一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂及制备方法

摘要

本发明提供一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂及制备方法，从产妇自身脐带血干细胞中提取干细胞活性成分，从产妇自身娩出的胎盘中提取胎盘活性成分，配置成复合生物制剂，用于产妇自身使用，促进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛疤祛斑的目的。

说明书

技术领域

本发明提供一种用于皮肤美容修复的复合生物制剂，用于皮肤美容修复，护肤祛疤祛斑以及产妇的皮肤恢复，属于生物皮肤护理技术领域。 

背景技术

目前，很多产妇在怀孕期间会伴随面部色斑、肥胖、内分泌失调等问题，生产后还会遇到性冷淡、子宫恢复障碍、哺乳后胸部下垂、妊娠斑等问题。妊娠斑是由于孕期脑垂体分泌的促黑色素细胞激素增加，以及大量孕激素、雌激素，致使皮肤中的黑色素细胞的功能增强之故；妊娠纹是随着孕妇妊娠子宫的逐渐增大和肾上腺皮质于妊娠期间分泌可分解弹力纤维蛋白的糖皮质激素增多，使弹力纤维变性，加之孕妇腹壁皮肤张力增大，使皮肤的弹力纤维断裂，呈多量紫色或淡红色不规律平滑略凹陷的条纹。随着年龄的增长，表皮干细胞越来越少，所以妊娠斑很难靠自身表皮干细胞恢复。 

相关研究表明，产妇自身分娩产生的脐血和胎盘具有自我更新和分化潜能的细胞能力，不仅能在体外高度增殖，还可定向诱导形成各种类型的人体组织细胞。胎盘含有激素、细胞因子等多种生物活性物质，具有抗氧化，抗衰老和免疫调节等功能，是珍贵的药物和保健品原料，胎盘俗称衣胞或胞衣，中医称为紫河车。其味咸，性温，具有补气养血，益精之功效。然而，产妇在生产时自身的脐带血和胎盘往往却被当做废物抛弃了。 

根据产妇自身分娩产生的脐血活性成分和胎盘活性成分不存在配型、伦理等问题，避免外来血源的生物美容产品可能引起的过敏反应，有良好的应用前景和可操作性。 

所述的产品含有产妇分娩产生的脐带血干细胞活性成分，干细胞活性成分含量为1-40%，含有产妇生产时娩出的胎盘活性成分3-15%。本发明是从产妇自身脐带血干细胞中提取干细胞活性成分，从产妇自身娩出的胎盘中提取胎盘活性成分，用于产妇自身。促进试用者表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛疤祛斑的目的。本发明还提供了上述复合生物制剂的制备方法。含有产妇脐带血干细胞组合因子和产妇自身分娩产生的胎盘的活性成分，属于医学美容技术领域。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种皮肤美容修复的复合生物制剂，由产妇分娩产生的脐带和胎盘为原料制备而成，具有自身特异性使用，具有专属性，避免交叉感染等优点。 

本发明还提供了上述复合生物制剂的制备方法，适用于工业化生产。 

本发明的技术解决方案如下：从产妇自身脐带血干细胞中提取干细胞活性成分，从产妇自身娩出的胎盘中提取胎盘活性成分，配置成复合生物制剂，用于产妇自身使用，促进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛疤祛斑的目的。 

本发明提供的皮肤美容修复的复合生物制剂，主要由以下原料按重量份数比制成的（本文简称：本发明活性成分）： 

脐带血干细胞活性物3-15、干细胞活性物1-40。

上述的复合生物制剂，其特征在于： 

所述干细胞活性物是从产妇自身分娩产生的脐血中提取的。

所述胎盘活性物是从产妇自身分娩产生的胎盘中提取的。 

本发明上述的复合生物制剂，还含有以下物质： 

成纤维细胞生长因子0.05~0.1、表皮细胞生长因子0.05~0.1、SOD3~7。

本发明公开的用于产后皮肤修复的复合生物制剂的制备方法，包括以下步骤：

一、脐带血干细胞活性物的制备：

1）脐带血干细胞的培养

取健康的脐带血加入PBS稀释1倍，用吸管吹打混匀，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的脐带血，2000rpm离心20分钟；将分层中间白色云雾状的淋巴细胞层缓慢吸出，加入5ml PBS，1000rpm离心5分钟，离心后弃上清，加入10ml PBS，混匀，重复离心一次；弃上清，加入10%胎牛血清的α-MEM培养基20ml，混匀后置于100cm²的培养瓶中，37℃，5%CO₂培养；

