硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法

摘要

本发明涉及一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法。该方法通过将硫酸软骨素与胶原蛋白预先均匀混合后沉淀制备出含有硫酸软骨素的胶原蛋白/羟基磷灰石浆料，将浆料发泡并冷冻干燥得到三维多孔支架材料，最后通过交联剂交联，构建了硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架。该工艺过程简洁，多孔支架的孔隙可控，通过预混合后交联的方式促进交联效果，增强支架的力学强度，整个过程采用的试剂安全无毒性，生物相容性高，是一种适用于制备组织工程材料的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨支架材料的制备方法，特别是一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法。

背景技术

自然骨是由纳米羟基磷灰石(HA)为主的无机相与胶原蛋白(Col)为主的有机相有序组合的复合材料。从仿生角度出发，制备胶原蛋白(Col)与纳米羟基磷灰石(HA)复合的多孔骨支架，在骨组织工程领域具有重要的应用价值，成为研究的热点。

胶原蛋白作为一种天然生物材料，其本身是细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的主要成份之一，具有较多的作为组织工程支架材料的优点，如低抗原性、止血作用和促进细胞增殖的作用等，但降解过快和强度较差的缺点又一定程度的限制了它的应用。近年来，有学者开始致力于模拟细胞外基质的研究，已经构建了诸如胶原蛋白-硫酸软骨素等支架材料，这些复合材料克服了单纯胶原蛋白的缺点，显著提高了其机械强度和改善了降解率过快的问题。其中硫酸软骨素(CS)主要存在于软骨和关节骨中，是软骨和关节骨的细胞外基质的重要成分。单纯的CS具有抗炎、促进新陈代谢、加速伤口愈合的作用；CS作为大分子聚阴离子物质，在一定浓度下具有高度粘弹性，可聚集在病变组织周围而使其免受氧自由基的侵袭，起到保护作用；CS的降解产物不仅没有毒性，反而具有排毒的作用，且可以成为新生组织的原料。所以CS的众多优点使其作为组织工程支架材料有广阔的前景。基于以上思路，通过构建硫酸软骨素交联的Col/HA支架材料，提高Col/HA支架材料的强度和生物相容性，在组成上更加接近自然软骨和关节骨，推进骨组织工程的发展。

近年来，制备硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架的工艺已经有所报道。如：中国专利号ZL 03144308.7，授权公告号CN1255478C，公开了一种“复合骨组织工程支架材料及其制备方法”，首先制备了Col/HA的支架，再通过将硫酸软骨素制备成交联液，直接交联在Col/HA支架上，该过程工艺繁杂，并且只提到了生物相容性的提高，而没有提到CS的交联对Col/HA支架的强度的提高作用；中国专利授权公告号CN101020082 B，公开了 “一种骨修复材料及其制备方法和通途”，通过将不同粒径的煅烧骨粉与硫酸软骨素在乙酸或NaHCO3中溶解共混，得到骨修复材料，该技术存在涉及的支架材料孔隙率不可控、化学稳定性差、力学强度低的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术交联方式繁杂，化学稳定性差，对支架强度提高不明显的不足的缺陷，提供一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法。 

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的制备工艺包括以下步骤：

一种硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石复合支架材料的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

(1)     将胶原蛋白Col溶于醋酸溶液中，4℃下配制成浓度为：1%～1.5%g/L的Col溶液，并调节pH值至中性；用超纯水溶解硫酸软骨素CS制成浓度为：1%～1.5%g/L的CS溶液；

(2)     按Col溶液与CS溶液的体积比为5:1～9:1的比例，在4℃搅拌下，将CS溶液缓慢滴加到Col溶液中；

(3)     向步骤(2)得到的溶液中加入可溶性钙盐溶液和磷酸盐溶液，其中钙磷的计量比为1.67：1，并控制Co与羟基磷灰石的质量比为1:9～3:7，缓慢加热到40℃，并搅拌20分钟；调节pH值为7，出现白色悬浊液，持续搅拌24小时；

(4)     将步骤(3)所得的沉淀物清洗并离心，干燥，得到硫酸软骨素-胶原蛋白/羟基磷灰石粉末；

(5)     将步骤(4)得到粉末和羧甲基纤维素按100:0.2～2的质量比与双氧水溶液进行调和至粘稠状后搅拌30分钟发泡，得到浆料；

(6)     将步骤(5)所得到的浆料快速移入12孔细胞培养平板，并立即放入-20 ℃ 冰箱预冷冻24h；取出，于-50 ℃ 冷冻干燥，得到硫酸软骨素-胶原蛋白/羟基磷灰石多孔支架材料；

