检测原钙粘蛋白基因簇γ的方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种生物技术领域的检测原钙粘蛋白基因簇γ(PCDHG)的方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：(a)抽提出组织或细胞内的总RNA，反转录获得cDNA；(b)以cDNA为模板，PCR扩增目的片段；(c)通过检测PCR扩增产物，得到原钙粘蛋白基因簇γ的22个基因的表达情况。本发明的方法能够有效检测并区分原钙粘蛋白基因簇γ的22个基因。所述试剂盒包括4种引物组中的一种或多种。本发明的检测原钙粘蛋白基因簇的方法能够快速检测原钙粘蛋白基因簇，能够实现快速准确检测人类各个组织或细胞内原钙粘蛋白γ基因簇22种PCDHG基因中每种基因的表达状态，并且可对特异性表达的PCDHG基因的表达水平进行半定量分析，本发明的方法中涉及到的4种引物组能够用于检测人类原钙粘蛋白基因簇的试剂盒的开发，具有非常实用的商业价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的检测基因簇的方法及试剂盒，具体涉及一种检测检测原钙粘蛋白基因簇γ的方法及试剂盒。 

背景技术

大脑是一个由大量分化的神经元组成的复杂的神经系统，各个神经元通过基因的差异性表达表现出不同的特性。原钙粘蛋白(pcdh)超家族成员是一类钙粘素跨膜蛋白，广泛存在于脊椎动物的中枢神经系统中，是神经元多样化形成的一个重要候选基因。pcdh基因家族包括pcdh-α，-β，和-γ三个基因簇。研究表明，在单个蒲肯野细胞中，RT-PCR分析显示每个细胞是通过组合转录的方式单等位基因差异性表达pcdh-α，pcdh-γA，和pcdh-γB，每个等位基因上仅有一或两个第一可变外显子顺式剪切到3’恒定区(constant region)外显子上，而pcdh-αC1，-αC2，-γC3，-γC4，-γC5则是双等位基因转录。所以，可通过检测pcdh-α和-γ的基因簇来辨别神经细胞类型。 

原钙粘蛋白基因在神经元分化以及突触发生的过程中起着重要作用，而该过程已被证明与精神分裂症(SZ)和双向障碍症(BD)的形成密切相关，同时，多个全基因组关联性分析研究也显示5q31连锁的PCDH家族是SZ和BD候选基因；目前，研究表明，PCDH基因簇的长片段表观沉默是Wilms’肿瘤疾病形成的主要原因，PCDHs通过负调控经典Wnt信号通路，抑制癌细胞的生长，最终发挥肿瘤抑制因子的作用。可见，PCDHs在发育和致病过程中起着非常重要的作用，通过检测某种疾病相关组织PCDH基因的基因簇，可实现疾病诊断的目的。因此，找到一种能有效检测组织或细胞PCDHG基因簇的方法，对揭示原钙粘蛋白基因簇的功能和表达机制，并对进一步阐述神经元细胞多样性发生的分子机制以及神经和肿瘤疾病的发病机制和疾病预测有非常重要的指导意义。 

人PCDHG基因簇内包含22个串联的第一可变外显子和3个恒定外显子，前者负责编码六个胞外(EC)钙粘素重复结构域，一个跨膜结构域和部分胞质(CP)结构域，后者负责编码剩余的胞质结构域，通过选择性剪切到恒定外显子的方式形成22个PCDHG基因，可分为PCDHGA，PCDHGB，和PCDHGC3，C4，C5三大类。22个基因N端的同源性 较高，这就使得通常的引物设计显得繁琐复杂，特异性较差，并且无法正确反映PCDHG基因转录表达的真实状态。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测原钙粘蛋白基因簇γ的方法及试剂盒。本发明的方法能够快速特异性检测人组织或细胞内的PCDHG基因簇，本发明的方法首先抽提出组织或细胞内的总RNA，通过反转录获得cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增目的片段。本发明包含的PCR引物是四套各具有一个共同反向引物，位于第三个恒定外显子内，通过在22个可变外显子编码区内分别设计22个特异性正向引物，由于RT-PCR后产生的扩增片段大小不同，通过产物片段长度的差异来将22个基因进行区分。 

本发明是通过以下的技术方案实现的， 

第一方面，本发明涉及一种检测原钙粘蛋白基因簇γ的方法，包括如下步骤： 

(a)抽提出组织或细胞内的总RNA，反转录获得cDNA； 

(b)以cDNA为模板，PCR扩增目的片段； 

(c)通过检测PCR扩增产物，得到原钙粘蛋白基因簇γ的22个基因的表达情况。 

优选地，所述PCR扩增采用的引物组选自以下4组引物组中的一种，所述4组引物组具有相同的正向引物，所述正向引物包括22条DNA寡核苷酸，所述22条DNA寡核苷酸的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示；所述4组引物组的反向引物分别如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.26所示。 