2）细胞传代扩增

步骤1）的细胞生长到80-90%培养瓶底时，吸出培养基，加入5ml PBS冲洗，吸出PBS，加入2ml胰酶，37℃消化3分钟，加入2ml含20%胎牛血清的α-MEM培养基，中和胰酶，吸出中和液，放入50ml离心管中，加入20ml PBS，1000rpm离心5分钟，离心后去上清，加入10ml PBS，混匀，重新离心一次，细胞计数，每瓶加入2×10⁵细胞，置入100cm²的培养瓶中，37℃，5%CO₂培养；

3）干细胞活性物的制备

将步骤2）取培养的干细胞消化计数1×10⁷ 个，PBS洗涤3次，溶于30ml生理盐水中，超声破碎细胞，超声时间10秒，间隔时间5秒，超声强度4，超声次数5；使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出，4℃离心，1000rpm 10分钟离心后取上清，去掉细胞碎片，超滤膜浓缩，滤膜孔径50K，去掉免疫球蛋白，取过滤液，调至30ml，用0.22μm的滤膜过滤无菌，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得A液；

取步骤2）培养细胞用的测培养基的PH值为5.5时的上层培养液30ml，用30K超滤膜过滤，使其体积浓缩至5ml左右取出，加入5ml生理盐水，定容至10ml；用0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测蛋白浓度，定浓度为200μg/ml，4℃保存，得B液；

按1:1比例将A和B液混合，得到脐带血干细胞活性物；

二、胎盘活性物的制备：

4）胎盘活性物质的抽提

取新鲜胎盘用生理盐水反复漂洗，除尽淤血，绞碎，加甘油水溶液于低温下浸泡24小时，吊滤，取清液调pH值为4.5-5.5后，加0.5-12%明矾，静置过夜；取上清液，超滤，收集滤过部分，过SephadexG-75凝胶柱，收集活性成分，再次过滤，收集滤过部分，用灭菌甘油水溶液稀释至浓度为20%-50%，即成抽提液，得C液；

5）蛋白水解液的制备

取步骤4）液后的沉淀部分加6倍重量蒸馏水，调pH值至7.8-8.1，温度控制在45℃左右，加胰酶，酶用量1：250，酶解4小时，每间隔1小时取水解液测氨基酸含量，加温煮沸，调pH至3，转入高压锅内，继续高温水解6小时，冷却后调pH至6，抽滤除去沉淀，收集清液即为蛋白质水解液，得D液；

上述C液和D液按1:（2.5~3.5）比例即成胎盘活性物；

6）将上述步骤制备的脐带血干细胞活性物、胎盘活性物按比例与常规化妆品的赋形物混合制成皮肤美容修复的复合生物制剂。

所述复合生物制剂，包括针剂、面霜、乳液、水液、或常用化妆品的各种形态，已经按照用途分类的护肤及美容的各类产后美容产品，包括但不限于清洁霜、清洁皂、清洁乳、面膜、化妆水、按摩膏、乳液、营养霜、美容霜、粉底或粉饼等。 

所述的皮肤美容修复的复合生物制剂，主要是由以下原料按重量份数比制成的： 

脐带血干细胞活性物3~15、干细胞活性物1~40、培养基25~55、

成纤维细胞生长因子0.05~0.1、表皮细胞生长因子0.05~0.1、SOD3~7。

所述的皮肤美容修复的复合生物制剂，是由以下原料按重量份数比制成的： 

羊毛醇3~5，白蜂蜡3~5，鲸蜡10~15，硼砂0.5~1.2，去离子水50~80，

脐血干细胞活性物3~15，胎盘活性物1~40，培养基25~55、SOD3~7、

成纤维细胞生长因子0.05~0.1、表皮细胞生长因子0.05~0.1。

所述的皮肤美容修复的复合生物制剂，是由以下原料按重量份数比制成的： 

称取羊毛醇5g，白蜂蜡3g，鲸蜡10g，硼砂0.5g，去离子水50ml，脐血干细胞活性物15g，胎盘活性物40g，培养基55g、成纤维细胞生长因子0.08g、表皮细胞生长因子0.08g、SOD5g，其生产按常规的霜类化妆品方法制备即得。

