原油污染土壤复合微生物修复菌剂及其使用方法

摘要

原油污染土壤复合微生物修复菌剂及其使用方法，它涉及一种土壤微生物修复菌剂及其使用方法。它提供了一种原油污染土壤复合微生物修复菌剂及其使用方法。原油污染土壤复合微生物修复菌剂由载体、乳化剂和菌丝体混合而成。将原油污染土壤复合微生物修复菌剂均匀撒于被原油污染的土壤表层，即可实现原油污染土壤的修复。本发明用于土壤修复领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种土壤微生物修复菌剂及其使用方法。

背景技术

原油在生产、生活中起着重要作用，然而由于开采、运输、事故等的原因，越来越多的 原油进入土壤，造成土壤板结，严重影响了土壤的肥力，从而影响植物生长，并导致植物枯 萎死亡。

被原油污染的土壤一般采用物理、化学、生物方法进行修复。其中生物修复是近年来发 展起来的一项新兴技术。可利用微生物、动物以及植物等进行生物修复，生物修复具有污染 少、副作用小、见效快等优点。

发明内容

本发明要提供一种原油污染土壤复合微生物修复菌剂及其使用方法。可以更有效的修复 被原油污染的土壤，提高土壤中原油的降解率。

本发明原油污染土壤复合微生物修复菌剂按质量由100份载体、1份乳化剂和1.72份菌 丝体混合而成；

其中，载体按重量百分比由40％的锯末和60％的麸皮组成；菌丝体由青顶拟多孔菌 (Polyporellus picipes)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)和偏肿拟栓菌(Pseudotrametes  gibbosa)按1∶1∶1的质量比组成；乳化剂为吐温80。

上述原油污染土壤复合微生物修复菌剂按以下步骤使用：将原油污染土壤复合微生物修 复菌剂均匀播撒于被原油污染的土壤表层，或者在均匀播撒原油污染土壤复合微生物修复菌 剂之后翻耕被原油污染的土壤，即可实现原油污染土壤的修复。

本发明原油污染土壤复合微生物修复菌剂具有构成简单、容易制备，无污染的优点。由 于本发明原油污染土壤复合微生物修复菌剂所采用的微生物材料对人畜无害，对植物生长无 影响，而且降解原油的代谢产物为水和二氧化碳，无二次污染和副作用；是一种环保微生物 菌剂。

本发明原油污染土壤复合微生物修复菌剂的使用方法极为简单，且除油效果好、原油降 解率高。而且，具有使用灵活的特点，可根据实际情况调整原油污染土壤复合微生物修复菌 剂的用量。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组 合。

具体实施方式一：本实施方式原油污染土壤复合微生物修复菌剂按质量由100份载体、1 份乳化剂和1.72份菌丝体混合而成；

其中，载体按重量百分比由40％的锯末和60％的麸皮组成；

菌丝体由青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)和偏肿 拟栓菌(Pseudotrametes gibbosa)按1∶1∶1的质量比组成；乳化剂为吐温80。

本实施方式中的青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus) 和偏肿拟栓菌(Pseudotrametes gibbosa)经过固体扩大培养基培养和液体培养基培养后进行 过滤，再将过滤得到的三种菌丝体接种于载体和乳化剂的混合物上，即得到本实施方式原油 污染土壤复合微生物修复菌剂。

本实施方式中青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)和 偏肿拟栓菌(Pseudotrametes gibbosa)的固体扩大培养基每升由200～300g土豆浸出液、20g 葡萄糖、20g琼脂、3.0g KH₂PO₄、1.5g MgSO₄和余量的蒸馏水组成，自然pH。

本实施方式中培养青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus) 和偏肿拟栓菌(Pseudotrametes gibbosa)的液体培养基每升由20g麸皮浸出液、0.44g氯化铵、 0.2g KH₂PO₄、0.05g MgSO₄、0.01g CaCl₂、1.0g吐温80、1mL无机溶液、0.5mL维生素溶液 和余量的蒸馏水组成，自然pH；其中，无机溶液每升由3.0g MgSO₄·7H₂O、0.5g MnSO₄、1.0g NaCl、0.1g FeSO₄·7H₂O、0.1g CoSO₄、0.082g CaCl₂、0.1g ZnSO₄、0.01g CuSO₄·5H₂O、0.01g KAl(SO₄)₂、0.01g H₃BO₃、0.01g NaMoO₄和余量的蒸馏水组成；其中，维生素溶液每升由0.005g VB₁、0.005g VB₂、0.002g生物素、0.002g叶酸、0.01g VB₆、0.005g烟酸和余量的蒸馏水组成。

将青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)和偏肿拟栓菌 (Pseudotrametes gibbosa)接种于固体扩大培养基上，在25℃条件下培养7天；然后再分别 接种于液体培养基，再28℃、120r/min条件下培养9天。

青顶拟多孔菌(Polyporellus picipes)可以通过购买获得，可以通过中国微生物菌种网(隶 属于北京北纳创联生物技术研究院)购买，编号为5.49。

糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)可以通过购买获得，可以通过中国微生物菌种网(隶 属于北京北纳创联生物技术研究院)购买，菌号为CICC 50155。

