冷冻保存无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质

摘要

本发明涉及冷冻保存无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质。更详细地，涉及以甘油及基本溶液为基本成分，在其中添加蔗糖，从而制得冷冻保护剂，然后利用该溶液对去除了表皮及真皮内细胞的皮肤组织进行冷冻保存处理的方法以及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质。

说明书

技术领域

本发明涉及冷冻保存无细胞真皮基质(acellualr dermal matrix， ADM)的制备方法及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质。更详细 地，涉及以甘油及基本溶液为基本成分，在其中添加蔗糖，从而制得 冷冻保护剂，然后利用该溶液对去除了表皮及真皮内细胞的皮肤组织 进行冷冻保存处理的方法以及由其制备的冷冻保存无细胞真皮基质。

背景技术

皮肤是覆盖整个人体表面的最大器官，其防止体液的流失，以及 防止有害物质和微生物侵入，抵御来自物理、化学方面的刺激等，执 行保护我们身体的功能。对于因严重的烧伤、外伤、上皮癌切除及皮 肤疾病等而使皮肤严重受损的患者，应起到阻止受损部位感染及体液 损失的保护膜的作用，同时应使患者的伤口部位不留下疤痕，防止在 自然愈合过程中可能发生的严重收缩。用于使受损的皮肤组织再生的 方法有以下三种：移植患者自身皮肤的自体移植(autograft)、移植他 人皮肤的同种异体移植(allograft)及移植动物皮肤的异种移植(xen  ograft)。这些方法中自体移植最为理想，但烧伤部位范围大的情况下， 能够确保组织的部位有限，在取皮部位还会留下新的伤口，因此存在 困难。同种异体移植与其说起到永久移植的作用，不如说起到有助于 伤口周围区域的细胞移动和愈合的作用。

特别是在表皮层、真皮层直至皮下层受损的3度烧伤的情况下， 必须要进行皮肤移植治疗。现在主要采用的皮肤移植治疗方法为自体 移植方法，由于在摘除了皮肤的健康部位产生新的外伤，因此增加了 患者的痛苦，需要很长时间痊愈，并且经济负担也大。此外，如严重 的烧伤患者没有足够的身体健康部位的情况下，存在无法采用自体移 植方法或需要进行多次移植手术的问题。人们试图采用他人皮肤的同 种异体移植或采用猪等其它动物皮肤的异种移植等来解决上述问题， 但这样不仅会发生免疫排斥反应，有时还会带来其它副作用。

因此，国内外医院实施的烧伤手术最普遍的情况为：先将坏死的 表皮层和真皮层去除，然后利用捐赠者尸体的皮肤，去除表皮后，利 用去除了真皮内细胞的无细胞真皮进行皮肤移植，以消除免疫排斥反 应。之后培养的角质细胞在其上完成完整的皮肤。这样完成的皮肤含 有基膜层，因此能够像实际皮肤一样起到保护我们身体的作用，防止 外界有害物质的进入。但是这种用于移植的皮肤价格非常昂贵，并且 大部分为进口产品，存在供需不畅的问题。利用捐赠者尸体的皮肤， 去除表皮后，为了便于保存，对去除了真皮内细胞的无细胞真皮基质 进行冷冻后再使用的情况较多，以消除免疫排斥反应，但在冷冻过程 中无细胞真皮内的胶原蛋白组织被破坏，存在移植后分解速度快的问 题。

发明内容

本发明要解决的技术问题

因此，本发明的目的在于，提供一种新的冷冻保存无细胞真皮基 质的制备方法，并以此作为技术课题，该方法在对用于移植的皮肤进 行加工时，与现有的方法相比，能够更加有效地提高组织的稳定性， 维持细胞外基质(extracellular matrix)的结构不受到损伤。

解决技术问题的技术手段

为了实现上述目的，本发明提供冷冻保存无细胞真皮基质的制备 方法，其包括下列步骤：

i)去除同种异体皮肤的表皮；

ii)去除真皮内细胞；

iii)将甘油与选自缓冲溶液及动物细胞培养基的基本溶液进行混 合；

iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖最终浓度达到20～40重量％， 从而制得冷冻保护剂；

v)将上述去除了表皮及真皮内细胞的皮肤用上述冷冻保护剂浸 透；

vi)将浸透了冷冻保护剂的皮肤在程序冷冻仪中冷冻。

本发明还提供自体移植替代物，其含有由上述方法制备的冷冻保 存无细胞真皮基质。

下面，详细说明本发明。

在本发明中，对同种异体皮肤去除表皮后再去除真皮内细胞，以 消除免疫排斥反应。去除表皮及真皮内细胞可采用本领域公知的多种 方法实施，没有特别的限制。去除表皮时，可使用例如胰蛋白酶(tr  ypsin)、胶原酶(collagenase)或分散酶(dispase)等酶或NaCl溶液 进行处理。去除真皮内细胞时，可使用例如曲拉通X100(Triton X1 00)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或十二烷基硫酸钠(sodi  um dodecylsulfate，SDS)等进行处理。

