在双子叶植物作物的田间对AAD-1单子叶自生植物的控制

摘要

本发明部分涉及控制种植有双子叶植物作物诸如大豆或棉花的田间的AAD-1单子叶自生植物。依照本发明的一些实施方案，选择环己二酮除草剂作为控制AAD-1自生植物的有效工具，因为AAD基因没有赋予对此类禾本科除草剂化学品的耐受性。另外，咪唑啉酮类除草剂在一些优选的实施方案中可以用于选择性控制自生玉米的常规或除草剂耐受性品种。在一些特别优选的实施方案中使用包含事件DAS-40278-9的AAD-1玉米。

说明书

发明背景

玉米(单子叶植物)和大豆(双子叶植物)例如可以在多种地形在多个作物 轮作周期中轮作。棉花也是双子叶植物。

“自生(的)”植物是在种植有当前生长季的作物的田间出土的来自先前 生长季的不想要的植物。自生植物基本上是杂草，并且像杂草可以降低当前 生长季感兴趣的作物的收获和产量。自生植物从期望的植物转移肥料资源 等。

与平原杂草不同，经常将自生植物特定地工程化改造成对一些除草剂有 抗性。如此，控制自生植物可能比控制天然存在的杂草更困难。

如本文中所描述的AAD(芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxy alkanoate  dioxygenase))基因在用AAD基因转化的植物中赋予高水平的对2，4-D除草剂 的耐受性。

AAD-1基因(编码例如所附序列表的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、和SEQ  ID NO：3；见WO 2005 107437)也对用该基因转化的玉米和其它单子叶植物物 种赋予高水平的对苯氧基和芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂(phenoxy-and  aryloxyphenoxyproplonate herbicide)(“fops”诸如吡氟禾草灵(fluazifop)和吡 氟氯禾灵(haloxyfop))的耐受性。(Fops主要用于控制单子叶植物，因为双子 叶植物趋向于具有一些对fop的天然抗性)。如此，AAD-1允许对作物使用一 些fops作为选择剂或作为除草剂，其中在没有AAD-1基因的情况中预期会破 坏作物。

AAD-12和AAD-13基因也赋予高水平的对吡啶基氧乙酸酯 (pyridyloxyacetate)除草剂(诸如定草酯(triclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)；“pyrs”) 的耐受性。如此，AAD-12和AAD-13各自容许对作物使用pyr作为选择剂或 作为除草剂，其中在没有AAD-12或AAD-13基因的情况中预期会破坏作物。

存在着非常众多类型的仅单子叶植物或草的除草剂(monocot-or  grass-only herbicides)(其杀死单子叶植物)。

ACC酶抑制剂除草剂包括fops和dims。

发明概述

本发明部分涉及控制种植有双子叶植物作物诸如大豆或棉花的田间的 AAD-1单子叶自生植物。

本发明还部分涉及如下的认识，即使用AAD基因的一个潜在的不利方面 在于自生植物可以对2，4-D以及对fops(在AAD-1的情况中)有抗性。在AAD-1 的情况中，fop除草剂不再会有效控制种植有双子叶植物作物诸如大豆或棉 花的田间的自生植物AAD-1玉米。本发明部分涉及如下的认识，即当AAD 基因与玉米中的其它除草剂抗性性状(诸如草甘膦(glyphosate)、草铵膦 (glufosinate)等)叠加(stack)时，下一年的自生玉米植物的控制可能成为一个问 题。

依照本发明的一些实施方案，自几乎无数的其它选项中选择环己二酮 (“dim”)除草剂(诸如烯草酮(clethodim)、稀禾定(sethoxydim)等)作为控制 AAD-1“自生植物”的有效工具，因为AAD基因没有赋予对此类禾本科除草 剂(graminicide)化学品的耐受性。Dim趋向于为单子叶植物特异性的。

另外，在依照本发明的一些优选的实施方案中，可以使用下列咪唑啉酮 类除草剂：咪草烟(imazethapyr)、甲氧咪草烟(imazamox)、和灭草喹 (imazaquin)。大豆对这些除草剂天然耐受，因此可以使用这些咪唑啉酮来选 择性控制自生玉米的常规或除草剂耐受性品种。(非商业化的CLEARFIELD 棉花和咪唑啉酮抗性大豆由BASF开发；棉花对咪唑啉酮天然不耐受)。

