一种快速降解稻草秸秆的有机物料腐熟组合菌剂及其应用方法

摘要

本发明公开了应用于稻草的就地还田高效稳定成肥使用的一种快速降解稻草秸秆的有机物料腐熟组合菌剂及其应用方法。所述的菌剂中含有含菌量配比1∶1∶1的康宁木霉CGMCC NO.3.4290；地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835；枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414；所述的菌剂是将所述的康宁木霉固体发酵培养后的产物；与两种芽孢杆菌液体培养后的培养物和麦麸吸附的产物混合后得到的菌剂。其细度不超过0.18mm，含水量低于30％。由于本发明的菌剂以孢子为主要存在形式，适应性强，适于喷施、撒施，易于机械化操作，可以大大降低劳动强度，缩短使用周期，加速秸秆腐熟，有利于大规模使用。

说明书

技术领域

本发明涉及应用于稻草秸秆的就地还田高效稳定成肥使用的一种快速降解稻草秸秆的有机物料腐熟组合菌剂及其应用方法。 

背景技术

农作物秸秆作为一种可再生资源，我国每年农业生产过程中要产生近2亿吨稻草。由于自然腐解需要时间较长，焚烧处理仍在大量使用，稻草的快速腐解并用于还田处理是倍受关注的问题。所以，农作物秸秆分解利用对于解决未来的能源危机与环境问题意义重大。 

湖南是农业大省，粮食作物以双季水稻为主。每年总秸秆量约3200万吨，其中稻草秸秆约2755万吨。正值国家启动的“秸秆还田提升土壤有机质”项目和湖南省水稻秸秆综合利用示范区创建的时期，本研究所针对南方生态、环境条件和耕作制度，拟研制出适应能力强和降解效率高的有机物料腐熟剂。该技术及其产品的应用可以加快秸秆的腐熟速率，提高土壤中有机质、速效钾等的含量，可以加速水稻营养供应、促进有效分蘖，从而增加株高和有效穗，提升水稻产量。从而有效地提高了秸秆综合利用率，可取得较好的经济效益、生态效益和社会效益。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于秸秆田间就地还田条件、能够快速高效腐解秸秆、具有一定稳定性的一种快速降解稻草秸秆的有机物料腐熟组合菌剂及其应用方法。 

本发明所采用的技术方案 

一种快速降解稻草秸秆的有机物料腐熟组合菌剂中含有含菌量配比1∶1∶1的康宁木霉CGMCC NO.3.4290；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC NO.4835；枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414；所述的菌剂由以下三种成分混合组成：康宁木霉CGMCC NO.3.4290依次经过液体发酵、固体发酵培养后的产物、地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835液体发酵培养后的培养物和麦麸吸附的产物、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414液体发酵培养后的培养物和麦麸吸附的产物。 

所述的康宁木霉CGMCC NO.3.4290于25-28℃固体发酵培养45-48h，产物中菌含量不低于10⁸个/g，所述的枯草芽孢杆菌在34-37℃培养22-24h，所述的地衣芽孢杆菌在45-55℃培养36-40h后，分别将培养物与麦麸吸附，产物中菌含量均不低于10⁹个/g，所述的菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

所述的菌剂中菌含量不低于2×10⁸个/g，菌剂细度不超过0.18mm，含水量不高于30％。4.根据权利要求1所述的菌剂，其特征在于，所述的康宁木霉CGMCC NO.3.4290固体发酵具体过程如下： 

首先将所述的康宁木霉CGMCC NO.3.4290经过斜面种子活化、摇瓶种子培养后，将摇瓶种子培养液接种到液体发酵罐培养基中培养，培养时间22-24h，温度25-28℃，转速120-150rpm；通气量0.4-0.5VVM；接种量占培养基体积的10-15％，发酵罐中培养基装量占发酵罐体积的60-70％，液体发酵培养基配制方法为：蔗糖20g，酵母粉0.2g，麦芽粉3.0g，NaCl 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，加蒸馏水至1L，pH6.5，121℃，0.1MPa高压灭菌30min； 

然后接种占固体培养基重量10-15％的发酵培养种子液，25-28℃固体发酵培养45-48h；固体发酵培养基的配制方法为：玉米粉10g，麦麸90g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，80mL蒸馏水，121℃，0.1MPa高压灭菌30min，固体发酵罐中培养基的装量为体积的60-70％。 