偏肿拟栓菌(Pseudotrametes gibbosa)已在“偏肿拟栓菌Pseudotrametes gibbosa产漆酶 的条件优化”一文中公开，“偏肿拟栓菌Pseudotrametes gibbosa产漆酶的条件优化”刊登于 《菌物学报》，陈军、高大文、池玉杰、梁红，15 November 2008，27(6)：940-946。本发明发 明人高大文同意向公众提供该生物材料。

具体实施方式二：本实施方式原油污染土壤复合微生物修复菌剂按以下步骤使用：

将原油污染土壤复合微生物修复菌剂均匀播撒于被原油污染的土壤表层，或者在均匀播 撒原油污染土壤复合微生物修复菌剂之后翻耕被原油污染的土壤，即可实现原油污染土壤的 修复。

具体实施方式三：本实施方式播撒原油污染土壤复合微生物修复菌剂后保持被原油污染 土壤的湿度为40％±2％。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：采用喷水的方式保持原油 污染土壤复合微生物修复菌剂的湿度。其它步骤及参数与实施方式三相同。

实验一、原油污染土壤修复实验

1、制备原油污染土壤

将75g原油溶于600mL93#汽油，然后与1500g无油污染土壤混合均匀，放置通风橱中一 周左右，使石汽油挥发，得质量分数为4.920％～4.960％的原油污染土壤。其中，无油污染土 壤采集于东北林业大学林场，以自然风干，过10目筛；原油由大庆油田有限责任公司生产提 供。

2、土壤含油量的测定

(1)准确秤取0.1g原油于100mL容量瓶中，以93#汽油为溶剂溶解得标准油使用液，标准 油使用液中原油浓度为1mg/mL。分别取0mL、2mL、4mL、8mL、12mL、20mL和25mL标 准油使用液，放置于7个50mL容量瓶中，然后用汽油(93#)稀释至标线，并从每个50mL 容量瓶中抽取混合液倒入10mm石英比色皿中，以汽油为参比在紫外分光光度计上以波长430 nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，原油浓度为横坐标经空白校正后绘制标准曲线。

(2)土壤含油量

秤取3g左右的待测污染土壤溶于一定量的汽油(93#)，置于圆底烧瓶中，在电子调温电 热套中煮2h，待冷却后测量剩余汽油体积，在紫外波长430nm处用10mm石英比色皿，以 汽油做参比测量吸光度。

处理后含油量公式为：$C=\frac{V\times E\times N}{M\times ϵ}$

公式中：E为吸光度，

ε为消光系数(L/mg cm)，

V为处理后剩余汽油含量(mL)，

N为处理后污染土壤稀释倍数，

M处理前体系中秤取的油泥质量(g)。

降解率计算公式为：$D\%=\frac{C_0-C}{C_0}\times 100\%$

公式中：C₀为处理前含油量(mg/kg)，

C为处理后含油量(mg/kg)。

3、修复实验

将具体实施方式一原油污染土壤复合微生物修复菌剂分为6个实验组均匀撒于本实验所 制备的原油污染土壤表层，每组被修复原油污染土壤为1500g(每组原油污染土壤体积为 30cm×20cm×3cm)。

实验第一组中原油污染土壤复合微生物修复菌剂用量为1g，实验第二组中原油污染土壤 复合微生物修复菌剂用量为2g，实验第三组中原油污染土壤复合微生物修复菌剂用量为3g， 实验第四组中原油污染土壤复合微生物修复菌剂用量为1g，实验第五组中原油污染土壤复合 微生物修复菌剂用量为2g，实验第六组中原油污染土壤复合微生物修复菌剂用量为3g。

实验第一、二和三组不加水(实验20d后土壤湿度为20％左右)，实验第四、五和六组每 十天添加100mL左右蒸馏水，实验进行20天(实验过程中土壤湿度为40％左右)。土壤中原 油含量变化如表1所示，原油降解率如表2所示。

实验结果说明在干旱条件下(土壤湿度为20％左右)原油污染土壤复合微生物修复菌剂 低剂量使用组在短期具有降解速度快，降解率高，启动迅速的优点。

在湿润条件下(土壤湿度为40％左右)原油污染土壤复合微生物修复菌剂使用剂量基本 与降解速度和降解率成正比。

表1

表2

  实验第一组   实验第二组   实验第三组   实验第四组   实验第五组   实验第六组   10d   18.88％   15.68％   13.19％   17.64％   23.77％   26.23％   20d   22.70％   22.34％   15.76％   26.86％   32.34％   33.43％

实验进行到第50天，实验第一组土壤中原油含量为35.545g/kg，原油降解率为27.83％； 实验第二组土壤中原油含量为34.367g/kg，原油降解率为30.65％。实验第三组土壤中原油含 量为31.766g/kg，原油降解率为35.91％；实验第四组土壤中原油含量为30.213g/kg，原油降 解率为38.66％；实验第五组土壤中原油含量为30.283g/kg，原油降解率为38.89％；实验第六 组土壤中原油含量为29.503g/kg，原油降解率为40.47％。

如果要保证原油污染土壤复合微生物修复菌剂长期降解效果，需要定期向土壤表面喷撒 本发明具体实施方式一中的液体培养基。