法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-08-07
授权
授权
2012-09-12
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20111215
实质审查的生效
2012-07-11
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用,属于作物病害 诊断和病原菌鉴定的技术领域。
背景技术
由镰刀菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是 一种广泛流行的世界性病害,主要发生于温暖湿润地区,是影响小麦高产、稳产 和优质的重要因素之一。19世纪90年代以来,北美、欧洲、亚洲等地大麦、小 麦赤霉病灾情严重。我国南方长江中下游冬麦区发生严重,随着全球性气候变暖、 耕作制度以及耕作方式的改变,小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区以及西南和 西北麦区扩展(Ma等,2008),几乎蔓延到所有小麦种植区。2003年,长江中 下游地区60-80%的麦区感染赤霉病,减产超过20%。2005年,江苏省赤霉病的 发生面积为1800万亩左右,占全省总种植面积的72%。全国农业技术推广服务 中心预报2011年赤霉病在全国流行面积为6500万亩。
小麦赤霉病的发生与流行还带来巨大的食品安全性隐患。镰刀菌可以产生单 端孢霉烯毒素(trichothecene),人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉会发生呕 吐、腹泻及食欲不振等急、慢性中毒症状,严重者可导致死亡(陆维忠等,2001)。 据美国估计,因此类毒素污染所造成的直接经济损失仅1991~1996年间就高达 三亿美元。我国、欧盟和美国、加拿大均要求面粉、面包、饼干等食品中DON 毒素的限量标准为1000μg/kg(1ppm)(Buerstmayr等,2009;GB 16329-1996)。 因此,明确我国小麦赤霉病致病菌的种类与产毒类型,对开展小麦赤霉病防治与 抗病育种都有重要的实践意义。
自20世纪40年代中国首次报道小麦赤霉病以来,国内外研究认为,禾谷镰 刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)是小麦赤霉病的主要致病菌之一,也是中国 小麦赤霉病的优势致病菌。近年来的研究表明,F.graminearum是一个含有许多 特定种系的复合种(Fg Complex),O’Donnell通过系统发生学分析,将FgComplex 划分成13个特定的正式命名的种。根据该项研究结果,目前中国小麦赤霉病的 主要致病菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和亚细亚镰刀菌(Fusarium asiaticum)。其中亚细亚镰刀菌在长江中下游麦区、南方麦区和西南麦区均为优 势致病菌,并且不断向黄淮麦区、北方麦区迁移(Zhang,2010)。研究还表明, 产生3ADON毒素的亚细亚镰刀菌群日益扩展,并具有更强的致病力,危害性更 大(Zhang,2010)。因此,快速、准确鉴定检测亚细亚镰刀菌,有利于针对性地 加强对小麦赤霉病的防治。
传统的镰刀菌鉴定方法主要通过形态学,如大分子生孢子、小分生孢子、原 膜孢子等的形态来鉴定。但形态学鉴定方法繁琐,没有统一的规范标准,并且需 要丰富的实践经验。随着遗传与分子生物学技术的迅速发展,营养体亲合群 (Vegetative compatibility group VCG),分子标记也成为鉴定镰刀菌的主要技术 手段。与常规的形态鉴定法相比,分子标记能准确、快速地从混合群体中鉴定出 不同病菌类型,为准确、快速分析病菌的群体分布、特点和鉴定诊断提供新方法。
Nicholson等(1998)找到了一对鉴定禾谷镰刀菌Fg Complex的标记Fg16F/R, 但在扩增来自不同地区的禾谷镰刀菌株时得到6种PCR产物,不能有效地区分 菌株的种类。Qu等(2008)利用该对引物,并结合AFLP标记,鉴定出Fg16F/R 扩增类型5和AFLP扩增类型B的菌株为亚细亚镰刀菌。由于AFLP标记操作繁 琐,且涉及到酶切和两次PCR扩增等步骤,难以在实际检测中推广应用。Yang 等(2008)利用氨连接酶基因的单核苷酸多态性(SNP)设计了4个引物试图来区 分Fg complex中的七个种,其中鉴定亚细亚镰刀菌需要扩增出536bp、388bp、 311bp、162bp等4条不同大小的条带,并且还需要通过条带的强弱进行辅助判 断,并不能真正满足快速简易检测的要求。
目前,一种针对所有亚细亚镰刀菌具有特异性的引物,未见报道。
发明内容