(7)     将步骤(6)所得到的多孔支架浸泡于50mmol/L的2-吗啉乙烷磺酸0MES的40%乙醇溶液30min；取出，再浸泡于50mmol/L的 2-吗啉乙烷磺酸MES、20mmol/L的碳化二亚胺 EDC、5mmol/L 的琥珀酰胺NHS的40%乙醇溶液24h；得到交联材料；

(8)     将步骤(7)所得交联材料在依次在0.1 mol/L Na₂HPO₄溶液、1mol/L的 NaCl溶液以及2mol/L NaCl溶液中清洗，用超清洗10次，冷冻干燥，就得到硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石多孔支架材料。

上述的步骤（2）中的滴加速度可以控制在0.5ml/min-1.0 ml/min；

上述的可溶性钙盐可以为硝酸钙或氯化钙。

上述的磷酸盐可以为磷酸氢二钠、磷酸氢二铵或磷酸氢铵。

上述的双氧水溶液的质量百分比浓度为3-7%。

本发明方法工艺过程简洁，通过对硫酸软骨素的预混合和后交联方式促进交联效果，提高支架材料的力学性能，并且整个制备过程使用的试剂安全无毒，生物相容性好。

附图说明

图1为本发明中实施例1的多孔支架的SEM电镜照片和种植MG63细胞并培养7天后的SEM电镜照片。

图2为本发明中实施例2的多孔支架的SEM电镜照片和种植MG63细胞并培养7天后的SEM电镜照片。

图3为本发明中实施例3的多孔支架的SEM电镜照片和种植MG63细胞并培养7天后的SEM电镜照片。

具体实施方式

以下实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：将1g胶原蛋白粉(Col)溶解于醋酸中，4℃下搅拌制成1.25％(w/v)的Col溶液；将1g硫酸软骨素(CS)溶解超纯水制成1.25％(w/v)的CS溶液；4℃搅拌的条件下按照体积比为9:1的比例，向Col溶液中滴加入CS溶液，滴加的速度0.5ml/min。

取420ml浓度为0.1mol/L得CaCl2溶液加入配制好的混合溶液中，混合20分钟并缓慢加热至40℃。然后缓慢加入NaH2PO4溶液（252ml，0.1mol/L）同时用0.1mol/L的NaOH调节pH值，pH值为7时出现白色悬浊液，持续24小时。用离心机（5000rpm，5min）离心饱和溶液，去除上清液，反复用去离子化水洗涤以去除盐离子，低温烘干，制得cs-col/HA复合材料白色粉末。

向cs-col/HA粉末中加入质量分数为3%的H2O2溶液，并加入1%质量分数的羧甲基纤维素，进行调和，调和至粘稠状后搅拌30分钟发泡，得到浆料；将所得到的浆料快速移入12孔细胞培养平板，并立即放入-20 ℃ 冰箱预冷冻24h；将冷冻24h后的载样细胞培养平板取出，放入-50 ℃ 冷冻干燥机中干燥，制得cs-col/HA复合多孔支架。

取cs-col/HA多孔支架浸泡于50mmol/L的2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40%乙醇溶液30min；取出，浸泡于含50mmol/L的 2-吗啉乙烷磺酸(MES)、20mmol/L的碳化二亚胺( EDC)、5mmol/L 的琥珀酰胺(NHS)的40%乙醇溶液24h；取出，将交联后材料在0.1 mol/L Na2HPO4中清洗2次，共1 h；1mol/L NaCl中清洗2次，共2 h；2mol/L NaCl中清洗24 h，用超清洗10次，-80℃冰箱冷冻3h后，冷冻干燥机中冻干，构建了硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石多孔支架。

该材料的硫酸软骨素含量与胶原蛋白比为1:9，多孔支架的力学强度参见表1。

将支架材料灭菌处理后种植MG63细胞，培养7天后，清洗，戊二醛固定，喷金后扫描电镜(SEM)观察，参见图1，细胞生长状态良好，证明支架材料具有良好的生物相容性。

实施例2：将1g胶原蛋白粉(Col)溶解于醋酸中，4℃下搅拌制成1.25％(w/v)的Col溶液；将1g硫酸软骨素(CS)溶解超纯水制成1.25％(w/v)的CS溶液；4℃搅拌的条件下按照体积比为7:1的比例，向Col溶液中滴加入CS溶液，滴加的速度0.5ml/min。