本发明的冷冻保护剂使用甘油及基本溶液作为基本成分。本发明 的基本溶液指的是制备冷冻保护剂时作为基础(base)的溶液，可以 使用处理动物细胞时使用的缓冲溶液或动物细胞培养基。本发明的缓 冲溶液只要是本领域对动物细胞处理时所使用的缓冲溶液即可，没有 特别的限制。本发明可使用的缓冲溶液例如有磷酸缓冲溶液 (phosphate buffered saline，PB S)、Tris缓冲盐溶液(Tris-buffered  saline，TBS)、柠檬酸缓冲溶液(citric acid buffer)等，但不限于此。 本发明的动物细胞培养基可使用本领域公知的任意的培养基。本发明 可使用的动物细胞培养基例如有MEM(最小必需培养基(Minimum  Essential Media))、DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s  Modified Eagle Media))、RPMI1640、IMDM(伊思考夫改良杜尔贝 可培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Media))、特定角化细胞无血 清培养基(Defined Keratinocyte-SFM(不含BPE))、角化细胞培养基 (Keratinocyte-SFN(含BPE))、敲除D-MEM(Knock-Out D-MEM)、 AmnioMAX-II完全培养基(AmnioMAX-II Complete Medium)及 AmnioMAX-C100完全培养基(AmnioMAX-C100Complete Medium) 等，但不限于此。本发明的甘油及基本溶液以重量计，优选以0.5～3.5∶ 9的混合比来使用，更优选为0.8～2∶9，最优选为1∶9。如果本发明 的甘油混合比小于0.5的情况下，会有冷冻时因冻伤引起的问题，大 于3.5的情况下，会在冷冻后诱发组织的变性。

本发明的冷冻保护剂是在上述甘油及基本溶液进行混合的溶液 中，溶解蔗糖(sucrose)，使其最终浓度达到20～40重量％，从而制 得。在本发明的冷冻保护剂中添加蔗糖，起到了保护其免受冷冻细胞 膜和细胞膜蛋白质时出现的冰晶的影响并使其稳定的作用。因此，根 据本发明的方法制得的冷冻保存无细胞真皮基质能够提高其组织稳 定性，采用甘油、基本溶液及蔗糖的理想混合比，能够使真皮组织的 稳定性得到更大的提高，能够维持细胞外基质的结构不受到损伤。本 发明的冷冻保护剂中的蔗糖浓度小于20重量％的话，冷冻时会因冰 晶的影响降低组织的稳定性等，如果大于40重量％，会因高浓度的 糖成分使冷冻干燥后组织中生成糖结晶，这会给组织的安全性带来影 响。本发明的冷冻保护剂在混合有上述基本溶液的溶液中优选以最终 浓度为25至35重量％来溶解蔗糖，最优选以30重量％进行溶解，从 而制得。

本发明中，在皮肤组织中浸透冷冻保护剂可以使用本领域公知的 多种方法，优选在低温反应器中，使冷冻保护剂浸透皮肤。浸透所需 的时间根据皮肤组织的大小等而有所不同，例如在4℃的低温反应器 中，可以浸透约6～24小时。

本发明中浸透了冷冻保护剂的皮肤可以使用温度可控的程序冷 冻仪(controlled rate freezer)进行冷冻。冷冻时使用温度可调节的 程序冷冻仪能够以期望的速度冷冻皮肤。本发明中使用温度可调节的 程序冷冻仪来冷冻皮肤的速度优选为-0.1℃/min至-7℃/min，更优选 为-0.5℃/min至-5℃/min，进一步优选为-0.8℃/min至-3℃/min，最优 选为-1℃/min。本发明进行冷冻时，冷冻速度低于-0.1℃/min，冷冻过 慢的情况下，由于组织内的溶质多于组织外的溶质，因此冷冻速度降 低会使冷冻温度慢慢降低，组织外先形成大块的冰晶，从而会破坏组 织。并且，由于浸透了冷冻保护剂的皮肤的温度和程序冷冻仪腔室的 温度不能够相同，由于从发生潜在熔化热的温度区域急速冷冻至没有 水分子运动的-80℃温度，使速度大于每分钟-7℃因此若不能够调节潜 在熔化热，则会发生冰晶现象，使组织破坏。