这假定来自前一季的玉米对咪唑啉酮易感。(大豆对某些咪唑啉酮天然 耐受)。除了CLEARFIELD玉米(其对咪唑啉酮耐受)外，玉米一般对咪唑啉酮 易感。

也可以依照本发明使用其它类型的除草剂，包括ALS-(乙酰乳酸合酶)和 /或AHAS-(乙酰羟酸合酶)抑制剂的应用，也用于控制自生植物AAD单子叶植 物。

依照本发明的第三选项是使用如本文中所使用的其它除草剂来控制 AAD-1自生植物。这些选项包括提供相对快速的“烧毁(burn down)”的除草 剂，和种植前使用的非选择性除草剂，诸如百草枯(paraquat)。

在一些特别优选的实施方案中使用包含事件DAS-40278-9的AAD-1玉 米。

序列简述

SEQ ID NO：1是由来自Sphingobium herbicidivorans的AAD-1 v1基因编码 的天然蛋白质序列。

SEQ ID NO：2是由除去内部NotI限制性位点的AAD-1 v2基因编码的氨基 酸序列。

SEQ ID NO：3是由具有植物中表达的植物密码子选择的AAD-1 v3基因 编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是玉米事件DAS-40278-9的序列，其包含5’和3’玉米基因组 侧翼序列和AAD-1盒插入序列。

发明详述

如本文中所使用的且除非另有规定，优选的双子叶植物是大豆或棉花。

ACC酶抑制剂除草剂包括fops和dims。

本发明的一方面包括使用“dim”除草剂以除去双子叶植物的田间的自 生植物AAD-1玉米。在一些具体的实施方案中，AAD-1基因以称作 DAS-40278-9的AAD-1玉米事件存在于玉米中，所述AAD-1玉米事件具有以 保藏号PTA-10244保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的种子(黄色马齿 型玉米(Yellow Dent maize)杂交种子(Zea Mays L)：DAS-40278-9；根据布达佩 斯条约以Dow AgroSciences LLC的名义保藏；ATTC收到种子/株的日期为： 2009年7月10日；2009年8月17日确认存活)及其衍生的后代。参见SEQ ID  NO：4。此事件披露于USSN 61/235,248(2009年8月19日提交)中。此类AAD-1 单子叶自生植物可以存在于下一年的大豆、棉花、或其它阔叶作物中。如此， 本发明包括对自生植物AAD-1玉米植物应用dim(或如本文中所描述的其它) 除草剂，特别地其中所述玉米植物包含40278-9事件。

由于AAD基因的特异性解毒方面，“dim”除草剂不会被AAD-1解毒，并 且AAD-1单子叶自生植物仍然会对dim除草剂高度易感。如此，本发明包括 使用一种或多种dim除草剂，其中AAD-1基因单独使用或与其它除草剂耐受 性性状叠加。

在一些其它优选的实施方案中，可以依照本发明使用咪唑啉酮以控制双 子叶植物田间的单子叶/玉米自生植物。若玉米对咪唑啉酮易感，而双子叶植 物对咪唑啉酮有抗性，则可以在双子叶植物田间使用“dim”和/或咪唑啉酮 除草剂以控制AAD-1玉米自生植物。然而，如果例如在前一季种植 CLEARFIELD玉米(其对咪唑啉酮有抗性)，那么这会趋向于在下一季排除使 用咪唑啉酮来控制双子叶植物田间的玉米自生植物。

如上文暗指的，依照本发明选择除草剂以对目前种植的田地使用部分取 决于自生植物(前一季的单子叶植物作物)中存在的除草剂耐受性性状(若有 的话)和目前生长季的双子叶植物作物田间存在的除草剂抗性性状。如此， 根据与玉米中的其它除草剂耐受性性状的叠加(若有的话)及要处理的田间的 双子叶植物(大豆或棉花)的耐受性或易感性，可以选择其它除草剂化学品来 提供对AAD-1玉米的控制。

例如，若自生植物AAD-1玉米还与草甘膦-或草铵膦性状叠加，则分别 可以在目前季的大豆田间使用草铵膦或草甘膦(假设大豆也分别具有针对草 铵膦或草甘膦的抗性性状)。

若自生植物AAD-1玉米还与草甘膦和草铵膦性状叠加，则仍可以在大豆 田间使用dims和/或咪唑啉酮来控制AAD-1玉米自生植物(再次假设若使用咪 唑啉酮来控制自生植物，则玉米没有针对咪唑啉酮的抗性性状)。

当在前一生长季在玉米中单独使用AAD-1基因时，可以在下一季使用咪 唑啉酮、“dims”、草甘膦、和/或草铵膦来控制大豆或棉花的种植田间的自生 植物AAD-1玉米(假设双子叶植物耐受这些另外的除草剂(诸如草甘膦和/或 草铵膦)之任一种或多种或对其有抗性)。也就是说，若分别将大豆或棉花工 程化改造或育种成耐受草甘膦和/或草铵膦，则可以使用草甘膦和/或草铵膦。

