一种医用脂肪乳培养液制备肝细胞脂肪变性模型的方法

摘要

本发明采用高血清培养液与医用脂肪乳培养液制备肝细胞脂肪变性模型，改进了实验方法和操作，高血清和医用脂肪乳两种方法不仅从显微镜下观察到脂滴、脂滴融合的现象，还检测到了肝细胞内TG、TC的含量，经统计学处理发现两种方法均可成功建立脂肪变性肝L-02细胞模型。将二法分别作用于正常L-02细胞培养48h后发现：与正常组相比，医用脂肪乳诱导较高血清诱导的肝细胞内TG、TC含量均明显升高(P＜0.01)，且医用脂肪乳在各大医院均可购买，价格低廉，故将医用脂肪乳培养正常肝细胞诱导成脂肪变性肝细胞的方法作为本发明的造模方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种医用脂肪乳培养液制备肝细胞脂肪变性模型的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高、饮食结构的变化，冠心病、脑中风、糖尿病、肥胖等与脂代 谢异常相关的疾病发病率正在逐年的上升。其中，冠心病死亡率高居第二，仅次于癌症；有 文献报道，我国成人血脂异常患病率已高达18.6％，约1.6亿人血脂异常，其中高胆固醇血症 2.9％，高甘油三酯血症11.9％，低密度脂蛋白血症7.4％，另有3.9％的人血胆固醇边缘升高。 针对脂代谢异常的调控研究因其广阔的科学研究价值、迫切的社会医疗需要而越来越受到广 大科学研究者的关注。

临床上将肝细胞内脂质蓄积超过肝湿重的5％，或组织学上每单位面积超过1/3以上肝细 胞脂变时，称为脂肪肝。其中，超过肝湿重的5％为轻度脂肪肝，10％以上为中度脂肪肝，25％ 以上为重度脂肪肝；或当脂肪变性和脂肪贮积的肝细胞＜1/3者为肝细胞脂肪变性，其中，占 肝小叶1/3～1/2为轻度脂肪肝；占肝小叶1/2～2/3为中度脂肪肝；占肝小叶2/3以上者或肝 细胞弥漫脂肪变性呈鱼网状者为重度脂肪肝。

肝L-02细胞已经被广泛的用于肝药理活性、肝毒性及人工肝的研究，其脂肪变性肝L-02 细胞则常常用于进行肝细胞脂代谢相关研究，是研究中药及其有效成分降脂作用的良好模型， 已用于三七总皂苷等中药有效成分降脂机理的研究。

目前通常采用给予高浓度的胎牛血清、医用脂肪乳、软脂酸、油酸等建立脂肪变性肝L-02 细胞模型，还有用乙醇、四氯化碳等化学物质损伤肝细胞造成脂肪变性模型。但是，没有文 献报道对于建立脂肪变性肝L-02细胞模型的条件进行深入的研究，该细胞模型的建立根据不 同的实验操作和实验设计，经常存在仅能检测出含量较少甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC) 的情况。本发明优异效果的一方面是制备方法制备得到的医用脂肪乳培养液制备肝细胞脂肪 变性模型，对甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)检测效果高，另一方面，对脂肪堆积有特异 敏感性，而且不影响整个细胞的糖代谢内容。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪变性肝细胞模型的制备方法，通过该方法建立的细胞模型， 可以评价不同药物对脂肪变性肝L-02细胞脂代谢的干预作用，有助于筛选对脂代谢影响显著 的药物，并研究其调节脂代谢的机制。

本发明的英文缩略词代表含义如下：

本发明采用经典的高血清培养液与医用脂肪乳培养液制备肝细胞脂肪变性模型，改进了 实验方法和操作，高血清和医用脂肪乳两种方法不仅从显微镜下观察到脂滴、脂滴融合的现 象，还检测到了肝细胞内TG、TC的含量，经统计学处理发现两种方法均可成功建立脂肪变 性肝L-02细胞模型。

