产酸克雷伯菌菌株及其应用和三唑磷农药残留降解菌剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种产酸克雷伯菌菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为CCTCC M2011350。该菌株可应用于降解三唑磷农药残留，例如做成一种三唑磷农药残留降解菌剂，该菌剂主要是由本发明的菌株与基础液体培养基配制而成的菌悬液，其制备方法包括：先将菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至单菌落出现；再将单菌落接入至种子培养瓶中，用种子培养基培养至对数生长期；再接入至生产瓶中用生产培养基培养至对数生长期，培养液的接入量不少于菌株生产培养基总体积的1％；最后出瓶分装即可。本发明具有生产成本低、农药去除效果高、无毒、环保等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌及其应用，尤其涉及一种细菌菌株及其在降解农药残留中的应用。

背景技术

目前，化学农药已广泛应用于现代农药生产和卫生防疫，化学农药的大量使用，大大促 进了现代农业生产的发展。然而，化学农药的不合理使用甚至滥用，导致大量化学农药流失 到生态环境中，对生态系统造成了严重的危害；而且，化学农药的大量使用，以及生态环境 中残留的化学农药，容易导致生产的农产品中农药残留的超标，影响农产品的品质，并对人 们的身体健康带来严重威胁，对农产品的出口产生消极影响。

有机磷杀虫剂是我国使用最广泛、用量最大的一类杀虫剂，其品种繁多。从20世纪50 年代，有机磷杀虫剂在我国开始生产使用，此后被广泛用于粮食、蔬菜和果树等多种作物。 有机磷杀虫剂属于神经毒物，主要抑制血液和组织中乙酰胆碱酯酶的活性，导致神经递质、 乙酰胆碱的大量蓄积，从而阻断了神经传导，引起中枢神经系统中毒。大多数品种对人、畜 毒性偏高，有些品种属于剧毒，如甲拌磷、甲胺磷、内吸磷等。

农业部的调查统计表明，该类农药是目前我国出口蔬菜、水果中主要的三类农药残留之 一。欧盟2007/12/EC农药残留标准以及日本2006年出台“肯定列表制度”，都对有机磷杀虫 剂农药残留限量作出严格的规定，其中规定有机磷农药的检出限量小于0.02mg/Kg，这些残 留量限定，严重影响了我国农产品的出口。

随着人们生活水平的提高以及环境保护意识的增强，全社会对食品安全以及生态环境保 护的关注度逐步提高。但是，根据我国的农业生产现状以及人口状况来看，停止或大量减少 农药的使用，大量生产无农药残留的绿色农产品，在目前及今后一段时间是行不通的，农药 作为控制病虫草的有效手段还将继续在农业生产中发挥不可替代的作用。因此，在农业生产 上，如何解决农药使用与残留这个两难问题成为研究热点。

大量研究表明，以微生物修复为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生 产环境中的农药残留物提供了可行的途径。也有研究表明，许多微生物还具有促进作物生长， 修复局部区域生态环境的作用。该技术不仅高效安全，而且经济实用，操作简便，目前已成 为去除农药残留污染的一种重要方法。然而，微生物修复的前提是筛选高效安全的微生物资 源，制备出使用方便的菌剂，并进行合理化地应用，这都是本领域技术人员需要面临的技术 难题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种生产成本低、农药去除 效果高、无毒、环保的产酸克雷伯菌菌株及该菌株的应用，具体还提供一种低成本、操作简 便、效果好的三唑磷农药残留降解菌剂及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种产酸克雷伯菌菌株，所述产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)菌株为保藏于中国典型 培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：M2011350的菌株。该菌株的保藏单位为中国典 型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2011年 10月12日，该菌株被命名为产酸克雷伯菌TDB-1(Klebsiella oxytoca TDB-1)。

上述的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350通过以下方法筛选得到：将采自农田灌溉水渠的 水样2.0mL加入120mL基础液体培养基(MM培养基)中，培养24h后，取1％接种到含 三唑磷10mg/L的MM培养基中，30±2℃，180rpm，培养24h后，取300μL菌液稀释涂布 到以三唑磷50mg/L为唯一碳源的基础固体培养基(MMS培养基)中，培养至菌落出现，挑 取菌落形态不同的菌，分别接种到含三唑磷50mg/L为唯一碳源的MM培养基中，30±2℃、 180rpm，培养24d后，取1％分别接种到以三唑磷100mg/L为唯一碳源的MM培养基中。24h 后检测农药浓度，以含相同浓度的三唑磷，相同培养条件不接种菌的培养基为对照。选择降 解率最大的菌株进行后续研究。将该菌株接种于100mL MM培养基中培养，30±2℃、180rpm， 培养，梯度稀释平板培养法测定菌株生物量，后续实验中菌液浓度调整至约10⁹cfu/mL。