当AAD-1基因在玉米中与例如，草甘膦或草铵膦抗性性状(诸如存在于 Roundup Ready[或GAT或其它草甘膦耐受性作物]或Liberty Link[或其它草 铵膦耐受性]玉米)叠加时，则可以使用咪唑啉酮和/或“dim”除草剂来控制 双子叶植物作物中的自生植物AAD-1玉米(假设若要使用咪唑啉酮除草剂， 则双子叶植物作物对咪唑啉酮有抗性)。

也可以分别使用草铵膦或草甘膦(假设双子叶植物作物对所述除草剂有 抗性，而玉米是易感的)。也就是说，若例如大豆具有草甘膦耐受性，而非 草铵膦耐受性的性状，则也可以使用草甘膦(假设ROUNDUP READY玉米不 是自生植物)。若大豆具有草铵膦耐受性性状(诸如PAT)而非草甘膦耐受性性 状，则也可以使用草铵膦(假设LIBERTY LINK玉米不是自生植物)。

在任何那些叠加背景中(且即使AAD-1、草甘膦耐受性、和草铵膦耐受 性、和咪唑啉酮耐受性性状都存在于前一季的玉米中)，可以在大豆田间使 用dim来控制AAD-1玉米自生植物。

在一些实施方案中，可以在单子叶植物的田间使用本文中所公开的除草 剂的组合(参见实施例4和5)来控制AAD-1单子叶自生植物。这些实施方案包 括控制单子叶植物田间的AAD-1事件DAS-40278-9玉米自生植物。此类实施 方案包括草地草中的草地草(turf-in-turf)(其它(非AAD1)草地草田间的 AAD-1草地草自生植物)。

实施例

实施例1：使用备选除草剂来控制种植有大豆的田间的自生植物AAD玉米

在一个实施方案中，通过应用除草剂或除草剂组合在大豆田内控制含有 AAD表达盒(AAD-1)的自生植物转基因玉米系。控制自生植物转基因AAD玉 米系所使用的特定除草剂依赖于田内种植的大豆种子类型(例如，常规的大 豆，Round-up Ready大豆、Liberty Link大豆等)。

此外，可以经由常规的育种或分子叠加来将AAD性状与其它别的除草剂 耐受性性状叠加。在此类例子中，用于控制与另一种除草剂耐受性性状叠加 的自生植物AAD玉米的特定除草剂会依赖于所述别的除草剂耐受性性状和 田内种植的大豆类型。

可以在种植前于出土前(pre-emergence)/烧毁(burndown)时或在种植后于 出土后(post-emergence)进行给定除草剂的应用以控制自生植物转基因AAD 玉米系。表1列出了要在种植的不同阶段(出土前或出土后)使用以控制自生植 物转基因AAD玉米的除草剂。会将正好或大约1X田间率(Field Rate)浓度的除 草剂作为罐混合物或单独应用于出土前和出土后自生植物对照两者的田间。

大豆田内的含有AAD表达盒的转基因玉米植物的控制会可应用于控制 种植有双子叶植物作物(包括但不限于：大豆、棉花、芸苔、亚麻、向日葵、 豆科作物、苜蓿、花生、和番茄)的田内的自生植物AAD转基因单子叶植物(包 括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、草地草物种、高粱、大麦、小麦、和 燕麦，和硬粒小麦)。上文所描述的例子(其中在大豆田间控制自生植物转基 因AAD玉米植物)例示了本发明，而并不意图限制此实施方案的范围。

实施例2：使用备选的除草剂来控制种植有AAD大豆的田间的自身植物玉米(常规的或含有非AAD除草剂耐受性性状)

在一个实施方案中，通过应用除草剂或除草剂组合在转基因AAD大豆 (AAD-12)的田内控制自生转基因玉米系(含有Clear Field性状、Roundup  Ready或其它草甘膦耐受性性状、Liberty Link性状、咪唑啉酮耐受性性状、 或其任何叠加组合)或自生植物常规玉米系。控制自生玉米植物使用的特定 除草剂依赖于田内种植的玉米种子类型(例如，常规的大豆、Round-up Ready 大豆、Liberty Link大豆等)。另外，控制自生常规或转基因玉米系使用的特 定除草剂依赖于田内种植的AAD转基因大豆种子类型(即，叠加性状或单独 的)和自生玉米系拥有的性状。