优选地，所述PCR扩增的参数为：预变性95℃，2分钟；变性95℃，30秒，退火60℃，30秒；延伸72℃，1分钟；终末延伸72℃，7分钟；共40个循环。 

第二方面，本发明还涉及一种检测原钙粘蛋白基因簇γ的试剂盒，所述试剂盒包括以下4种引物组中的一种或多种，所述4组引物组具有相同的正向引物，所述正向引物包括22条DNA寡核苷酸，所述22条DNA寡核苷酸的序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示；所述4组引物组的反向引物分别如SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.26所示。 

本发明具有如下的有益效果：本发明的检测原钙粘蛋白基因簇γ的方法能够快速检测原钙粘蛋白基因簇，能够实现快速准确检测人类各个组织或细胞内原钙粘蛋白γ(PCDHG)基因簇22种PCDHG基因中每种基因的表达状态，并且可对特异性表达的PCDHG基因的表达水平进行半定量分析，本发明的方法中涉及到的4种引物组能够用于检测人类原钙粘蛋白基因簇的试剂盒的开发，具有非常实用的商业价值。 

附图说明

图1为PCDHG基因簇结构示意图及PCR引物的相对位置示意图；每个长方形代表一个外显子，下方的小箭头代表23个PCR引物(22个正向引物，1个反向引物)在该基因簇中的相对位置。 

图2为22个基因中第一个可变外显子DNA序列比对图；黑色区域表示相同的核苷酸序列区域，颜色越深表示该位置同源性越强。 

图3为人大脑皮层源癌旁组织中22个PCDHG基因(分别使用各自正向引物和4个待选反向通用引物)的RT-PCR电泳对比图及该组织中的PCDHG基因表达簇。 

图4为PCDHG基因簇在细胞HEC-1-B(H)和SK-N-SH(S)中的基因表达簇。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例 

首先，通过DNAMAN软件分析22个基因N端编码区的序列同源性，在各个基因中找出同源性较低的序列区作为正向引物的候选区；在22个基因共有的C端编码区中寻找反向通用引物；所述PCDHG基因簇的序列信息为NG_000012。依据以下引物设计原则寻找特异性引物： 

(1)用重复序列去除(repeat masker)软件去掉候选序列中的冗余序列； 

(2)引物长度22bp左右； 

(3)GC含量接近于50％； 

(4)引物3’端最好选择鸟嘌呤或胞嘧啶，减少错配引发率； 

(5)引物内或引物之间不能有连续4个碱基的互补； 

(6)应避免鸟嘌呤三个及三个以上重复。 

然后，引物特异性的模拟(in silico)验证：(1)通过使用NCBI网站中Blast-primer工具在所有物种中查找验证引物的特异性；(2)在UCSC网站中使用in-Silico PCR工具验证PCR产物的特异性。 

分别选取人大脑皮层源癌旁组织和两种细胞系HEC-1-B(H)、SK-N-SH(S)用这四套引物做RT-PCR，进行转录表达模式的检测。结果表明，四套引物在组织和两种细胞系中保持强的特异性，并且能够有效实现区分22个PCDHG基因的目的。结果显示，可通 过已获得的两种PCDHG基因簇的差异来实现对两种不同细胞类型的区分。 

表1、4套PCR引物名称、序列、长度、退火温度及其对应的PCR产物片段长度 

*the annealing temperatures of the primer pairs are all 60℃。 

1、总RNA的获取，用Trizol法抽提组织或细胞总RNA

组织样品来源于颅内大脑皮层源癌旁组织；HEC-1-B，SK-N-SH细胞系各2个六孔板的面积。 

1.1组织匀浆或细胞裂解；先将100毫克组织剪切成小块，放入毫升EP管中，加入1毫升Trizol，用碾磨棒，碾磨匀浆。细胞系则是吸尽培养液，六孔板每孔加0.5毫升 Trizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解，然后将同一细胞的两孔中的匀浆液吸入同一EP管中； 

1.2RNA分离。室温放置5分钟，使样品充分裂解。每毫升Trizol加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。12,000g 4度离心15分钟； 

1.3RNA沉淀。吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55毫升。按每毫升最初的Trizol加入0.5毫升异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。12,000g 4度离心10分钟； 

1.4RNA洗涤。在管底可见RNA沉淀，弃上清。每毫升最初的Trizol加入至少1毫升75％乙醇(DEPC水配制)，涡旋或颠倒混匀，7,500g 4度离心5分钟； 

