一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法

摘要

一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法，属于超高分辨率显微成像的方法。以显微镜为成像平台，以成像检测器为记录仪，以有闪烁(blinking)现象的衍射极限距离内的发光个体为测量对象，以光栅为识别手段，可以测量10－200纳米距离内的发射不同波长的发光个体之间的距离。具体方案步骤是：（1）在检测器前放置光栅进行光谱成像；（2）记录不同发光个体的一级条纹的“明”与“暗”；（3）超分辨定位发光波长不同的发光体中心；（4）光学平台漂移的校正。本发明不需要复杂的光学技术和专业的操作者，对任何具有闪烁现象的多色发光体均可适用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种超高分辨率显微成像的方法，特别是一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法。

背景技术：

    远场光学成像的分辨率受衍射极限限制，在可见光范围内难以测量小于200nm的距离。提高光学影像的分辨率一直是远场光学显微成像的研究目标之一。能够突破衍射极限的远场光学成像方法被称为远场纳米显微技术。与近场扫描光学显微镜相比，远场方法避免了实体探针对样品的干扰，可以实现无损检测及活细胞检测。

    已经报道的单分子远场纳米成像的技术有如下三种：①利用荧光分子漂白时间的差异，分别确定检测区内各分子的位置，可以实现8nm 的分辨率；②光激活定位显微术（PALM） 法利用某些荧光分子经光激活后在检测波长下发出荧光的性质，交替施加激活光和检测光，大体控制分子发射荧光的顺序；③超分辨随机光重建显微镜（STORM） 以红、绿两种激光，可控、可逆地开关Cy3/Cy5 染料对中的Cy5 荧光，实现20-30nm 的成像分辨率。众所周知，多波长的同时成像（即多色成像）在视觉效果、信息通量等方面均优于单波长成像。与发射单一波长荧光（简称：单色）的单分子纳米成像原理相似，若能从时序上或空间上分别定位发射不同波长荧光（简称：多色）的分子，则可以实现多色单分子间小于衍射极限距离的测量。Nie利用单通道彩色CCD 和双色荧光微球证实了这一方法的可行性，但是该方法的灵敏度尚有待提高，目前做不到单个纳米颗粒和单个分子的水平。  

    现有超分辨显微成像方法，大多仪器复杂，成本高，应用范围有限，需要专业人员操作、分析。单分子和单个纳米粒子水平上的多色超分辨成像尚未实现。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种测量小于衍射极限距离的光学成像方法，解决单分子和单个粒子水平上不能实现多色超分辨成像的问题，填补技术空白。

本发明的目的是这样实现的：以显微镜为成像平台，以成像检测器为记录仪，以有闪烁现象的衍射极限距离内的发光个体为测量对象，以光栅为识别手段，测量10－200纳米距离内的发射不同波长的发光个体之间的距离；光栅对有闪烁现象的不同发光波长的发光个体进行光谱识别，分别超分辨定位；

所述发光个体是荧光分子，量子点，银簇，碳点，发光纳米颗粒；

所述的光栅是透射光栅、反射光栅；

所述发光波长在可见光范围内即300－800纳米；

基于光栅分光的超分辨定位，具体实施方案为：

（1）、构建标尺：选用发射波长不同的红色与绿色量子点（QD）荧光标记物，分别与两条互补的单链DNA连接，形成“单链DNA-量子点（ssDNA-QD）”交联物；将两种颜色的“单链DNA-量子点”交联物混匀，杂交，形成“红色量子点-DNA-绿色量子点（QD_red-DNA-QD_green）”复合物；DNA长度、量子点半径已知，该标尺长度已知；

    （2）、成像装置： 在成像检测器前放置透射光栅，利用透射光栅分光原理，实现不同发射波长的荧光标记物的光谱成像；成像检测器安置在显微镜上；

    （3）、超分辨定位：用成像装置连续拍摄“红色量子点-DNA-绿色量子点”样品，当图片中只有一个一级条纹时，表明此时只有一种颜色的量子点发光，则其零级光斑可用于此发光量子点的超分辨定位；同样，当只出现另一条一级条纹时，另一种量子点亦可超分辨定位；这样即可分别定位两种量子点中心；