可以在种植前于出土前/烧毁时或在种植后于出土后进行给定除草剂的 应用以控制自生常规或转基因大豆系。表2和表3列出了要在种植的不同阶段 (出土前或出土后)使用以控制自生常规或转基因玉米的除草剂。会将正好或 大约1X田间率(Field Rate)浓度的除草剂作为罐混合物或单独应用于出土前 和出土后自生植物对照两者的田间。

AAD转基因大豆(与其它除草剂耐受性性状叠加或单独的)田内的含有 除草剂耐受性表达盒的常规或转基因玉米植物的控制可应用于控制种植有 AAD转基因双子叶植物作物(包括但不限于大豆、棉花、芸苔、亚麻、向日 葵、豆科作物、苜蓿、花生、和番茄)的田内的常规或除草剂耐受性转基因 单子叶植物(包括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、草地草物种、高粱、 大麦、小麦、和燕麦，和硬粒小麦)。上文所描述的例子(其中在种植有AAD 转基因大豆的田间控制自生常规或转基因除草剂耐受性玉米植物)例示了本 发明，而并不意图限制此实施方案的范围。

实施例3：使用备选的除草剂来控制种植有AAD-12棉花的田间的自生植物AAD-1玉米

在一个实施方案中，通过应用除草剂或除草剂组合来在AAD-12棉花的 田内控制含有AAD-1表达盒的自生转基因玉米系。控制自生植物转基因 AAD-1玉米系使用的特定除草剂依赖于田内种植的AAD-12棉花种子类型 (例如，AAD-12棉花或与Round-up Ready、Liberty Link、或其它除草剂耐受 性性状叠加的AAD-12棉花)。

此外，可以经由常规的育种或分子叠加来将AAD-1性状与其它别的除草 剂耐受性性状叠加。在此类例子中，用于控制与另一种除草剂耐受性性状叠 加的自生植物AAD-1玉米的特定除草剂会依赖于所述别的除草剂耐受性性 状和田内种植的棉花类型。

可以在种植前于出土前/烧毁时或在种植后于出土后进行给定除草剂的 应用以控制自生植物转基因AAD-1玉米系。表4列出了要在种植的不同阶段 (出土前或出土后)使用以控制自生植物转基因AAD-1玉米的除草剂。会将正 好或大约1X田间率(Field Rate)浓度的除草剂作为罐混合物或单独应用于出 土前和出土后自生植物对照两者的田间。

AAD-12棉花的田内的含有AAD-1表达盒的转基因玉米植物的控制会可 应用于控制种植有AAD-12双子叶植物作物(包括但不限于大豆、棉花、芸苔、 亚麻、向日葵、豆科作物、苜蓿、花生、和番茄)的田内的自生植物AAD-1 转基因单子叶植物(包括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、草地草物种、 高粱、大麦、小麦、和燕麦，和硬粒小麦)。上文所描述的例子(其中在AAD-12 棉花田间控制自生植物转基因AAD-1玉米植物)例示了本发明，而并不意图 限制此实施方案的范围。

表1：控制大豆(或其它双子叶植物作物)中的自生植物AAD-1(单独的或与其 它HT性状叠加的性状)玉米(或其它单子叶植物)

表2：控制AAD-1大豆(或其它双子叶植物作物)中的自生玉米(或其它单子叶 植物)[单独的或与其它HT性状叠加的性状]

表3：控制AAD-12大豆(或其它双子叶植物作物)中的自生玉米(或其它单子 叶植物)[单独的或与其它HT性状叠加的性状]

实施例4：使用备选除草剂来控制种植有玉米的田间的自生植物AAD玉米

在另一个实施方案中，通过应用除草剂或除草剂组合在玉米田内控制含 有AAD表达盒(AAD-1)的自生植物转基因玉米系。控制自生植物转基因AAD 玉米系所使用的特定除草剂依赖于田内种植的玉米种子类型(例如，Clear  Field玉米、Round-up Ready玉米、Liberty Link玉米等)。

此外，可以经由常规的育种或分子叠加来将AAD性状与其它别的除草剂 耐受性性状叠加。在此类例子中，用于控制与另一种除草剂耐受性性状叠加 的自生植物AAD玉米的特定除草剂会依赖于所述别的除草剂耐受性性状和 田内种植的玉米类型。

可以在种植前于出土前/烧毁时或在种植后于出土后进行给定除草剂的 应用以控制自生植物转基因AAD玉米系。表5列出了要在种植的不同阶段(出 土前或出土后)使用以控制自生植物转基因AAD玉米的除草剂。会将正好或 大约1X田间率浓度的除草剂作为罐混合物或单独应用于出土前和出土后自 生植物对照两者的田间。