本发明涉及上述复合生物制剂产品在美容护肤方面的用途，包括产妇产后除皱、美白、祛斑、修复妊娠斑等。 

新陈代谢是人体生命活动的基本形式，细胞则是生命活动的基本单位，而干细胞的增殖和分化构成了组织修复和再生的基础。因此表皮干细胞在皮肤新陈代谢中发挥重要作用。通过调节表皮干细胞的代谢状态，可以达到皮肤美白、祛斑、修复疤痕等方面的作用，这正是本制剂的作用机制。 

干细胞复合因子能够促进表皮干细胞的增殖，促进皮肤的新陈代谢，皮肤细胞生命活动增强，细胞物质成分的运输频繁，从而促进其他美容成分的吸收，这也是本产品优越与其他产品的不同之处。 

本发明的积极效果在于：对皮肤细胞具有良好的促进作用，可以加快细胞新陈代谢，具有除皱美白祛斑祛疤的功效，并能够保持皮肤弹性，恢复皮肤自然青青；同时，由于本发明产品从根源上减少了生物制品中的过敏源，使得能够最大限度地降低使用人群对美容产品的过敏反应。特别是对产妇具有良好的相容性，更易于被吸收。 

附图说明

图1、本发明活性成分提取液对表皮成纤维细胞生长的影响； 

图2、本发明受试产妇美白去皱作用评价；

图3、本发明受试产妇修复剖腹产疤痕作用评价；

图4~图6、为本发明受试者祛剖腹产疤痕和祛妊娠纹对比照片；

图7~图14为本发明受试者祛斑祛皱美白前后对比照片。

具体实施方式：

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：

1、脐带血干细胞活性物的制备

1）脐带血干细胞的培养：

取脐带血5ml，血型化验、记录、五项检测（甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病）加入PBS5ml，稀释1倍，用吸管吹打混匀，取50ml离心管加入10ml淋巴细胞分离液，缓慢加入稀释的干细胞悬液；2000rpm离心20分钟；离心后可见明显分层中间白色云雾状的一层为淋巴细胞层，将其缓慢吸出，加入5ml PBS，1000rpm离心5分钟，离心后弃上清，加入PBS10ml，混匀，重复离心一次；弃上清，加入10%胎牛血清的α-MEM培养基20ml，混匀后置于100cm²的培养瓶中，37℃，5%CO₂培养。

2）细胞传代扩增： 

细胞生长到80-90%培养瓶底时，吸出培养基，加入5mlPBS冲洗，吸出PBS，加入2ml胰酶，37℃消化3分钟，加入2ml含20%胎牛血清的α-MEM培养基中和胰酶，吸出中和液，放入50ml离心管中，加入20mlPBS，1000rpm离心5分钟，离心后去上清，加入PBS10ml，混匀，重新离心一次，细胞计数，每瓶加入2×10⁵细胞，置入100cm²的培养瓶中，37℃，5%CO₂培养。

3）干细胞活性成分的制备： 

将干细胞消化计数1×10⁷PBS洗涤3次，溶于30ml生理盐水中，超声破碎细胞：超声时间10秒，间隔时间5秒，超声强度4，超声次数5；使细胞内的蛋白及营养成分充分溶出，4℃离心，1000rpm10分钟离心后取上清，去掉细胞碎片，超滤膜浓缩，滤膜孔径50K，去掉免疫球蛋白，取过滤液，调至30ml，用0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，定浓度为200μg/ml，4℃保存，标记为A液。