    （4）、漂移的校正：在进行分析的图片上选取一单色发光点作为参考点，该参考点中心随时间的变化即为平台漂移，根据不同帧图片中心的移动轨迹来校正光学平台的漂移；然后计算量子点间的距离；

（5）、定位准确性：按照上述1-5步，测量三种不同长度DNA间的不同颜色量子点的距离；用三种不同距离与三种不同碱基对作图，线性回归计算碱基对的距离，考量定位的准确性；所述的三种不同长度分别为15个碱基对15bp；或者为30个碱基对30bp，或者为45个碱基对45bp。

该方案中以双色量子点标记DNA片段作为标尺,该标尺已知长度且小于衍射极限距离，用来验证本发明的可靠性和测量精确性；通过在EMCCD检测器前放置透射光栅进行光谱成像，根据一级条纹“on”与 “off”的交替,超分辨定位不同颜色量子点的中心；具体步骤为：（1）标尺的制备；（2）于EMCCD检测器前放置光栅；（3）将标尺样品光谱成像；（4）记录不同量子点一级条纹的“on”与“off”；（5）超分辨定位不同颜色量子点的中心；（6）平台漂移的校正。

研究对象可为有闪烁现象的荧光分子或纳米颗粒标记DNA,蛋白质和其它生物分子；利用透射光栅的分光原理，在可见光范围内的所有波长皆适用；改造显微成像模型，应用反射光栅同样适用；不仅适用于静止而且适用于运动过程中单分子特定时刻精确定位。

单分子及单粒子水平上的超分辨率显微术得以实现的关键要素是对小于衍射极限距离的分子能够分别定位；无论是在空间或时间上只要能将多个分子分别定位就有望实现超分辨成像；利用发光个体的闪烁不同步和透射光栅的分光将不同颜色的发光体分别定位，解决了单分子和单个纳米粒子水平上不能实现多色样品超分辨成像的问题，填补了技术空白，达到了本发明的目的。

优点：该方法能够应用于多种发光波长的发光体的共定位，通量更高，信息量更大。在操作上简便，快捷，测量准确，不需要复杂的光学技术和专业的操作者，对任何具有闪烁现象的发光体均适用。

附图说明

图1为本发明的单分子定位模型示意图。

图2为本发明的透射光栅分光原理图。

图3为本发明的单对量子点的确定图。

图4为本发明的提取分析数据与数据定位与光学平台的漂移的校正图。

图5为本发明的定位准确性的分析图。

图6为本发明在细胞内测量的结果图。

具体实施方式：

实施例1：

滴加5μL，1nmol/L的QD_red-DNA-QD_green标尺样品于载玻片表面，覆盖盖玻片，送荧光显微镜观察。利用量子点的“一元激发，多元发射”的优势，选用415-455nm滤光片作为激发块，图3C为用510-750nm滤光片为发射滤光块，使系统能同时多色成像。图2为利用透射光栅的分光原理，图3A为使来自样品的像分成一个零级点和多个一级条纹像。图3B为分别分析不同一级条纹荧光强度随时间的变化，确定观察的对象是否为量子点对。利用另一种量子点处于“off”状态时，图4A和图4B为定位此时处于”on”状态的量子点。分别定位两种量子点的中心，计算标尺的距离。改变标尺中DNA的碱基对（15bp, 30bp, 45bp），分别测量不同长度的的标尺，将测量结果与理论计算结果比较。作DNA碱基对与测量长度图，回归出碱基对间的距离为0.33nm(理论值为0.34nm) （图5）。 

实施例2：

将人胚肾细胞（293A）与0.25nmol/L的QD585和QD655共培养24小时后，取4-8μL细胞样品，送光谱成像显微镜观察。用我们的发明方法可以测量细胞内两种量子点聚集时，它们之间的距离。图6是两个细胞的测量结果。A上为明场细胞图像。A中为小视野的荧光照片。将该照片中虚线内放大为A下。其中箭头所指处为两种颜色的量子点聚集处。它们之间的距离用常规方法无法测量，本发明测量结果为37.5nm。同样，B中箭头所指处两种量子点的距离为29.9nm。