玉米田内的含有AAD表达盒的转基因玉米植物的控制会可应用于控制 种植有单子叶植物作物(包括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、草地草物 种、高粱、大麦、小麦、和燕麦，和硬粒小麦)的田内的AAD转基因单子叶 植物(包括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、草地草物种、高粱、大麦、 小麦、和燕麦，和硬粒小麦)。上文所描述的例子(其中在玉米田间控制自生 植物转基因AAD玉米植物)例示了本发明，而并不意图限制此实施方案的范 围。

表5：控制玉米(或其它单子叶植物)中的自生植物AAD-1(单独的或与其它 HT性状叠加的性状)玉米(或其它单子叶植物)

实施例5：使用备选的除草剂来控制种植有ADD玉米的田间的自生玉米

在一个实施方案中，通过应用芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂(Fops)，包括 但不限于喹禾灵、吡氟氯禾灵、唑禾草灵、吡氟禾草灵等，其立体特异性异 构体(stereospecific isomer)或外消旋混合物、及其酯、酸或盐来在转基因AAD 玉米(AAD-1)的田内控制自生植物转基因玉米系(含有Clear Field性状、 Roundup Ready或其它草甘膦耐受性性状、Liberty Link性状、咪唑啉酮耐受 性性状、或其任何叠加组合)或自生植物常规玉米系。另外，可以与另一种 除草剂一起应用Fops除草剂以控制上文所描述的自生玉米系。

控制自生常规或转基因玉米系使用的特定除草剂依赖于田内种植的 AAD转基因玉米种子类型(即，叠加性状或单独的)和自生玉米系拥有的性 状。例如，可以用含有Fop和草铵膦的除草剂混合物，但是仅在先前的自生 植物不含PAT(或其它草铵膦耐受性性状)和AAD-1的情况中喷射已经与另一 种除草剂耐受性性状诸如PAT叠加的AAD-1转基因玉米系。

可以在种植前于出土前/烧毁时或在种植后于出土后进行给定除草剂的 应用以控制自生常规或转基因玉米系。表6列出了要在种植的不同阶段(出土 前或出土后)使用以控制自生常规或转基因玉米的除草剂。会将正好或大约 1X田间率(Field Rate)浓度的除草剂作为罐混合物或单独应用于出土前和出 土后自生植物对照两者的田间。

AAD转基因玉米(与其它除草剂耐受性性状叠加或单独的)的田内的含 有除草剂耐受性表达盒的常规玉米植物或转基因玉米植物的控制会可应用 于控制种植有AAD单子叶植物作物(包括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、 草地草物种、高粱、大麦、小麦、和燕麦，和硬粒小麦)的田内的除草剂耐 受性转基因单子叶植物(包括但不限于玉米、稻、甘蔗、柳枝稷、草地草物 种、高粱、大麦、小麦、和燕麦，和硬粒小麦)。上文所描述的例子(其中在 种植有AAD转基因玉米的田间控制自生转基因除草剂耐受性玉米植物)例示 了本发明，而并不意图限制此实施方案的范围。

表6：控制AAD-1(单独的或与其它HT性状叠加)玉米(或其它单子叶植物) 中的自生玉米(或其它单子叶植物)

实施例5：对含有AAD-1和PAT的转基因玉米测试出土后除草剂应用

将含有来自pDAB3404的AAD-1和PAT表达盒(RB7 MAR v3::玉蜀黍 (Zea Maize)泛素启动子v2::AAD-1 v3::玉蜀黍Per5 3’UTR v2::稻肌动蛋 白1启动子v2::PAT v3::玉蜀黍脂肪酶3’UTR v1)的转基因Hi-II玉米植物和 Hi-II非转基因对照植物进行繁殖以供测试。将种子种植入Metro Mix培养基 (Sun Gro Horticulture Inc.，Bellevue，Wash.)中，并用霍格兰氏溶液地下灌溉， 直至湿润，然后容许重力排水。将盆放置于设置于27℃的温室环境中，直至 发芽的植物达到V1-V3生长阶段。正好在或大约在V1-V3生长阶段，使用轨 道喷雾器(track sprayer)喷射玉米植物，并校准降落喷嘴从而以1X田间率投递 a187L/ha除草剂溶液(表7)。处理后，将植物放置于温室中，并经由14天后的 视觉观察损伤评估评分。表7还列出了植物对应用的除草剂的耐受性，如通 过视觉观察损伤评估所测定的。

表7：AAD-1+PAT+草甘膦上的杀禾本科(Graminicidal)活性成分

注意：3404栏含有AAD-1和与草甘膦耐受性的CP4常规杂交的PAT的分子叠 加。