大黄鱼头肾巨噬细胞分离和原代培养方法及其应用

摘要

一种大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型的构建技术，其特征是利用31％/45％梯度的Percoll水平离心分离鱼类头肾巨噬细胞，并在22℃条件下培养在每升含有50ml胎牛血清、10万UI青链霉素、5万UI肝素、10mmol4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和0.5g葡萄糖，pH为7.4的L15复合培养基中。本发明具有如下优点：(1)31％/45％的Percoll梯度离心分离的大黄鱼头肾巨噬细胞在所分离细胞中的比例高达42％；(2)经过夜培养后贴壁大黄鱼头肾巨噬细胞的纯度高达90％以上；(3)培养一周后的大黄鱼头肾巨噬细胞存活率在58％以上；(4)功能验证实验证实：LPS可以显著影响所培养的大黄鱼头肾巨噬细胞的吞噬功能和呼吸爆发活性。

说明书

技术领域

本发明属于细胞模型技术领域，具体涉及一种大黄鱼头肾巨噬细胞分离和 原代培养方法及其应用。

背景技术

大黄鱼(Larmichthys crocea)是中国特有的地方性鱼种，广泛分布于我国 近海海域。由于大黄鱼肉质细嫩、味道鲜美，倍受消费者的欢迎，是我国最重 要的海水经济鱼类之一。近十多年来，大黄鱼人工养殖得到迅速发展，养殖生 产规模不断扩大，已成为我国海水网箱养殖数量最大的鱼种之一。然而由于养 殖环境的污染以及养殖管理相对滞后，病害问题成为制约大黄鱼养殖业持续稳 定发展的主要因素。传统的治疗方法有化学药物治疗法和疫苗预防法，然而前 者存在病菌抗药性、药物残留以及污染环境等问题，后者存在疫苗特异性以及 操作局限性等缺点。在这种背景下发展了一门新兴学科——鱼类营养免疫学， 倡导通过营养调控来提高鱼类的免疫力。即调整饲料中营养素的比例以及种类， 或者在饲料中添加功能性营养素，从而维持鱼类免疫系统功能并使其免疫活性 得到充分发挥，其宗旨符合绿色养殖、健康养殖的理念。目前已有的研究已经 证明多种营养素可以显著改变鱼类非特异性免疫力以及鱼类对应激和胁迫环境 的抵抗力，是一种低成本、高效、环保的预防疾病方式。

鱼类细胞原代培养技术是指从鱼体内组织取出特定细胞，在体外模拟鱼体内 环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使细胞存活并维持其结 构和功能的一种培养技术。体外原代培养的细胞仍然保留部分甚至全部同在体 细胞一样的生理功能特性，细胞仍然保持高度的分化性以及功能性，因此，鱼 类原代细胞被认为可以取代鱼类活体开展部分生命科学研究。目前，鱼类原代 细胞培养技术已经广泛应用在鱼类遗传学、水产养殖和资源保护等方面。随着 学科的发展以及技术的进步，也逐渐应用于鱼类营养免疫学研究。分离鱼类特 定免疫细胞如头肾巨噬细胞，建立细胞体外模型，在离体条件下使营养素对免 疫细胞直接作用，从而可以快速、准确地发现营养素对细胞的免疫调控作用， 从而在实际生产中进行营养调控干预，减少由于病害带来的损失。但到目前为 止，有关大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型建立以及其在营养免疫学领域相关研究 的应用却未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种大黄鱼头肾巨噬细胞分离及其原代培养方法，并将 其应用于大黄鱼营养免疫研究，该技术可以弥补现有技术的不足。

本发明一个方面涉及一种大黄鱼头肾原代巨噬细胞的分离培养方法，首先用 31％/45％梯度的Percoll分离液分离出大黄鱼头肾巨噬细胞，再用L15复合细胞培 养基在20～25℃下对分离出的大黄鱼头肾原代巨噬细胞进行培养。

上述的Percoll分离液中31％/45％Percoll的体积百分数范围分别为35-55％和 45-65％。

上述的L15复合细胞培养基，其配方如下：每升培养基中含有50ml胎牛血 清、10万UI青链霉素、5万UI肝素、10mmol 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.5g葡萄 糖，pH为7.4。

本发明另一个方面涉及大黄鱼原代巨噬细胞的应用，是用于检测营养素对离 体细胞免疫力的影响。

本发明利用31％/45％的Percoll梯度离心分离的大黄鱼头肾巨噬细胞，所分 离出的细胞中大黄鱼头肾巨噬细胞的比例高达42％(图1)；经过夜培养后贴壁 大黄鱼头肾巨噬细胞的纯度高达90％以上(图2)，培养一周后的大黄鱼头肾巨 噬细胞存活率在58％以上。同时，本发明利用大黄鱼原代巨噬细胞来进行营养素 对免疫细胞影响的筛选，可以方便快捷的筛选出具有免疫功能的营养素，例如， 本发明中就证实LPS和维生素C可以显著影响所培养的大黄鱼巨噬细胞系的吞 噬功能和呼吸爆发活性。