本发明的目的在于:针对目前对亚细亚镰刀菌的鉴定方法过于复杂,或只能 针对个别亚细亚镰刀菌,在预防亚细亚镰刀菌对农作物和饲料污染,以及在鉴别 病原菌等一系列实际应用中存在明显的局限性的实际问题,提供一种由新的特异 性引物组成的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用。
本发明的目的是这样实现的:一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法,是利 用对亚细亚镰刀菌的一对特异性引物对样本提取的DNA进行PCR扩增,对扩增 产物进行电泳凝胶成像分析,其特征在于:所述的一对特异性引物为:上游引物 SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2;对PCR扩增产物进行电泳凝胶成像分 析中,根据172bp处是否出现特异条带来判断样本提取的DNA是否与亚细亚镰 刀菌相关;
所述的一对特异性引物是基于亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标 记,SRAP标记的序列为SEQ ID NO.3,其大小为172bp。
在本发明中:DNA是通过改良CTAB法或改良SDS法从样本中提取的。
在本发明中:所述样本提取的DNA是指从农作物籽粒或饲料样本中提取的 农作物或饲料DNA。
在本发明中:所述的农作物是指麦类农作物。
在本发明中:所述样本提取的DNA是指:病原菌基因组样本提取的DNA。
在本发明中:PCR扩增,反应体系20μL,包括DNA 10-20ng,2μL 10×buffer, 1.6μL 2.5mmol/L dNTP,1.2μL 25mmol/L MgCl2,2.5μmol/L上游及下游引物各 2μL,1.0 U Taq酶,ddH2O补齐至20μL;PCR扩增条件为第一循环95℃预变性 5min;然后95℃变性45sec,60℃退火30sec,72℃延伸45sec,共35个循环; 最后一个循环为72℃延伸10min,扩增产物4℃保存。
在本发明中:所述的电泳是指:在2%琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液中电泳 30min,电压为4-5V/cm的条件下凝胶成像。
一种上述检测方法的应用,其特征在于:用于对亚细亚镰刀菌的鉴别,或用 于监控亚细亚镰刀菌对农作物或饲料的污染。
在所述检测方法的应用中:所述的用于对亚细亚镰刀菌的鉴别是指:从病原 菌基因组样本中提取的DNA,当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带, 该病原菌为亚细亚镰刀菌。
在所述检测方法的应用中:所述的用于亚细亚镰刀菌对农作物污染的监控是 指:从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA;当电泳后的凝胶成 像中172bp处存在特异条带,该农作物籽粒或饲料样本已经被亚细亚镰刀菌污 染。
本发明的优点在于:1.一对特异性引物能够针对目前所知的各中亚细亚镰刀 菌都能够扩增一个特异性产物,对鉴定亚细亚镰刀菌具有特殊的意义。2.采用 一对引物进行PCR扩增,操作步骤少,操作方法简单;3.PCR扩增产物为一个 特异性产物,不需要通过几个产物或者多条条带来鉴定菌株,利用本方法,能扩 增出产物的即为亚细亚镰刀菌,扩增不出的即为其他菌株,测定结果简单明了;
4.本方法所需的DNA量较少,10-20ng的DNA即可检测到结果,以确保从麦 穗、种子、饲料中检测出亚细亚镰刀菌。
附图说明:
图1:对已知种型的菌株的PCR扩增鉴定结果,其中:M:分子量标准50bp; 1-5泳道为公知的亚细亚镰刀菌株的DNA;6-10泳道为公知的禾谷镰刀菌株(非 亚细亚镰刀菌株)的DNA。
图2:对中国采集菌株的PCR扩增鉴定结果,其中:M:分子量标准100bp; 1-20泳道为采集的镰刀菌株样本的DNA。
图3:对不同小麦产区麦粒受亚细亚镰刀菌污染的鉴定结果,其中:M:分 子量标准100bp;1-20泳道为小麦籽粒样本的DNA。
具体实施方式
实施例1:
根据已确定的42个亚细亚镰刀菌和30个非亚细亚镰刀菌,通过相关序列扩 增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记,对亚细亚镰 刀菌和非亚细亚镰刀菌进行扩增和比对分析。所扩增出的SRAP标记是基于基 因序列中内含子与外显子的SRAP多态性标记,这种多态性标记往往代表的是基 因之间的多态性(也就是差异)。我们从近400个标记中找到只在亚细亚镰刀菌 中能够扩增,而在非亚细亚镰刀菌中不能够扩增的SRAP标记,SRAP标记的序 列为SEQ ID NO.3,其大小为172bp。通过对这个标记进行测序,并在NCBI的 GeneBank里进行比对,发现这是一个新的基因,只在亚细亚镰刀菌中存在,目 前在其他镰刀菌的序列中都没有找到同源序列。我们针对这个标记,重新进行了 引物设计。