上述的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350优选为具有以下主要特征的菌株：

球状，具有荚膜，G^-，V-P反应阳性，甲基红反应阳性，明胶液化阴性，吲哚反应阳性， 最适生长温度为25℃～35℃，最适生长pH值为5～9，16S rDNA序列长度为1505bp，在 Genbank中的登录号为JQ068819。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述产酸克雷伯菌CCTCC M2011350的应用， 将其应用于降解三唑磷农药残留。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种三唑磷农药残留降解菌剂，所述菌剂主要是 由上述的产酸克雷伯菌CCTCC M2011350与基础液体培养基配制而成的菌悬液。所述菌剂中 产酸克雷伯菌CCTCC M2011350的浓度优选为≥2×10⁹cfu/mL。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的三唑磷农药残留降解菌剂的制备方法， 包括以下步骤：

(1)活化：将所述产酸克雷伯菌CCTCC M2011350的保存种按平板培养法进行培养， 培养至单菌落出现；

(2)种子培养：将所述单菌落接入至种子培养瓶(例如三角瓶)中，用产酸克雷伯菌菌 株种子培养基培养至对数生长期；

(3)生产培养：将步骤(2)培养得到的培养液接入至生产瓶中，用产酸克雷伯菌菌株 生产培养基培养至对数生长期，所述培养液的接入量不少于所述产酸克雷伯菌菌株生产培养 基总体积的1％(优选为1％～3％)；

(4)出瓶分装：将步骤(3)培养得到的培养液出瓶分装得到三唑磷农药残留降解菌剂。

上述的制备方法中，优选地，所述步骤(1)中，平板培养法是指用基础固体培养基(MMS 培养基)对产酸克雷伯菌菌株的保存种进行培养。所述MMS培养基的优选配方含：(NH4)₂SO₄1g/L、K₂HPO₄7g/L、KH₂PO₄3g/L、柠檬酸钠0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、葡萄糖5g/L和 琼脂1.5g/L，pH7.0。

上述的制备方法中，优选地，所述步骤(2)中的产酸克雷伯菌菌株种子培养基和所述步 骤(3)中的产酸克雷伯菌菌株生产培养基均为基础液体培养基(MM培养基)。所述MM培 养基的优选配方含：(NH₄)₂SO₄ 1g/L、K₂HPO₄ 7g/L、KH₂PO₄ 3g/L、柠檬酸钠0.5g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.1g/L和葡萄糖5g/L，pH7.0。

上述的制备方法中，优选地，所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的每一次培养过程 中，pH值均控制为7.0～7.2，培养温度均控制为30℃～35℃；所述步骤(2)、步骤(3)的 每一次培养均为振荡培养，振荡速度为150～200rpm。

与现有技术相比，本发明的优点为：

1、本发明的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350，生产成本低、农药去除效果好、高效、 无毒、环保，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到三唑磷农药残留降解 菌剂，使用本发明菌株制备得到的降解菌剂具有生产成本低、使用方便，去除效果好等优点， 能够有效用于农业生产中无农药残留粮食、水果、蔬菜等的生产。

2、本发明的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350不仅可耐受高浓度的三唑磷，可用于实验 室条件下培养基中高浓度三唑磷农药的降解，还可在耐受较宽的pH范围(4～10)和温度范 围(25℃～35℃)降解三唑磷。

3、本发明的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350的应用可以在对农作物正常施用化学农药、 消灭虫害进而保证作物产量的前提下，又能使粮食、水果、蔬菜等农作物中的农药残留降至 很低或没有；而且，菌株本身具有多种营养成分及活性物质，能够有效促进作物生长，兼具 防治作物病害的作用，具有安全、无毒、环保的特点；此外，由于本发明的菌株可以应用于 降解高浓度三唑磷农药，因此亦可用于农药生产废水的处理。

一种产酸克雷伯菌菌株(Klebsiella oxytoca TDB-1)，其保藏单位为中国典型培养物保藏 中心(简称CCTCC)，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏号为CCTCC M 2011350，保藏 日期为2011年10月12日。

附图说明

图1是实施例1中的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350的扫描电镜图。

图2是实施例1中的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350耐受温度试验的测试结果图。

图3是实施例1中的产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350耐受pH试验的测试结果图。

图4是实施例1中的三唑磷浓度测定标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：

一种如图1所示的本发明的产酸克雷伯菌菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心 CCTCC，保藏号为CCTCC M 2011350。该菌株具有以下主要特征：

球状，具有荚膜，G^-，V-P反应阳性，甲基红反应阳性，明胶液化阴性，吲哚反应阳性， 最适生长温度为25℃～35℃，最适生长pH值为5～9，16S rDNA序列长度为1505bp，在 Genbank中的登录号为JQ068819。

本实施例的产酸克雷伯菌菌株可用于降解三唑磷农药残留。例如一种本发明的包含本实 施例产酸克雷伯菌菌株的三唑磷农药残留降解菌剂，该菌剂是由本实施例菌株与MM培养基 配制成的浓度为2×10⁹cfu/mL的菌悬液。