取420ml浓度为0.1mol/L得CaCl2溶液加入配制好的混合溶液中，混合20分钟并缓慢加热至40℃。然后缓慢加入NaH2PO4溶液（252ml，0.1mol/L）同时用0.1mol/L的NaOH调节pH值，pH值为7时出现白色悬浊液，持续24小时。用离心机（5000rpm，5min）离心饱和溶液，去除上清液，反复用去离子化水洗涤以去除盐离子，低温烘干，制得cs-col/HA复合材料白色粉末。

向cs-col/HA粉末中加入质量分数为3%的H2O2溶液，并加入1%质量分数的羧甲基纤维素，进行调和，调和至粘稠状后搅拌30分钟发泡，得到浆料；将所得到的浆料快速移入12孔细胞培养平板，并立即放入-20 ℃ 冰箱预冷冻24h；将冷冻24h后的载样细胞培养平板取出，放入-50 ℃ 冷冻干燥机中干燥，制得cs-col/HA复合多孔支架。

取cs-col/HA多孔支架浸泡于50mmol/L的2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40%乙醇溶液30min；取出，浸泡于含50mmol/L的 2-吗啉乙烷磺酸(MES)、20mmol/L的碳化二亚胺( EDC)、5mmol/L 的琥珀酰胺(NHS)的40%乙醇溶液24h；取出，将交联后材料在0.1 mol/L Na2HPO4中清洗2次，共1 h；1mol/L NaCl中清洗2次，共2 h；2mol/L NaCl中清洗24 h，用超清洗10次，-80℃冰箱冷冻3h后，冷冻干燥机中冻干，构建了硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石多孔支架。

该材料的硫酸软骨素含量与胶原蛋白比为1:7，多孔支架的力学强度参见表1。

将支架材料灭菌处理后种植MG63细胞，培养7天后，清洗，戊二醛固定，喷金后扫描电镜(SEM)观察，参见图2，细胞生长状态良好，证明支架材料具有良好的生物相容性。

实施例3：将1g胶原蛋白粉(Col)溶解于醋酸中，4℃下搅拌制成1.25％(w/v)的Col溶液；将1g硫酸软骨素(CS)溶解超纯水制成1.25％(w/v)的CS溶液；4℃搅拌的条件下按照体积比为9:1的比例，向Col溶液中滴加入CS溶液，滴加的速度0.5ml/min。

取420ml浓度为0.1mol/L得CaCl2溶液加入配制好的混合溶液中，混合20分钟并缓慢加热至40℃。然后缓慢加入NaH2PO4溶液（252ml，0.1mol/L）同时用0.1mol/L的NaOH调节pH值，pH值为7时出现白色悬浊液，持续24小时。用离心机（5000rpm，5min）离心饱和溶液，去除上清液，反复用去离子化水洗涤以去除盐离子，低温烘干，制得cs-col/HA复合材料白色粉末。

向cs-col/HA粉末中加入质量分数为3%的H2O2溶液，并加入1%质量分数的羧甲基纤维素，进行调和，调和至粘稠状后搅拌30分钟发泡，得到浆料；将所得到的浆料快速移入12孔细胞培养平板，并立即放入-20 ℃ 冰箱预冷冻24h；将冷冻24h后的载样细胞培养平板取出，放入-50 ℃ 冷冻干燥机中干燥，制得cs-col/HA复合多孔支架。

取cs-col/HA多孔支架浸泡于50mmol/L的2-吗啉乙烷磺酸(MES)的40%乙醇溶液30min；取出，浸泡于含50mmol/L的 2-吗啉乙烷磺酸(MES)、20mmol/L的碳化二亚胺( EDC)、5mmol/L 的琥珀酰胺(NHS)的40%乙醇溶液24h；取出，将交联后材料在0.1 mol/L Na2HPO4中清洗2次，共1 h；1mol/L NaCl中清洗2次，共2 h；2mol/L NaCl中清洗24 h，用超清洗10次，-80℃冰箱冷冻3h后，冷冻干燥机中冻干，构建了硫酸软骨素交联胶原蛋白/羟基磷灰石多孔支架。

该材料的硫酸软骨素含量与胶原蛋白比为1:5，多孔支架的力学强度参见表1。

将支架材料灭菌处理后种植MG63细胞，培养7天后，清洗，戊二醛固定，喷金后扫描电镜(SEM)观察，参见图3，细胞生长状态良好，证明支架材料具有良好的生物相容性。

表1    本发明所有实施例所得骨架材料的力学强度列表

编号抗压强度（MPa）抗弯强度（MPa）孔隙率（%）平均孔径（um）实施例13.643.277163实施例23.883.797368实施例34.324.757474