所述的地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835经过斜面种子活化、摇瓶种子培养后，将摇瓶种子培养液接种到液体发酵罐培养基中培养，所用液体发酵培养基的配制方法为：淀粉5.0g，糊精20g，豆饼粉25g，酵母粉3.0g，CaCO₃ 12g，(NH₄)₂SO₄ 10g，NaCl 4.0g，KH₂PO₄ 0.2g，加蒸馏水至1L，pH7.2-7.4，121℃，0.1MPa高压灭菌30min；培养时间36-40h，温度45-55℃，转速180-200rpm，通气量0.8-1.0VVM，接种量占培养基体积的8-10％，发酵罐中培养基的装液量为发酵罐体积的55-65％。 

所述的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414经过斜面种子活化、摇瓶种子培养后，将摇瓶种子培养液接种到液体发酵罐培养基中培养，所用液体发酵培养基的配制方法为：葡萄糖5.0g，蔗糖3.0g，豆饼粉15g，酵母粉10g，蛋白胨5.0g，CaCO₃ 1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.1g，KH₂PO₄ 4.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·H₂O 0.062g，加蒸馏水至1L，pH7.2，121℃，0.1MPa高压灭菌30min；培养时间22-24h，温度34-37℃，转速180-200rpm，通气量0.8-1.0VVM，接种量占培养基体积的8-10％，发酵罐中培养基的装液量为发酵罐体积的55-65％。 

上述菌剂制备过程中，麦麸吸附时，其重量比例占70-80％。 

所述的菌剂用于提高水稻性状和产量；具体是添加到稻草秸秆中，用于加速稻草秸秆腐 熟、提高土壤中有机质、速效钾的含量，加速水稻营养供应、促进有效分蘖，从而增加株高和有效穗，提升水稻产量。 

本发明的组合菌株的原理及有益效果是：本发明针对秸秆的组成，以多种木质素酶活力、纤维素酶活力、半纤维素酶活力及秸秆降解率为检测指标，特别选取康宁木霉CGMCC NO.3.4290；地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835；枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414。再将三种菌株培养的产物混合制备而成的菌剂应用于稻草就地还田田间小区试验。由于在对秸秆结构进行研究以后，人们发现木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使纤维素酶等不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性。因此要彻底降解纤维素，首先必须解决木质素的降解问题。首先利用康宁木霉针对秸秆外层难分解成分蜡质和木质素优先降解；再通过结合纤维素降解菌(地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌)能动构建出提高稻草类秸秆腐解效率的菌株组合。 

针对秸秆由木质素、纤维素、半纤维素等组成，本发明将能分泌高活性的木质素酶、纤维素酶和半纤维素酶的康宁木霉、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌株进行组合。由于该菌种组合具有多种菌株，具有一定稳定性，而且所有菌都以芽孢形式存在，生长条件适用广，易存活繁殖，尤其在碳源利用上具有很强的协同性，因此易于提高秸秆腐熟效率。该秸秆降解菌剂组合在降解秸秆的14天内，pH值保持稳定，木质素酶、纤维素酶活力及有效活菌数量始终保持在10⁷个/g以上，秸秆降解率不断增加，说明该秸秆降解菌剂对pH具有很强适应和调节能力，能够保持性质稳定，同时在功能发挥上也具有一定稳定性。该菌剂以孢子为主要存在形式，且细度在0.18mm水平级，适应性强，在应用于稻草秸秆的就地还田成肥中，适于撒施、喷施，易于机械化操作，可以大大降低劳动强度，缩短使用周期，加速秸秆腐熟，有利于大规模使用。 

本发明菌种组合中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)保藏号为：CGMCC NO.4835，是由本申请人自己筛选的菌株，并于2011年5月9日在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，而且申请了专利，申请号为201110166962.0。 

枯草芽孢杆菌CGMCC NO.11414和康宁木霉CGMCC NO.3.4290均购买于中科院微生物研究所。 

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。 

实施例1本发明菌剂制备 

1)将康宁木霉CGMCC NO.3.4290经过斜面种子、摇瓶种子培养后至液体发酵罐发酵培养，最终在固体发酵罐中培养产孢，斜面种子培养所用培养基的配制方法为：蛋白胨6.0g，土豆200g，NaCl 2.0g，MgSO₄ 1.0g，蔗糖20g，KH₂PO₄ 1.0g，琼脂18-20g，加蒸馏水至1L，pH自然，121℃，0.1MPa高压灭菌30min。斜面种子培养时间30-36h，温度25-28℃。斜面种子接种二至三环至摇瓶种子培养，在500mL三角摇瓶中培养基装量为100mL。摇瓶种子所用培养基的配制方法为：豆饼粉1.5g，蔗糖20g，MgSO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 3.0g，加蒸馏水至1L，pH自然，121℃，0.1MPa高压灭菌30min，培养时间22-24h，温度25-28℃，转速120-150rpm，液体发酵罐培养基中培养，培养时间22h，温度28℃，转速150rpm，通气量0.5VVM。液体发酵培养基配制方法为：蔗糖20g，酵母粉0.2g，麦芽粉3.0g，NaCl 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，加蒸馏水至1L，pH6.5，121℃，0.1MPa高压灭菌30min；接种量占培养基体积的15％，发酵罐中培养基装量占体积的70％。 