1.5RNA溶解。在管底可见RNA沉淀，弃上清，小心吸尽液体。室温静置5-10分钟，干燥RNA沉淀。待RNA略干后，加入25微升DEPC水，用枪吹打几次后，在55到60度温度下孵育10分钟，使RNA充分溶解。注意：切勿让RNA过分干燥，否则将极难溶解，且测出的A260/280值会低于1.6； 

1.6测RNA浓度(Eppendorf Biophotometer计)，人大脑皮层源癌旁组织中RNA浓度1183.6微克/毫升，A260/280＝1.67，A260/230＝2.00；HEC-1-B细胞系中RNA浓度1787.8微克/毫升，A260/280＝1.51，A260/230＝1.68；SK-1-SH细胞系中RNA浓度502.8微克/毫升，A260/280＝1.51，A260/230＝1.67。 

2、RNA反转录成cDNA

RNA模板1.7微升，10微摩/升Oligo(dT)引物3微升，10微摩/升随机引物3微升，DEPC水9.45微升，共17.15微升，然后75度，孵育5分钟。加入M-MLV RT 5×Buffer 5微升，10mM dNTP Mix 1.25微升，200u/微升M-MLV反转录酶1微升，60u/微升rRNasinRNA酶抑制剂0.6微升，总体积25微升。放置在AB 2720thermal cycler上依次25度，5分钟；37度，60分钟；42度，30分钟；70度，15分钟。 

3、cDNA PCR扩增反应

反应体系为20微升，包含5uM正反向引物各1.6微升，cDNA模板0.25微升，2×PowerTaq PCR MasterMix 10微升，MiliQ水6.55微升。PCR循环参数是预变性95度，2分钟；变性95度，30秒，退火60度，30秒；延伸72度，1分钟，循环数40；终末延伸72度，7分钟。 

4、结果验证

图3为人大脑皮层源癌旁组织中22个PCDHG基因(分别使用各自正向引物和4个待选反向通用引物)的RT-PCR电泳对比图及该组织中的PCDHG基因表达簇，图3中的2，3，4， 5分别代表4个待选的反向通用引物constant1R(SEQ ID NO.23)，constant2R(SEQ IDNO.24)，constant3R(SEQ ID NO.25)，constant4R(SEQ ID NO.26)，a1，a2，a3，b1，a4，b2，a5，b3，a6，a7，b4，a8，b5，a9，b6，a10，b7，a11，a12，c3，c4，c5表示22种PCDHG基因。由图3可以看出，四个反向引物的产物均具有强的特异性，并且产物条带清晰单一，且无杂带，故四个反向引物均能成为22个基因的反向通用引物；同时由图可知，此22对引物扩增的22个基因能够通过PCR产物片段大小区分开来。该大脑皮层中特异性表达的基因有PCDHGA1，PCDHGA2，PCDHGA3，PCDHGB1，PCDHGA4，PCDHGB2，PCDHGA5，PCDHGB3，PCDHGA6，PCDHGA7，PCDHGB4，PCDHGA8，PCDHGB5，PCDHGA9，PCDHGB6，PCDHGA10，PCDHGB7，PCDHGA11，PCDHGA12，PCDHGC3，PCDHGC4，PCDHGG5，除了PCDHGA8表达水平较低外，其他基因都有高水平的表达。 

图4为PCDHG基因簇在细胞HEC-1-B(H)和SK-N-SH(S)中的基因表达簇。图4中，22个PCDHG基因在两个细胞系中差异性表达，并且表达水平亦有明显差异。在HEC-1-B细胞中特异性表达的基因有PCDHGB1，PCDHGB5，PCDHGA9，PCDHGB6，PCDHGA10，PCDHGB7，PCDHGA11，PCDHGC3，PCDHGA4，其中仅有PCDHGB5，PCDHGA9，PCDHGC3基因检测有较高水平表达；在SK-N-SH细胞中，除PCDHGA6，PCDHGB4，PCDHGA8基因表达量相对较低外，其余PCDHG基因均检测有较高表达。可以看出，二种细胞系的PCDHG基因簇转录表达模式有很大不同，可根据基因簇差异对不同类型的细胞进行识别。 

综上所述，本发明的检测原钙粘蛋白基因簇的方法能够快速检测原钙粘蛋白基因簇，能够实现快速准确检测人类各个组织或细胞内原钙粘蛋白γ(PCDHG)基因簇22种PCDHG基因中每种基因的表达状态，并且可对特异性表达的PCDHG基因的表达水平进行半定量分析，本发明的方法中涉及到的4种引物组能够用于检测人类原钙粘蛋白基因簇的试剂盒的开发，具有非常实用的商业价值。