细胞长到最旺盛时，测培养基（IMDM）PH值为5.5，取上层培养液30ml，用30K超滤膜过滤，使其体积浓缩至5ml左右取出，加入5ml生理盐水，定容至10ml；用0.22μm的滤膜过滤，使其无菌，测蛋白浓度，定浓度为200μg/ml，4℃保存，标记为B液。 

按1:1比例将上述A和B液混合，得到脐带血干细胞活性物。 

、胎盘生物活性物质制备方法：

1）活性物质的抽提：

取新鲜胎盘，用生理盐水漂洗除尽淤血，绞碎，加甘油水溶液于低温下浸泡24小时，吊滤，取清液调PH值后，加0.5-12%明矾，静置过夜。取上清液，在4个大气压1cm²下超滤，收集滤过部分，过SephadexG-75凝胶柱，收集活性成分，再次过滤，收集滤过部分，用灭菌甘油水溶液稀释至一定浓度即成抽提液，称之为c液。

2）蛋白水解液的制备： 

取上述吊液后的沉淀部分，采用酶-酸联合水解。取沉淀加6倍重量蒸馏水，调PH值至弱碱性，温度控制在45℃左右，加胰酶，酶用量1:250.酶解4小时，每间隔1小时取水解液测氨基酸含量，加温煮沸，调PH至3左右，转入高压锅内，再继续高温水解6小时，冷却后调PH至6左右，抽滤除去沉淀，收集清液即为蛋白质水解液，称之为d液。

上述C液和D液按1:（2.5~3.5）比例即成胎盘活性物。 

实施例2

称取羊毛醇5g，白蜂蜡3g，鲸蜡10g，硼砂0.5g，去离子水50ml，脐血干细胞活性物15g，胎盘活性物40g，培养基（IMDM）55g、成纤维细胞生长因子0.08g、表皮细胞生长因子0.08g、SOD5g，其生产按常规的霜类化妆品方法制备即得。

实施例3

称取羊毛醇3g，白蜂蜡3g，鲸蜡15g，硼砂0.8g，去离子水70g，脐血干细胞活性物10g，胎盘活性物25g，培养基(IMDM) 40g、成纤维细胞生长因子0.1g、表皮细胞生长因子0.1g、SOD 3g，其生产按常规的霜类化妆品方法制备即得。

实施例4

称取羊毛醇5g，白蜂蜡5g，鲸蜡15g，硼砂1.2g，去离子水80g，脐血干细胞活性物10g，胎盘活性物10g，培养基（IMDM）25g、成纤维细胞生长因子0.05g、表皮细胞生长因子0.05g、SOD 7g,，其生产按常规的霜类化妆品方法制备即得。

实施例5

称取羊毛醇5g，白蜂蜡4g，鲸蜡10g，硼砂1.0g，去离子水50g，脐血干细胞活性物15g，胎盘活性物25g，培养基（IMDM）40g、成纤维细胞生长因子0.1g、表皮细胞生长因子0.1g、SOD 5g，其生产按常规的霜类化妆品方法制备即得。

试验例1

一、本发明活性成分对成纤维细胞生长的影响

实施方案：皮肤成纤维细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板，6复孔接种，分为：空白对照组a、培养基阴性对照组b、干细胞活性成分组c、胎盘活性成分d组、本发明制剂组e五组。共接种7块96孔相同的培养板，观察7天，每天检测一块板。空白对照组加PBS液200μl，阴性对照组为成纤维细胞培养液，实施例1制备的干细胞活性物和胎盘活性物都按3:1比例添加培养液中。第二天开始检测，第一板加入MTT20μl/孔（5mg/ml)，4小时后加入DMSO，测细胞生长数，观察细胞的生长状况。其中的成纤维细胞培养液为含10%胎牛血清的α-MEM培养基。参见图1，从图1可以看出，单纯使用脐血干细胞活性成分的b线和单纯使用胎盘活性成分的c线代表的细胞增殖速度比d线快，联合应用脐血干细胞活性成分和胎盘活性成分的a线代表的细胞增殖速度最快，大约是阴性对照组的2倍。