2)然后接种占固体培养基重量15％的液体发酵培养种子液，25℃固体发酵培养48h；固体培养基的配制方法为：玉米粉10g，麦麸90g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 0.2g，MgSO₄·7H₂O0.05g，80mL蒸馏水，121℃，0.1MPa高压灭菌30min。固体发酵罐中培养基的装量为体积的70％。产物中菌含量在3-6×10⁸个/g，菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

3)地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835先经过斜面种子、摇瓶种子培养后至发酵培养，其中地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835斜面种子培养所用培养基的配制方法为：葡萄糖4.0g，酵母膏4.0g，麦芽粉10.0g，CaCO₃ 2.0g，琼脂20g，加蒸馏水至1L，pH7.2，培养时间24-26h，温度45-55℃。斜面种子接种一环至摇瓶种子培养，在500mL三角摇瓶中培养基装量为100mL。所用培养基的配制方法为：淀粉30.0g，豆饼粉5.0g，酵母膏5.0g，CaCO₃ 5.0g，(NH₄)₂SO₄4.0g，NaCl 5.0g，KH₂PO₄ 0.12g，加蒸馏水至1L，pH7.2，121℃，0.1MPa高压灭菌30min。培养时间24-30h，温度45-55℃，转速200-220rpm。然后接种占发酵培养基体积8％的种子培养液到发酵培养基中培养36h，温度55℃，转速200rpm，通气量0.8VVM。发酵罐中培养基的装液量为65％。所用发酵培养基的配制方法为：淀粉5.0g，糊精20g，豆饼粉25g，酵母粉3.0g，CaCO₃ 12g，(NH₄)₂SO₄ 10g，NaCl 4.0g，KH₂PO₄ 0.2g，加蒸馏水至1L，pH7.2，121℃，0.1MPa高压灭菌30min。 

将发酵培养的培养物与麦麸吸附，产物中菌含量均在4-6×10⁹个/g，菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

4)枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414先经过斜面种子培养、摇瓶种子培养后至发酵培养， 所用斜面种子培养基的配制方法为：牛肉膏3.0蛋白胨10.0氯化钠5.0，加蒸馏水至1L，pH7.2，121℃，0.1MPa高压灭菌30min；培养时间22-24h，温度34-37℃。斜面种子接种一环至摇瓶种子培养，在500mL三角摇瓶中培养基装量为100mL。摇瓶种子培养所用培养基的配制方法为：牛肉膏5.0酵母提取物5.0蛋白胨10.0葡萄糖5.0氯化钠5.0蒸馏水1000mlpH7.0，121℃，0.1MPa高压灭菌30min。培养时间22-24h，温度34-37℃，转速200-220rpm。接种8％的摇瓶种子培养液至发酵培养基中，发酵罐中培养基的装液量为65％。所用发酵培养基的配制方法为：葡萄糖5.0g，蔗糖3.0g，豆饼粉15g，酵母粉10g，蛋白胨5.0g，CaCO₃1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.1g，KH₂PO₄ 4.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄·H₂O 0.062g，加蒸馏水至1L，pH7.2，121℃，0.1MPa高压灭菌30min。培养时间22h，温度37℃，转速200rpm，通气量0.8VVM。将发酵培养的培养物与麦麸吸附，产物中菌含量均在6-8×10⁹个/g，菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

5)将上述康宁木霉CGMCC NO.3.4290依次经过液体发酵、固体发酵培养后的产物；与地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835液体发酵培养后的培养物和麦麸吸附的产物、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414液体发酵培养后的培养物和麦麸吸附的产物混合后得到的菌剂。麦麸吸附的重量比例为70％，含菌量配比1∶1∶1的康宁木霉CGMCC NO.3.4290；地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835；枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414；菌剂中菌含量为2×10⁸个/g；菌剂细度为0.18mm，含水量不高于30％。 

实施例2 

菌剂制备方法同实施例1，只是康宁木霉CGMCC NO.3.4290液体发酵罐培养基中培养时的培养时间为24h，温度25℃，转速120rpm，通气量0.4VVM，。接种量占培养基体积的10％，发酵罐中培养基装量是60％。然后接种占固体培养基重量10％的液体培养种子液，28℃固体发酵培养45h；固体发酵罐中培养基的装量为体积的60％。产物中菌含量在3-6×10⁸个/g，菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