发明的效果

根据本发明的方法制备的冷冻保存无细胞真皮基质的组织稳定 性高，能够维持细胞外基质(extracellular matrix)结构及基底膜(b  asement membrane)不会受到损伤，因此能够有效用作自体移植的替 代物。

附图说明

图1为示出用扫描电子显微镜对实施例及比较例的无细胞真皮 基质分别放大60倍及150倍拍摄的照片。(A：比较例，60X；B：比 较例，150X；C：3实施例，60X；D：实施例，150X)

图2为示出将实施例及比较例的无细胞真皮基质进行H&E染色 后，用光学显微镜分别放大100倍及200倍后拍摄的照片。(A：比 较例，100X；B：比较例，200X；C：实施例，100X；D：实施例， 200X)

图3为对使用蔗糖最终浓度分别为10、15、20、25、30、35及 40重量％的冷冻保护剂处理后的冷冻保存无细胞真皮基质，进行胶原 蛋白水解酶的分解性测定的结果图。(P.C.(阳性对照，positive cont  rol)：对胶原蛋白粉末用胶原蛋白水解酶进行处理；N.C.(阴性对照， negative control)；不进行胶原蛋白水解酶处理；D.W.：蒸馏水)

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细说明本发明。但这些实施例仅是为了 例示本发明，并不能限制本发明的范围。

由于捐赠者(尸体)的人体皮肤组织的应用受到限制，因此使用 了接近人体皮肤的猪皮，根据下述实施例及比较例的方法分别制备了 10份。

实施例

使用猪皮按照下述步骤准备冷冻保存皮肤。

(1)用生理盐水洗净猪皮。

(2)将猪皮分别切成5×10cm²的大小。

(3)在1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中分别加入猪皮。

(4)准备38℃的反应器(P-039，KoaTech)。

(5)将置于1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中的猪皮在38℃ 的反应器中进行约6至24小时的搅拌反应。

(6)利用医用镊子去除表皮。

(7)用磷酸缓冲溶液(pH7.2，GIBCO，美国)清洗去除了表皮 的真皮。

(8)将清洗后的真皮放入0.1％的SDS中，在常温下搅拌反应1 小时，从而去除真皮内细胞。

(9)用磷酸缓冲溶液清洗去除了细胞的真皮。

(10)将甘油(Sigma，美国)及磷酸缓冲液以1∶9的重量比进 行混合。

(11)在(10)的混合溶液中溶解蔗糖(Sigma，美国)，使最终 浓度达到30％，从而制得冷冻保护剂。

(12)准备4℃的低温反应器(P-039，KoaTech)。

(13)在4℃的低温反应器中放入(9)的猪皮，然后在冷冻保 护剂中浸透12小时。

(14)将浸透好的猪皮放入聚酰胺袋(低温包装袋(CryoBag)， 奥利金(Origen)，美国)中。

(15)准备程序冷冻仪(14S-A，SY实验室，美国)。

(16)将(14)的聚酰胺袋放入程序冷冻仪中，以-1℃/min的速 度冷冻至-150℃。

(17)冷冻结束后，直至分析实验前，将聚酰胺袋冷冻保存于绝 热包装(Dry shipper)中。

比较例

使用猪皮按照下述步骤准备冷冻干燥皮肤。

(1)用生理盐水洗净猪皮。

(2)将猪皮分别切成5×10cm²的大小。

(3)在1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中分别加入猪皮。

(4)准备38℃的反应器(P-039，KoaTech)。

(5)将置于1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中的猪皮在38℃ 的反应器中进行搅拌反应约6至24小时。

(6)利用医用镊子去除表皮。

(7)用磷酸缓冲溶液清洗去除了表皮的真皮。

(8)将清洗后的真皮放入0.1％的SDS中，在常温下搅拌反应1 小时，从而去除真皮内细胞。

(9)用磷酸缓冲溶液(pH7.2，GIBCO，美国)清洗去除了细胞 的真皮。

(10)将甘油(Sigma，美国)及磷酸缓冲液以1∶9的重量比进 行混合，从而制得冷冻保护溶液。

(11)准备4℃的低温反应器(P-039，KoaTech)。

(12)在4℃的低温反应器中放入(9)的猪皮，然后浸透冷冻 保护剂12小时。

(13)将浸透好的猪皮放入高密度聚乙烯合成纸袋(Tyvek bag， 高丽新材料，韩国)中。

(14)准备冷冻干燥器(Genesis 25XL，VirTis，美国)。

(15)将(13)的高密度聚乙烯合成纸袋放入冷冻干燥器中，以 -1℃/min的速度冷冻至-70℃，在真空5torr的冷冻干燥器中干燥 24小时，从而制得冷冻干燥的无细胞真皮基质。