设计针对亚细亚镰刀菌的分子具有特异性的引物对(委托上海生工公司合 成):
上游引物SEQ ID NO.1
5′-TGAGTCCAAACCGGATAGCAAGGTA-3′,
下游引物SEQ ID NO.2
5′-GACTGCGTACGAATTTGCACTTCCT-3′。
对特异性引物的验证:
已知菌株的来源
亚细亚镰刀菌株:w316,w346,B156,B592,B755(湖北省农业科学院植 保土肥研究所喻大昭研究员提供)。
禾谷镰刀菌(非亚细亚镰刀菌株)菌株:Fg820,M101,M83,M129,G12 (荷兰国际植物研究所Lee博士提供)。
对已知种型菌株的PCR扩增鉴定过程:
1.菌株DNA样本的提取
分别挑取各菌株的菌丝在PDA培养基(去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂 20g,蒸馏水1000ml)上,24℃培养3天,挑取新鲜菌丝用液氮冻干并研磨粉碎, 用改良CTAB法(Zhang,2004)提取DNA。适量菌丝中加入200μL CTAB提取缓 冲液(80mM Tris-HCl,117M NaCl,16.7mM EDTA,16.7mg/ml CTAB),65℃温 浴40min,加入200μL氯仿-异戊醇(24∶1)抽提液振荡混匀,12000rpm离心5min, 上清液加入120μL异丙醇沉淀DNA,ddH2O溶解DNA。取10-20ng DNA加入 到PCR反应体系中。
2.PCR扩增反应及扩增程序
反应体系20μL,包括DNA 10-20ng,2μL 10×buffer,1.6μL 2.5mmol/L dNTP, 1.2μL 25mmol/L MgCl2,2.5μmol/L上游及下游引物各2μL,1.0U Taq酶,ddH2O 补齐至20μL;PCR扩增条件为第一循环95预变性5min;然后95℃变性45sec, 60℃退火30sec,72℃延伸45sec,共35个循环;最后一个循环为72℃延伸10 min,完成扩增,扩增产物4℃保存。
3.PCR扩增产物的鉴定
泳道分配:
M:分子量标准50bp
w316,w346,B156,B592,B755依次列入1-5泳道;
Fg820,M101,M83,M129,G12依次列入6-10泳道。
取8μL PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液电泳分析,电压 为4-5V/cm,电泳分离30min,经溴化乙锭染色后用凝胶成像系统分析扩增产物 的大小判断结果,实验结果见图1。
表1 本发明所采用的已知种型的镰刀菌菌株
由图1可见,利用本发明的特异性引物,以已知种型的菌株为模板,PCR 扩增结果在1-5泳道扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp,而在6-10泳道扩增 不出亚细亚镰刀菌特异性条带,与已知表1的结果吻合。
此外,我们还对已收集分离的831个镰刀菌菌株中都进行了验证,发现这对 引物确实只能在亚细亚镰刀菌中的有扩增产物。因此我们认为这对引物确实可以 用于亚细亚镰刀菌的鉴定。
实施例2:
利用特异性的引物对采集的镰刀菌菌株进行分型。
镰刀菌菌株采集自中国7个省、自治区,发明人在试验中将它们分别定义为: 0901,0914,0919,0920,0922,0923,0924,0925,0950,0968,0978,0938, 0943,0956,0966,0822,K11,2E22,2041,0825,与各菌株对应的采集地 均记载在表2中。
菌株DNA的样本提取采用改良SDS方法,适量菌丝中加入200μL提取缓 冲液(4%SDS,100mM Tris-HCl,10mM EDTA),65℃温浴30min后迅速移入 冰浴中30min,加入200μL氯仿-异戊醇(24∶1)抽提液振荡混匀,12000rpm离心 5min,上清液加入120μL异丙醇沉淀DNA,ddH2O溶解DNA。取10-20ng DNA 加入到PCR反应体系中。
对菌株的DNA进行的PCR扩增反应及扩增程序、PCR产物的鉴定同实施 例1。在泳道分配中,0901,0914,0919,0920,0922,0923,0924,0925,0950, 0968,0978,0938,0943,0956,0966,0822,K11,2E22,2041,0825依次位 于1-20泳道,M:分子量标准100bp。与采集的镰刀菌菌株相对应的鉴定结果见 图2。
表2 对采集的镰刀菌菌株进行分型结果