地衣芽孢杆菌CGMCC NO.4835，接种占发酵培养基体积10％的种子培养液到发酵培养基中培养40h，温度45℃，转速180rpm，通气量1.0VVM，。发酵罐中培养基的装液量为55％。将培养物与麦麸吸附，产物中菌含量均在4-6×10⁹个/g，菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

枯草芽孢杆菌CGMCC NO.1.1414，接种10％的摇瓶种子培养液至发酵培养基中，培养时间24h，温度35℃，转速180rpm，通气量1.0VVM，。发酵罐中培养基的装液量为55％。将发酵培养的培养物与麦麸吸附，产物中菌含量均在6-8×10⁹个/g，菌含量包括菌体和芽孢总的含量。 

麦麸吸附的重量比例为80％，最后得到的菌剂中菌含量为2×10⁸个/g，菌剂细度为0.18mm，含水量不高于30％。 

实施例3菌剂秸秆降解率对比 

稻草秸秆降解率测定培养基的培养方法为：新鲜稻草秸秆剪成1cm长的短秆，称取20g加入500mL的三角瓶，每瓶再加入50g的以下菌剂和100mL蒸馏水，混合均匀，自然pH值，于121℃、0.1MPa下灭菌30min。 

首先将纤维素降解菌(即本发明的两种芽孢杆菌)分别于34℃培养24h后麦麸吸附制成浓度为10⁸个/g的孢子粉剂，按照1∶1体积比混合，秸秆降解率为39.6％，高于单株菌；而本发明将两种纤维素降解菌和木质素降解菌复配，秸秆降解率提高到50.2％。说明这种组合中的菌株存在着一定的协同性，他们之间没有拮抗性。 

本发明菌种组合菌剂以稻草秸秆降解率为指标，其对稻草秸秆的降解率比单菌种有明显提高，达到了50.2％。 

实施例4本发明菌剂在缩短稻草秸秆腐熟时间中的应用 

试验设5个处理，3次重复。处理1：常规施肥+稻草还田+合缘牌牌有机物料腐熟剂；处理2：常规施肥+稻草还田+本发明的菌剂；处理3：常规施肥+稻草还田+谷霖牌有机物料腐熟剂；处理4：常规施肥+稻草还田；处理5：常规施肥；晚稻试验区随机排列，小区面积33.3M²。试验结果为处理2比处理4缩短腐熟时间，较处理1和处理3为优(见表1)。 

表1不同处理稻草腐熟程度记载表 

注：一般条件下，秸秆腐解程度为定性比较，统计时把秸秆颜色中黄、微黄、褐黄、黑黄分别定为1、2、3、4级，秸秆气味中的霉味、氨味、酒味、腐烂味分别定为1、2、3、4级，手感软化程度中的硬、微软、软、腐烂分别定为1、2、3、4级，统计时各处理中的腐解程度 数值为三大指标数值之和，数值越大表示该处理的秸秆腐烂越快，腐熟作用越明显。 

实施例5本发明菌剂在水稻经济性状改善中的应用 

与实施案例4同样处理组。处理2比处理1和处理3每亩平均株高和有效穗都有增加，水稻产量也有增加，同时与处理4和处理5差异显著性，具有经济效益(见表2、3、4、5、6)。 

表2不同处理经济性状表(单位：cm，万/667m²，％，g，kg/667m²) 

表3不同处理产量表(单位：株/667m²，kg/667m²) 

表4方差分析 

  变异来源   自由度   平方和   均方   F值   F0.05   F0.01   处理间   4   19.871   4.968   114.638   3.478   5.994   误差   10   0.433   0.043   -   -   -   总变异   14   20.304   -   -   -   -

[0049] 表5多重比较(LSD法) 

表6不同处理效益分析(单位：元/667m²，kg/667m²) 

实施例6本发明菌剂使用条件及使用方法 

1.使用条件：该秸秆降解组合菌剂的田间最佳接种量为4‰，即每千克稻草秸秆需要接种4g降解菌剂；在大田施加菌剂的同时，需要施加氮和磷。每千克稻草秸秆氮的施加量为12g，磷的补加量为5g，一般越大越有利于稻草秸秆降解，因此可以根据实际情况确定磷补充量。 

2.使用方法：结合稻草秸秆还田的同时，撒施或喷施本发明菌剂。用量：每亩2-3公斤，在稻草秸秆上撒施或喷施本发明菌剂即可。同时施加氮肥和磷肥，然后将稻草秸秆翻入地下，也可适用于稻草秸秆堆置条件下腐熟发酵。