对于诱导时间的筛选，实验中观察了12h、24h、36h、48h和72h不同时间段的造模图片 和TG、TC的含量发现脂滴随造模时间的延长而增加，但超过一定时间后死细胞开始增多， 出现大片的空洞区域，故选择36h为诱导的最佳时间。将二法分别作用于正常L-02细胞培养 48h后发现：与正常组相比，医用脂肪乳诱导较高血清诱导的肝细胞内TG、TC含量均明显 升高(P＜0.01)，且医用脂肪乳在各大医院均可购买，价格低廉，故将医用脂肪乳培养正常肝 细胞诱导成脂肪变性肝细胞的方法作为本课题的造模方法。

本发明的方法包括如下步骤：

A.培养液及医用脂肪乳培养液的配制：

培养液1的配制：将1.69g4-羟乙基哌嗪乙磺酸，150mg L-谷氨酰胺，165mg丙酮酸钠， 2g NaHCO₃和10.0g RPMI-1640粉末加入1L水中，室温配制成溶液，加pH调节剂调节pH 至7.20，过滤并除菌分装，低温保存备用；

培养液2的配制：将50mL的胎牛血清与450mL上述培养液1混匀，低温保存备用；

培养液3的配制：将1mL的胎牛血清与499mL上述培养液1混匀，低温保存备用；

250mL医用脂肪乳配方：50g大豆油、3g卵磷脂，5.5g甘油，余量的水；

医用脂肪乳诱导液的配制：将10mL的胎牛血清与5mL的上述医用脂肪乳混匀，用上 述培养液1定容至100mL；

B.取对数生长期的L-02肝细胞，用0.25(w/v，g/mL)％胰蛋白酶消化，细胞计数后用 培养液2配成单个细胞悬液，以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于6孔培养板中，每孔培养液 2的体积为2mL；将培养板移入CO₂培养箱中，在37℃、5％CO₂(v/v)及饱和湿度条件下， 培养48小时使其充 分贴壁生长，待细胞长至80％融合时，换成培养液3培养24h，使细胞周期同步化；

C.在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下，将采用上述医用脂肪乳诱导液诱导步骤B得到 的细胞12-72h，得到产品即肝细胞脂肪变性模型。

上述RPMI-1640粉末：可从美国Gibco Invitrogen公司购得，Cat.No.31800-014。

其中，特别优选步骤C诱导时间是36小时。

步骤A中水为超纯水，pH调节剂为盐酸或醋酸，过滤采用0.22μm孔径滤器，低温保存 在4摄氏度下进行。

当步骤C诱导时间为36小时，细胞造模后，除了胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)都明 显成倍增高外，我们还发现有以下惊人的效果：

(1)细胞中游离脂肪酸的含量显著增高，而游离脂肪酸的量正是反应细胞脂肪化的另一 项重要内容；

(2)细胞中的葡萄糖水半没有变化。

由此该特殊诱导时间点获得的细胞模型对脂肪堆积有特异敏感性，而且不影响整个细胞 的糖代谢情况。

附图说明

图1正常肝L-02细胞(10×10)

图2正常肝L-02细胞(10×20)

图3高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，12h(10×10)

图4高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，12h(10×20)

图5高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，24h(10×10)

图6高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，24h(10×20)

图7高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，36h(10×10)

图8高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，36h(10×20)

图9高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，48h(10×10)

图10高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，48h(10×20)

图11高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，72h(10×10)

图12高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，72h(10×20)

图13高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，84h(10×10)

图14高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，84h(10×20)

图15高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，96h(10×10)

图16高血清诱导脂肪变性肝L-02细胞的形态，96h(10×20)

图17医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，12h(10×10)

图18医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，12h(10×20)

图19医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，24h(10×10)

图20医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，36h(10×20)

图21医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，36h(10×40)

图22医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，48h(10×10)

图23医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，48h(10×20)

图24医用脂肪乳诱导脂肪变性肝L-02细胞模型，48h(10×40)

图25高血清与医用脂肪乳诱导时的外观图

图26医用脂肪乳诱导后肝细胞内TG、TC含量变化(^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与相同时间的对 照组相比；n＝6)

