发生沉默继而引起表型变化，通过表型变异进行基因功能分析。该技术可以快速、高效分析植物基因功能。
　　本实验室前期通过同源克隆方法得到了三个锌指蛋白基因GhZFP2，GhRCHY1，GhBBX1，通过qRT-PCR对这三个基因进行了逆境诱导表达分析，转烟草结果表明在烟草中异源表达这三个基因可以提高烟草的耐盐和耐旱性。本研究基于前期研究结果，进一步构建了三个基因的VIGS载体，利用注射的方法将病毒转入棉花后进行盐胁迫和干旱胁迫处理，通过测定相关生理指标进一步来研究这三个基因的功能，同时也构建了与棉花抗逆相关基因的VIGS快速功能验证体系。主要结果如下:
　　1、通过不同浓度的NaC1和PEG6000处理两叶一心期的晋棉19幼苗，获得最佳NaCl处理浓度为200 mM，最佳PEG6000处理浓度为15％(w/v)。将目的基因片段构建到pTRV2载体上，得到了pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1重组载体，将其转入棉花。通过qRT-PCR和RT-PCR检测目的基因沉默情况，获得目的基因表达量明显下降的基因沉默植株。
　　2、对沉默植株进行盐胁迫处理，检测叶片净光合速率，Pro含量，SOD活性，MDA含量，K+/Na+等5个耐盐相关指标。结果表明:在盐胁迫下，沉默GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1这三个基因的植株，叶片净光合速率显著低于Mock组，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1达到了极显著水平;所有沉默植株的Pro含量变化倍数均比Mock组低，其中pTRV2-GhBBX1组达到了显著水平;所有沉默植株的SOD活性变化倍数极显著地低于Mock组;所有沉默植株的MDA含量变化倍数高于Mock组，但没有达到显著水平;所有沉默植株地上部分的K+/Na+显著低于Mock组，其中 pTRV2-GhBBX1组达到了极显著差异，pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1组地下部K+/Na+显著地低于Mock组。结果表明:在盐胁迫下，基因沉默植株净光合速率比Mock组低;渗透调节物质积累速率也比Mock组低;清除活性氧的酶活变化比Mock组低，同时质膜氧化产物积累速率比Mock组高;地上部和地下部吸收和积累更多的Na+，使植株体内离子平衡受到破坏。
　　3、对沉默植株进行干旱胁迫处理，检测叶片净光合速率，叶片失水率，气孔孔径，Pro含量，SOD活性，MDA含量等6个耐旱相关指标。耐旱相关指标检测结果表明:在干旱胁迫下，沉默GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1这三个基因的植株叶片净光合速率低于Mock组，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1达到了显著水平;所有沉默植株的叶片失水率都比Mock组高;干旱胁迫10d、20d后，所有沉默植株的气孔孔径都比Mock组小，且达到了极显著差异;所有沉默植株的Pro含量变化倍数均比Mock组低，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1组达到了显著水平;所有沉默植株的SOD活性变化倍数显著地低于Mock组;所有沉默植株的MDA含量变化倍数高于Mock组，其中pTRV2-GhBBX1组达到了显著差异。结果表明:在干旱胁迫下，基因沉默植株净光合速率比Mock组低，影响植株的光合作用;叶片失水率比Mock组高同时气孔孔径比Mock组变小，植株水分散失较多;渗透调节物质积累速率也比Mock组低，渗透调节能力降低;清除活性氧的酶活变化比Mock组低，同时质膜氧化产物积累速率比Mock组高，破坏了质膜的完整性和稳定性。
　　研究表明这三个基因都参与棉花对盐胁迫和干旱胁迫的响应，目前这三个基因的转基因棉花材料创制工作正在进行中。

目录

声明

摘要

本文所用缩略词

第一章 植物的耐盐性与耐旱性研究

1．1 植物耐盐性的研究进展

1．1．1 盐胁迫对植物的危害

1．1．2 植物耐盐性的调控

1．2 植物耐旱性的研究进展

1．2．1 干旱胁迫对植物的危害

1．2．2 植物耐旱性的调控

第二章 耐盐与耐旱相关锌指蛋白的研究进展

2．1 锌指蛋白简介

2．2 耐盐相关锌指蛋白

2．3 耐旱相关锌指蛋白

第三章 VIGS技术及其应用

3．1 VIGS技术的原理

3．2 VIGS技术的应用现状

本研究的目的和意义

第四章 利用VIGS技术研究棉花中三个锌指蛋白基因的耐盐性和耐旱性

1 材料

1．1 植物材料

1．2 菌株和质粒

1．3 培养基

1．4 植物抗生素的配制

1．5 酶和试剂

1．6 试剂盒

1．7 引物

2 方法

2．1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2 农杆菌感受态细胞的制备和转化

2．3 质粒的提取与检测

2．4 目的基因片段的扩增

2．5 目的基因片段的回收

2．6 目的基因片段和克隆载体的连接

2．7 目的基因和载体基因的酶切和连接

2．8 阳性克隆的检测与测序

2．9 棉花幼苗VIGS侵染方法

2．10 棉花组织RNA提取

2．11 cDNA第一链的合成

2．12 实时荧光定量PCR分析

2．13 RT-PCR检测

2．14 沉默植株盐胁迫与干旱胁迫处理

2．15 沉默植株胁迫处理后相应生理指标的测定

3 结果与分析

3．1 晋棉19幼苗最佳胁迫浓度的确定

3．2 棉花GhZFPs基因片段扩增

3．3 目的基因片段与PMD 19-T Simple克隆载体的连接与测序鉴定

3．4 病毒载体pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1的构建

3．5 病毒载体pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1转化农杆菌

3．6 GhCLA1基因沉默植株的表型观察

3．7 棉花GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1基因沉默植株的鉴定

3．8 棉花GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1基因沉默植株耐盐性分析

3．9 棉花GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1基因沉默植株耐旱性分析

4 讨论

4．1 GhZFPs基因沉默植株耐盐性探讨

4．2 GhZFPs基因沉默植株耐旱性探讨

全文结论

附录

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文