说明书附图

图1：Percoll梯度离心技术分离的头肾巨噬细胞光镜照片，比例尺＝60μm；

图2：过夜培养后除去未贴壁细胞的贴壁细胞单层光镜照片，比例尺＝20μm；

图3：经瑞姬氏染色后的贴壁巨噬细胞光镜照片，比例尺＝10μm；

图4：大黄鱼头肾巨噬细胞透射电镜照片，比例尺＝2μm。

具体实施方式

本发明的大黄鱼原代头肾巨噬细胞系的分离和培养方法，首先利用 31％/45％浓度梯度的Percoll分离液，水平离心分离大黄鱼头肾巨噬细胞，并培养 在22℃条件下的复合L15培养基中。其中Percoll分离液由31％和45％的Percoll组 成，体积百分数范围分别为35-55％和45-65％。实施时将45％浓度梯度的Percoll 置于离心管下层，然后用注射器缓缓将31％的Percoll置于其上，即形成本发明中 的31％/45％梯度的Percoll分离液。所用的L15复合细胞培养基，每升L15培养基 中含有50ml胎牛血清、10万UI青链霉素、5万UI肝素、10mmol 4-羟乙基哌嗪乙 磺酸(HEPES)和0.5g葡萄糖，pH为7.4。

上述方法的具体步骤如下：

本发明的方法，包括分离和培养两个步骤：首先分离大黄鱼头肾巨噬细胞， 在预冷的培养基中清洗3遍，清除掉多余的脂肪和血污；将组织块置于100目的 尼龙网上，用注射器柱塞橡胶末端将组织块研磨，边研磨边加预冷的培养基。 随后将得到的细胞悬浮液置于事先准备好的Percoll分离液上，400g水平离心分离 30分钟后，用吸管将分离的细胞条带小心取出后，200g低速离心洗涤3遍完成分 离步骤。然后用含有0.1％FBS的培养基稀释细胞至2×10⁶个/ml。将细胞悬液加 入到96孔板中，每孔200μl，在22℃生化培养箱中过夜培养后，用培养液清洗3 次，除去未贴壁细胞，得到细胞单层。向每孔中加入200μl的L15复合细胞培养 基，置于培养箱中继续培养，每隔1天换液一次并利用MTT细胞活力检测法检测 其活力。

本发明的方法能够有效的分离、培养大黄鱼头肾巨噬细胞，所构建的细胞 模型分别利用组织学染色方法和电镜观察法进行确认。瑞姬氏染色结果显示贴 壁细胞中大于90％的细胞为巨噬细胞/单核细胞，细胞核着色呈深浅不同的紫红 色，胞浆呈灰蓝色，呈典型的巨噬细胞特征(图3)。同时巨噬细胞呈现较强的 贴壁性，细胞呈现扇形、多边形等不规则形态，大部分细胞伸出伪足，并且培 养时间越长，巨噬细胞的多态性趋势越明显，伪足发展增多，体积膨胀。电镜 观察发现大黄鱼头肾巨噬细胞细胞膜表面粗糙，外形不规则，以多边形居多， 有数目和长度不等的伪足伸出；细胞平均大小在10μm左右，细胞核较大，约占 整个细胞的1/5-1/2，其形状亦不规则，核膜边缘较为致密，核的位置通常不在细 胞中央，线粒体和粗面内质网丰富，有大小不等的囊泡，透射电镜下呈白色空 泡状，个别含有胞吞的异物(图4)。

在中国海洋大学教育部、农业部重点实验室以及宁波象山海洋渔业局的研 究表明，利用该鱼类细胞分离及培养技术，分离的大黄鱼头肾巨噬细胞比例高 达42％；贴壁巨噬细胞单层的纯度超过90％；培养一周后细胞存活率超过58％； 功能验证实验证实，该大黄鱼头肾巨噬细胞体外模型可对外源免疫刺激物LPS 和维生素C产生显著的免疫应答反应。10μg/mL的LPS可以显著促进大黄鱼原 代培养细胞的吞噬能力(P＜0.05)。巨噬细胞超氧阴离子的生成量(O^2-)随LPS 浓度的增加呈先上升后下降的趋势。0.1μg/mL的LPS可以显著促进大黄鱼巨噬 细胞O^2-的生成量(P＜0.05)。维生素C对大黄鱼巨噬细胞的吞噬能力无显著影 响(P＞0.05)。但同对照组相比，100μmol/L的维生素C可以显著提高巨噬细胞 O^2-的生成量(P＜0.05)。