图27两种方法诱导后肝细胞内TG、TC含量(^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与相同时间的对照组相 比；n＝6)

图28医用脂肪乳诱导36小时后肝细胞内FFA含量变化(^＊＊＊P＜0.001与相同时间的对照组 相比；n＝6)

图29医用脂肪乳诱导36小时后肝细胞内葡萄糖含量变化(n＝6)

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明做出进-步说明。

实验细胞：

正常人肝L-02细胞，购自中国科学院昆明动物研究所。

实验试剂：

(1)RPMI-1640粉末：美国Gibco lnvitrogen公司，Cat.No.31800-014

(2)胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)：Hyclone

(3)医用脂肪乳：每250mL医用脂肪乳内含50g大豆油、3g卵磷脂和5.5g甘油

(4)胰蛋白酶：1∶250，美国Amresco公司，华美生物工程公司进口分装(批号：Lot 201112)

(5)Triton-X100：美国Sigma公司(批号：Cat.No.T8200)

(6)甘油三酯试剂盒(TG)：中生北控生物科技股份有限公司，Lot：100461.201009、 100481.201010

(7)总胆固醇试剂盒(TC)：长春汇力生物技术有限公司，批号：20100302、20100908

(8)葡萄糖试剂盒(GLU)：长春汇力生物技术有限公司，批号：20100221、20100908

(9)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)：长春赛诺迈德医学技术有限责任公司，批号： 20100611

(8)Hepes、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、丙酮酸钠(pyruvic acid sodium salt)、碳酸氢 钠(NaHCO₃)为化学纯或分析纯，购自国内公司

细胞培养试剂的配制：

(1)RPMI-1640培养液的配制：

取Hepes：1.69g L-Glutamine：150mg Pyruril Acid Sodium Salt：165mg

NaHCO₃：2g RPMI-1640粉：10.0g

取1L超纯水加入上述粉末中，于室温下搅拌至溶解，加HCl调节pH至7.20，0.22μm 孔径滤器过滤除菌分装，4℃保存，备用。

(2)正常培养液的配制(含10％FBS的RPMI-1640培养液)

将50mL的FBS与450mL RPMI-1640培养基混匀，4℃冰箱保存备用。

(3)两种诱导液的配制(高血清RPMI-1640诱导液和医用脂肪乳RPMI-1640诱导液)

高血清RPMI-1640诱导液(诱导液1)：将50mLFBS与50mL无血清的RPMI-1640混 匀即配制成含50％FBS的高血清诱导液；

医用脂肪乳RPMI-1640诱导液(诱导液2)：将10mL的FBS与5mL的20％医用脂肪 乳混匀，用无血清的RPMI-1640定容到100mL即为医用脂肪乳诱导液。

(4)磷酸缓冲液(PBS)分别称取NaCl 8g，KCl 0.2g，NaHPO₄.12H₂O 3.49g，K₂HPO₄0.2g，溶于800ml超纯水，充分搅拌均匀，测pH7.4，定容至1000ml，0.22μm孔径滤器过 滤除菌分装，4℃保存，备用。

(5)0.25％胰酶溶液：胰蛋白酶0.5g，溶于200mL PBS缓冲液中，0.22μm孔径滤器 过滤除菌分装，4℃保存，备用。

(6)冻存液：9ml培养液+1mlDMSO现用现配

(7)0.01％Triton X-100溶液：100mL双蒸水中加入100μL Triton X-100，充分搅拌混 匀后，4℃保存。

实验仪器：

(1)CO₂细胞培养箱(3111水套型)：Thermo Electron Corporation

(2)水处理超滤器：Millipore公司

(3)超净工作台(SW-CJ-IFD型)：苏州安泰空气技术有限公司

(4)台式离心机(80-2型)：上海医疗器械有限公司手术器械厂

(5)SUNO全自动生化分析仪(AB-1020)：中国长春赛诺迈德医学技术有限公司

(6)荧光倒置相差显微镜(ECLIPSE TS 100)：日本Nikon公司

(7)磁力搅拌器(85-2型)：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司

(8)旋涡混合器(QL-861型)：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司

(9)pH计(FE20)：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司

(10)天平(AB 265-S)：METTLER TOLEDO公司

统计方法：

计量资料数据以()表示，数据符合正态分布、方差齐者用t检验，方差不齐者用 t检验。

实验方法：

1肝L-02细胞的复苏、培养、传代、冻存

(1)细胞复苏

①将冻存有L-02细胞的Eppendorf管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，震摇使 其尽快融化。