利用本发明的特异性引物,以中国采集的菌株为模板,由PCR扩增结果由 图2可见:位于1-11泳道的0901,0914,0919,0920,0922,0923,0924,0925, 0950,0968,0978扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp,本发明将其鉴定为亚 细亚镰刀菌;位于12-20泳道的0938,0943,0956,0966,0822,K11,2E22, 2041,0825扩增不出亚细亚镰刀菌特异性条带,本发明将其鉴定为非亚细亚镰 刀菌。
对上述各菌株样本的DNA还同步采用了英国John Innes Centre的PCR检测 方法(见Nicholson等,1998)和湖北省农科院的多重PCR检测方法(见Yang 等,2008)进行同步试验,获得的结果完全一致。
实施例3:
对小麦受亚细亚镰刀菌污染的监控。
小麦麦粒分别采集自中国的江苏省泰州和武进麦区,安徽省六安麦区,河南 省商城和潢川麦区,湖北省襄樊麦区的病麦粒和健康麦粒。
麦粒的DNA提取
小麦麦粒分别采集自中国的江苏省泰州和武进麦区,安徽省六安麦区,河南 省商城和潢川麦区,湖北省襄樊麦区。取健康麦粒或病麦粒,用液氮冻干并研磨 粉碎,用改良CTAB法(Zhang,2004)提取DNA(同实施例1)。取40-50ng DNA 加入到PCR反应体系中。
对小麦样本的DNA进行PCR扩增反应及扩增程序、PCR产物的鉴定同实 施例1。
在泳道分配中,1-9泳道为病小麦样本的DNA,它们依次分别源于江苏泰州、江 苏武进、安徽六安A、河南商城A、河南潢川、湖北襄樊A、安徽六安B、河南 商城B和湖北襄樊B,其中A与B表示为同一地区采集的不同批次的病小麦; 10-20泳道为健康小麦样本的DNA,其中:10-12泳道源于江苏泰州;13-15泳 道源于安徽六安;16-18泳道源于河南商城;19-20泳道源于湖北襄樊。M:分子 量标准100bp。与采集的小麦样本的DNA相对应的鉴定结果见图3。
由图3可见,在已知病小麦的电泳图中,1-6泳道扩增出亚细亚镰刀菌特异 性条带172bp,7-9泳道未扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp,说明与1-6 泳道的病小麦受到亚细亚镰刀菌污染;在健康小麦的泳道中,均扩增不出亚细亚 镰刀菌特异性条带。
对上述小麦样本的DNA还同步采用了英国John Innes Centre的PCR检测方 法(见Nicholson等,1998)和湖北省农科院的多重PCR检测方法(见Yang等, 2008)进行同步试验,结果是:已知1-9泳道的病小麦均受到镰刀菌的污染,其 中,与1-6泳道对应的病小麦为亚细亚镰刀菌污染的病小麦,其余的病小麦(7-9 泳道对应的病小麦)为非亚细亚镰刀菌污染的病小麦,获得的结果与本发明完全 一致。
可见,本发明可以用于鉴定亚细亚镰刀菌对小麦的污染。
本实施例只要用饲料样本或其它农作物替代小麦样本,就可以用于鉴定饲料 或其它农作物中是否存在亚细亚镰刀菌的污染。
以上各实施例不是对本发明的限制,只要利用本发明设计的特异性引物,结 合本领域的基本常识,对样本提取的DNA进行PCR扩增,再对扩增产物进行电 泳凝胶成像分析,根据电泳凝胶成像中172bp处是否出现特异条带来判断样本是 否与亚细亚镰刀菌相关,均属于本发明的保护范畴。
<110> 江苏省农业科学院
<120>针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用
<130> 说明书
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<221>亚细亚镰刀菌DNA序列扩增的上游引物
<222> (1)..(25)
<400> 1
TGAGTCCAAA CCGGATAGCA AGGTA 25
<210>2
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<221>亚细亚镰刀菌DNA序列扩增的下游引物
<222> (1)..(25)
<400> 2
GACTGCGTAC GAATTTGCAC TTCCT 25
<210>3
<211> 172
<212> DNA
<213>人工序列
<221>亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标记
<222> (1)..(25)
<400> 3
TGAGTCCAAA CCGGATAGCA AGGTATAACC AGTCGAAGTC CATAGCGACT 50 CATATCGTCT TCTGAAGCTG GTAGAATGTG TGAAAGGGTA GAAGATGTGA 100 GAATTATTAA AGTAGACATC AAGAAGCTTG TCTGATATTT GACGTGGAGG 150 AAGTGCAAAT TCGTACGCAG TC 172
机译: 用于检测亚细亚镰刀菌的引物组及其使用方法
机译: 镰刀菌镰刀菌的检测方法
机译: 镰刀菌镰刀菌的检测方法