本实施例的三唑磷农药降解菌剂的制备方法具体包括以下步骤：

(1)活化：将产酸克雷伯菌CCTCC M 2011350的保存种按平板培养法(使用MMS固 体培养基)进行培养，培养至单菌落出现；

(2)种子培养：将单菌落接入至250mL三角瓶中，用MM液体培养基培养至对数生长 期；

(3)生产培养：将步骤(2)培养得到的培养液接入至生产瓶中，用MM液体培养基培 养至对数生长期，培养液的接入量不少于MM液体培养基总体积的1％；

(4)出瓶分装：将步骤(3)培养得到的培养液出瓶分装得到三唑磷农药残留降解菌剂。 本实施例方法的全流程培养时间为4天，培养结束后，菌体数量达到2×10⁹cfu/mL以上。

菌株耐受三唑磷浓度、pH和温度范围的测试

用丙酮溶解三唑磷，然后添加到实验培养基中至三唑磷的终浓度为30mg/L，所用的实 验培养基为：(NH₄)₂SO₄ 1g/L、K₂HPO₄ 7g/L、KH₂PO₄ 3g/L、柠檬酸钠0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L和葡萄糖5g/L；pH耐受试验培养基的pH值为4～10，温度为35℃；温度耐受试验的 培养基pH值为7.0～7.2，温度为5℃～45℃；将实施例1中制备的菌剂按1％(v/v)接种到 实验培养基中培养。定时取样，分光光度计(Tu-1901)测定菌株的生物量(生物量以OD₆₀₀表示)，测定结果如图2、图3所示。

由图2可知，菌株在含30mg/L三唑磷的MM培养基中，在25℃～35℃快速生长，低于 25℃或高于45℃，则菌株的生长受到明显的抑制。

由图3可知，菌株在pH值为4～10的范围内，均能良好生长，表明菌株具有良好的耐 受pH的能力；pH值为4和10时，菌株的生长具有一定抑制，表现为菌株进行对数生长期 的时间延长3h～6h，但仅pH值为10时，后期的总生物量有所降低；pH为4时，整个培养 时期，生物量较低，但是一直在增加。

由以上可知，菌株可耐受30mg/L三唑磷。

可见本发明的产酸克雷伯菌菌株CCTCC M 2011350不仅可耐受高浓度的三唑磷，用于实 验室条件下培养基中高浓度三唑磷农药的降解，还在耐受较宽的pH范围(4～10)和温度范 围(25℃～35℃)降解三唑磷。

菌株在降解培养基中高浓度三唑磷的应用

用丙酮溶解三唑磷，添加到实验培养基中至三唑磷的终浓度为30mg/L，所用的实验培养 基为：(NH4)₂SO4 1g/L，K₂HPO₄ 7g/L，KH₂PO₄ 3g/L，柠檬酸钠0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，葡萄糖5g/L，该实验培养基的pH值为7.0～7.2，温度为30℃～35℃；将实施例1 中制备的菌剂按1％(v/v)接种到该实验培养基中培养。

定时取样，用石油醚萃取培养后实验培养基中的三唑磷，分光光度计(Tu-1901)测定三 唑磷残留，测定前用已知三唑磷浓度梯度做测定标准曲线(见表1和图4)。以不加菌剂的实 验培养基为对照(相当于三唑磷未处理，浓度不变)。所有处理重复三次，测定结果见下表2、 表3所示。三唑磷降解产物对硝基苯酚在OD405有特异吸收峰，根据对硝基苯酚产生量可以 换算三唑磷的降解量。图4是根据配置的已知等差浓度梯度的三唑磷与光吸收值(OD405) (表1)的相关性，R2＝0.9901表明三唑磷降解产生的对硝基苯酚在OD405的光吸收值与对 硝基苯酚在一定范围内相关性高，可以利用OD405光吸收值测定对硝基苯酚的浓度，从而换 算出三唑磷降解的浓度。

由表3可见，利用实施例1的菌株降解三唑磷，前10min降解速率为0.72mg/L min；20min 降解速率为0.37mg/L min；30min降解速率为0.25mg/L min；40min降解速率为0.19mg/L min。

表1：标准曲线制作三唑磷浓度梯度

表2：菌株降解三唑磷不同取样时间的光吸收值

 取样时间(min)  光吸收值均值(OD₄₀₅)   三唑磷浓度(mg/L)   10   2.254   22.80   20   2.234   22.62

表3：菌株对三唑磷降解效率

注：Ct：取样时间三唑磷浓度；Co：三唑磷起始浓度30mg/L。

实施例2：菌株降解农田排水沟中水样的三唑磷。

用丙酮溶解三唑磷，添加到水样中，至三唑磷的终浓度为20mg/L，将实施例1中制备的 三唑磷农药残留降解菌剂按1％(v/v)接种到该水样中培养。

定时取样，用石油醚萃取三唑磷，分光光度计(Tu-1901)测定三唑磷残留，测定前用已 知三唑磷浓度梯度做测定标准曲线(见表1和图4)。以不加菌剂的水样为对照。所有处理重 复三次，测定结果见下表4所示。

由表4可见，利用实施例1的菌株降解三唑磷，20min降解速率为0.30mg/L min。

表4：菌株降解水样中三唑磷的效率