②酒精灯消毒Eppendorf管盖子，打开盖子用吸管吸出细胞悬液，移入25ml培养皿中， 并滴加5ml含10％FBS的RPMI-1640培养液，置于培养箱(5％CO₂、37℃)内培养，次日 换液一次，以后隔日换液一次，继续培养。

(2)细胞的培养

根据细胞生长情况，待细胞长至80％-90％融合(约2d-3d)，用胰蛋白酶消化，按1∶3 的比例传代，置培养箱中培养。

(3)细胞冻存

取对数生长期细胞冻存，冻存细胞前24h换液一次。依照传代的步骤，离心后加入细 胞冻存液1.5mL吹散细胞，将细胞悬液转入冻存管中。在将冻存管分别置4℃ 30min，-20℃ 4h，-80℃过夜后转入液氮罐冻存。

2脂肪变性肝L-02细胞模型的制备

(1)50％FBS诱导建立肝细胞脂肪变性模型

取对数生长期的L-02细胞用0.25％胰蛋白酶消化，细胞计数后用正常培养液配成单个细 胞悬液，以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于6孔培养板中，每孔培养液体积2mL。将培养板 移入CO₂培养箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下，培养48h使其充分贴壁生长，待 细胞长至80％融合时，换成G₀液培养24h，使细胞周期同步化。加入以下处理因素：

①对照组继续给予正常培养液(含10％FBS的RPMI-1640培养液)培养；

②模型组给予诱导液1(含50％FBS的RPMI-1640培养液)培养；

在上述条件下分别诱导12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h， 各时间段均设6个复孔，分别置于倒置显微镜下观察细胞形态并使用相应试剂盒于全自动生 化分析仪检测TG、TC含量。

(2)医用脂肪乳诱导建立肝细胞脂肪变性模型

传板的方法同上，加入的处理因素为：

①对照组继续给予正常培养液(含10％FBS的RPMI-1640诱导液)培养；

②模型组给予诱导液2(含10％FBS的医用脂肪乳RPMI-1640诱导液)培养；在上述 条件下分别诱导12h、24h、36h、48h，各时间段均设6个复孔，并分别置于倒置显微镜下 观察细胞形态并使用相应试剂盒于全自动生化分析仪检测TG、TC含量。

(3)肝细胞内TG、TC含量的测定

在各时间点分别对各组细胞进行如下处理：PBS洗涤细胞1-2遍，加入1mL胰酶消化细 胞，再加入正常培养液停止消化，并吹打细胞(确保将各孔内的所有细胞吹下)，将各孔中的 细胞悬液置于1.5mL离心管中，2000r/min，离心5min，弃上清，加入Triton反复冻融三次。 当细胞充分裂解后，4℃，12000r/min，离心10min，使用相应试剂盒于全自动生化分析仪测 定TG和TC含量。

实验结果：

1细胞形态的改变：

参见附图1-25；下表。

表1-1两种诱导方法对肝L-02细胞形态的影响

2两种诱导方法肝细胞内TG、TC含量的变化

(1)诱导液1肝细胞内TG、TC含量

将细胞按1.2.3裂解后，按照试剂盒的说明书测定TG、TC的含量。(表略)