结论：加入本发明的干细胞活性成分和胎盘活性成分对皮肤成纤维细胞的生长起促进作用，此作用加快了细胞的新陈代谢，对皮肤的年轻化起来重要作用，也就是本发明活性成分具有更好的修复皮肤成纤维细胞，延缓老化的作用。 

二、本发明活性成分的稳定性试验：

取本发明复合生物制剂分别置于37℃温箱和4℃冰箱及室温中分别放置不同时间后取样，进行活性测定。

实施方案：皮肤成纤维细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板，6复孔接种，分为：空白对照组、培养基阴性对照组、本发明活性成分分别为37℃温箱保存组、4℃冰箱保存组及室温保存组五组；共同培养7天。空白对照组加PBS液200μl，阴性对照组为成纤维细胞培养液，实施例1制备的干细胞活性成分和胎盘活性成分都按3:1比例添加培养液中；第8天开始检测，加入MTT20μl/孔（5mg/ml)，4小时后加入DMSO，测细胞生长数，观察细胞的生长状况。其中的成纤维细胞培养液为含10%胎牛血清的α-MEM培养基。 

本发明活性成分以不同温度不同存放时间对成纤维细胞生长增殖的影响与第0天保存共培养7天的对成纤维细胞生长增殖影响的比值为检测依据。结果见表1。 

  

从表1可以看出，本发明活性成分在37℃、4℃、室温下放置至180天时，其活性未见明显变化。结果表明，本本发明活性成分可在室温和4℃下保存长达180天，如置于37℃温箱保存更优。

试验例2

    用实施例2~5制备的复合生物制剂进行美白去皱对比试验，同时观察其对皮肤的刺激性过敏性及不良反应。

采用单盲法，即受试者对产品成分不知情，将受试产妇随机分组，分别为普通面霜组(a)，添加脐血干细胞活性成分组(b)，添加胎盘活性成分组(c)，本发明制剂组(d)。每组10人，受试者每日早晚面部涂抹本发明制剂2次，每3日对产品效果进行一次评价，美白去皱综合评分分为三个等级分别为效果不明显（0-3分），效果一般（4-6分），效果显著（7-10分）。一个月后对总体效果进行分数评价，结果见图2。 

结论：从图2可以看出使用添加脐血干细胞活性成分和胎盘活性成分的面霜前后皮肤变化显著，使用后皱纹明显减少，面部皮肤变白，皮肤色泽变亮。未发现本复合制剂对皮肤有刺激性，有1人有轻度过敏、发痒现象。 

试验例3

用实施例2~5制备的复合生物制剂进行修复剖腹产疤痕对比试验，同时观察其对皮肤的刺激性过敏性及不良反应。

采用单盲法，即受试者对产品成分不知情，将受试产妇随机分组，分别为单纯营养液组(a)，添加脐血干细胞活性成分组(b)，添加胎盘活性成分组(c)，本发明制剂组(d)。每组10人，受试者每日早晚在剖腹产刀口部位涂抹本发明制剂2次，每3日对产品效果进行一次评价，疤痕修复综合评分分为三个等级分别为效果不明显（0-3分），效果一般（4-6分），效果显著（7-10分），一个月后对总体效果进行分数评价。图3~图6为挑选3位试用者的祛剖腹产疤痕和祛妊娠纹对比照片。 

结论：本发明可以用于产妇自身使用，促进产妇表皮干细胞的代谢，从而实现美容修复，护肤祛疤祛斑的目的。 

试验例4

使用本发明实施例2~5制备的复合生物制剂进行祛斑祛皱美白美容效果对比试验，同时观察其对皮肤的刺激性过敏性及不良反应。

入选志愿者80例，受试者每日早晚按常规的护肤方法面部涂抹本发明制剂2次，试验期限为3个月，统计学结论有效72例；显效6例；无效2例，未发现本发明复合制剂对皮肤有刺激性。图7~图14为挑选8位试用者的祛斑祛皱美白前后对比照片； 

结论：使用本发明制剂前后皮肤的斑皱及美白效果变化显著，具有很好的祛斑祛皱美白作用。