(16)冷冻干燥结束后，放入E.O.气体灭菌器(HS-4313EO，H anshin Medical，韩国)中进行灭菌。

(17)将灭菌的冷冻干燥无细胞真皮基质放入铝袋中进行密封， 在常温下保存直至实验前。

实验例1组织学鉴定

按照下述方法，对上述实施例及比较例准备的猪皮进行H&E染 色。

(1)将石蜡块切成4μm厚，然后对其进行干燥，制成石蜡切片。

(2)实施脱蜡过程，在二甲苯中反应3次，每次5分钟；在10 0％乙醇中反应3次，每次2分钟；在90％的乙醇中反应1次，1分钟； 在80％乙醇中反应1次，1分钟；在70％乙醇中反应1次，1分钟； 之后用流动的水清洗10分钟。

在苏木精(Hematoxylin)染色液中反应10分钟，然后用流动的 水清洗3分钟，在伊红(Eosin)染色液中反应10分钟，然后用流动 的水清洗，直至没有伊红染色液流出。在70％乙醇中反应10次，每 次1秒；在80％乙醇中反应10次，每次1秒；在90％乙醇中反应10 次，每次1秒；在100％乙醇中反应2次，每次1分钟；在二甲苯中 反应3次，每次3分钟；然后用封固(mounting)溶液进行封固。

为了使用扫描电子显微镜对上述实施例及比较例准备的猪皮进 行观察，实施如下。

(1)将试样在2.5％的戊二醛(glutaraldehyde)溶液(固定液， Fixative solution)中进行2小时预固定，然后使用0.1M的磷酸缓冲 溶液清洗后，用1％的OsO₄溶液进行后固定。

(2)按照乙醇浓度增加的顺序进行脱水/取代，在-190℃的液氮 内进行冷冻切断，使试样的截面露出，然后利用临界点干燥机(HCP -2)使试样完全干燥。

(3)使露出的试样的截面朝上并附着在铝支架(Stub)(试样固 定台)上，在金属离子涂布装置(E-1030离子溅射(Ion sputter)) 中用Pt-Pd实施约10nm厚的金属涂布。

(4)用扫描电子显微镜(Hitachi S-4700，日本)进行观察及摄 影。

用光学显微镜(Olympus BX51，H&E染色(staining))及扫描 电子显微镜(Hitachi S-4700，日本)对实施例及比较例的皮肤进行 摄影，如图1和2所示。

由图1和图2的结果可知，实施例中构成组织内真皮的胶原蛋白 的结构稳定性大大优于比较例。

并且，由图1和图2的显微镜照片中可以看出，实施例在冷冻过 程中引起的组织破坏显然要少于比较例。

即本发明的处理方法与现有的冷冻干燥处理方法相比，显示出了 高度的组织稳定性，能够提高由本发明的处理方法制备的无细胞真皮 的移植率，并且能够缩短治疗时间。

实验例2测定根据胶原蛋白水解酶的分解性

为了观察无细胞真皮基质的稳定性随蔗糖浓度差异的变化，按照 下述步骤测定了胶原蛋白分解酶的分解性。

(1)将25mg的试样添加到5mM的TES缓冲液中，并混匀， 所述5mM的TES缓冲液中混合有5ml的0.36mM的氯化钙(calciu  m chloride)。

(2)将0.1ml的0.1mg/ml的胶原蛋白酶(collagenase)添加到 (1)的试样中混匀，在37℃下反应1天。

(3)用4.0mM的L-亮氨酸标准溶液(L-leucine standard soluti  on)连续稀释(serial dilution)后，用茚三酮显色剂(ninhydrin col  or reagent)进行处理，在570nm下测定了吸光度(VERSA max，M  olecular Device，美国)并绘制了标准曲线。

(4)将(2)的试样用茚三酮显色剂处理，在570nm下测定了 吸光度。

(5)利用(3)的标准曲线计算出了各个试样所释放的L-亮氨酸 (L-leucine)的量。

上面计算得到的L-亮氨酸的释放量如图3所示。由图3可以看出， 使用蔗糖最终浓度为20至40重量％的冷冻保护剂进行处理的冷冻保 存无细胞真皮基质的组织稳定性高，并且通过胶原蛋白酶的水解速度 显著降低。