(2)诱导液2肝细胞内TG、TC含量

表1-2医用脂肪乳诱导后肝细胞内TG含量

^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与相同时间的对照组相比；n＝6

表1-3医用脂肪乳诱导后肝细胞内TC含量

^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与相同时间的对照组相比；n＝6

可以看出：与正常组比较，12h、24h、36h、48h模型组的肝细胞内TG、TC含量均升高， 且36h、48h模型组的肝细胞内TG、TC含量均明显升高(P＜0.01)，表明造模液2作用于正 常的肝L-02细胞36h、48h后均可以诱导肝细胞发生脂肪变性。从12h到48h肝细胞内的脂 肪滴随着诱导时间的延长而蓄积的越多，但在实验中也观察到当诱导时间长达48h后有大部 分细胞边缘开始变圆、变亮，推测诱导时间过长可能对细胞有一定的损伤，且诱导36小时、 48小时组的总胆固醇、甘油三酯含量无明显差异，故本实验选择36h作为肝细胞脂肪变性模 型的最佳时间。

(3)两种方法诱导36h后肝细胞内TG、TC含量的变化

表1-4两种方法诱导后肝细胞内TG、TC含量

^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01与对照组相比；n＝6

结果表明：两种方法诱导后脂肪变性肝L-02细胞36h后均可升高肝细胞内TG、TC的含 量。与对照组相比，两种方法均显著升高细胞内TC含量(P＜0.01)，诱导液2细胞内TG含 量明显升高(P＜0.01)，而诱导液1细胞内TG含量与对照组无显著影响(P＞0.05)。综上可 知诱导液2即用医用脂肪乳作用于正常肝L-02细胞可以造成脂肪变性肝L-02细胞模型。

实验小结：

用诱导液1采用24孔板培养细胞时未检测出肝细胞内TG、TC的含量，考虑可能是用此 法诱导时，细胞的数量少，以致测出的量很少。而后改进用6孔细胞培养板，两种诱导方法 均检测出TG、TC的含量，从诱导图片与TG、TC含量的变化可知，两种诱导方法均可成功 建立脂肪变性肝L-02细胞模型。与正常组相比，诱导液2组较诱导液1组的肝细胞内TG、 TC含量均明显升高(P＜0.01)，表明此法可成功建立脂肪变性肝L-02细胞模型。

此外，实验中还检测了培养液中葡萄糖(GLU)的含量(参见附图29)，结果表明模型 组和对照组细胞中葡萄糖的含量没有差异(P＞0.05)，说明脂肪变性肝细胞与正常肝细胞对葡 萄糖的消耗没有差别，也表示脂肪变性肝细胞中脂肪的来源是通过给予医用脂肪乳造模液而 产生的，并非培养液中的葡萄糖转变为脂类。因而此模型对糖代谢的影响未能确定，有待进 一步研究证实。且医用脂肪乳在各大医院均可购买，价格低廉，故用选用医用脂肪乳诱导在 一定程度上节省了时间和资金。

本发明通过一系列的筛选，最终改进了实验方法，尤其是通过对于不同培养液组成、不 同时间点对于肝细胞的诱导作用，最终选择了以下培养液的组成：培养液1的配制：将1.69g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，150mg L-谷氨酰胺，165mg丙酮酸钠，2g NaHCO₃和10.0g RPMI-1640 粉末加入1L水中，室温配制成溶液，加pH调节剂调节pH至7.20，过滤并除菌分装，低温 保存备用；

培养液2的配制：将50mL的胎牛血清与450mL上述培养液1混匀，低温保存备用；

培养液3的配制：将1mL的胎牛血清与499mL上述培养液1混匀，低温保存备用；

250mL医用脂肪乳配方：50g大豆油、3g卵磷脂，5.5g甘油，余量的水；

医用脂肪乳诱导液的配制：将10mL的胎牛血清与5mL的上述医用脂肪乳混匀，用上 述培养液1定容至100mL；

选择了最佳诱导时间：36h。

该制备方法制备得到的医用脂肪乳培养液制备肝细胞脂肪变性模型，与现有技术相比， 不仅对甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)检测效果高，而且对脂肪堆积有特异敏感性，不影 响整个细胞的糖代谢内容，具有无法预料的技术效果。