使用葡萄糖脱氢酶的葡萄糖浓度测定方法及葡萄糖传感器

摘要

本发明涉及利用包含酶和电子传递物质的反应体系测定葡萄糖浓度的技术。在本发明中，提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖浓度测定方法。在本发明中，还提供了使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶或源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶作为酶、使用Ru化合物作为电子传递物质的葡萄糖传感器。

说明书

本申请是分案申请，其原申请的申请号为03814252.X，申请日为2003年6月16 日，发明名称为“使用葡萄糖脱氢酶的葡萄糖浓度测定方法及葡萄糖传感器”。

技术领域

本发明涉及用于测定试料液(例如血液等的生化试料或其调整液)的葡萄糖浓度 的技术。

背景技术

对于糖尿病患者，为了管理血糖值而在平日掌握自己的血糖值是很重要的。而由 于频繁地到医院去是非常麻烦的，所以那种患者自己可以进行简单的血糖值测定，而 且在外出时也可以轻松地进行血糖值测定的可以放在手掌里那样大小的便携式的简 易血糖值测定装置就得到了应用。

在使用便携式的简易血糖值测定装置时，将提供有酶反应场的葡萄糖传感器装在 血糖测定装置上，通过向葡萄糖传感器供给血液(试样)而进行血糖值的测定。在这 种情况下，一般使用切开测定者的皮肤后采血、而将该血液作为试料液供给至葡萄糖 传感器的方法。在这种方法中，从减小采血对于测定者的负担的角度看，由于要采取 的血液量最好较少，所以为了能用少量的血液(试样)而能够进行血糖值测定，进行 了各种各样的研究改进。

葡萄糖传感器被作成例如在基板上形成电极及试药层的同时，以将该试药层收容 到内部的形态设置毛细管的结构(参照图2及图3)。虽然试药层是作为包含氧化还 原酶和电子传递物质而构成的，但是普遍使用GOD或PQQGDH作为氧化还原酶， 使用铁氰化钾作为电子传递物质(例如日本国特开2000-65778号公报)。在这种葡 萄糖传感器中，利用毛细管向试药层供给试样时，在毛细管的内部构筑液相的反应体 系。这时，由氧化还原酶催化例如葡萄糖的氧化反应，而又催化电子传递物质的还原 反应。

与此相对，在简易血糖值测定装置中，利用葡萄糖传感器的电极，通过对反应体 系施加电压从而测定响应电流值。该响应电流值，起因于还原型的电子传递物质的量 (与葡萄糖的浓度相关的量)，被作为计算葡萄糖浓度时的基础。在计算葡萄糖浓度 时，采用电量检测法或电流检测法。电量检测法是试样中的几乎全部的葡萄糖反应后、 取得计算用的响应电流值的累积值、根据累积值(电量)计算葡萄糖浓度的方法。而 电流检测法则是在反应开始经过一段时间后取得响应电流值、根据该响应电流值计算 葡萄糖浓度的方法。

由于GOD与葡萄糖的反应速度较小(Km(米氏常数)较大)，所以在使试样中 的大部分葡萄糖反应而取得运算用的电量的电量检测法中，测定时间显著地增长。因 此，在使用GOD作为氧化还原酶以短时间测定葡萄糖浓度的情况下，要利用电流检 测法。

但是，在电流检测法中，在葡萄糖浓度较小的情况下，在取得响应电流值的阶段， 也许酶反应几乎结束了，所得到的响应电流值要小，低浓度区域的测定精度变差。在 微量试样时，由于葡萄糖的绝对量小，所以会产生同样的问题。为了消除这种缺陷， 使所使用的酶量变少即可。但是，在酶量较少的情况下，由于葡萄糖的反应速度较小， 所以在一定以上的葡萄糖浓度的试样中，葡萄糖反应量之差不能反映出葡萄糖浓度之 差。其结果是，若酶量较少，则在高浓度区域不能以响应电流值之差得到葡萄糖浓度 之差，分解能恶化。因此，可以说电流检测法是测定范围小、不适于微量试样的测定 的方法。

而且，GOD与电子传递物质的反应性也不那么大。因此，为了缩短测定时间， 需要多量地使用电子传递物质。其结果是，难以使葡萄糖传感器(正确地说是试药层 和毛细管)小型化，随之也要使必要的试样量增多。从这点上来看，可以说使用GOD 的方法也不适于测定微量试样的情形。

根据这些情况，在使用GOD的电流检测法中，可以精度良好地测定葡萄糖的试样 量，最小为0.6μL，测定时间最小为15秒，测定范围限于葡萄糖浓度为10～600mg/dL。

另一方面，在采用PQQGDH作为氧化还原酶的情况下，若采用电量检测法，即 使是0.3μL的微量试样，也可以测定血糖值，这是已知的。可是，如上所述，由于电 量检测法是利用试样中的几乎全部的葡萄糖来计算葡萄糖浓度的方法，所以与电流检 测法相比，在葡萄糖高浓度区域存在着测定时间相对地变长的倾向。例如，为了确保 实用上所需要的最低限的测定范围(10～600mg/dL)，需要确保15～30秒的测定时 间。

为了缩短测定时间，也可以考虑增加试药层中的酶和电子传递物质的含量，在这 样情况下试药层的溶解性恶化。所以，在向毛细管供给试样时，在毛细管中构筑均匀 液相的反应体系变得困难。其结果是，由于每个葡萄糖传感器(每次测定)的溶解程 度之差而使再现性恶化，或变得容易受到血液中的血球成分的影响等，而产生测定精 度恶化的问题。特别是，由于铁氰化钾对血液的溶解性小，所以在使用铁氰化钾作为 电子传递物质的情况下，测定精度的恶化显著。另外，铁氰化钾保存稳定性差，容易 向还原体转化，所以如果含量增多的话，与背景的增大相关联，这次是葡萄糖低浓度 领域的测定精度降低。

发明内容

本发明的目的在于确保测定范围大、并且可以短时间且高精度地测定微量试样。

在本发明的第1方面中，提供一种利用包含酶及电子传递物质的反应体系而测定 葡萄糖浓度的方法，其中，使用结合有细胞色素C的葡萄糖脱氢酶作为上述酶，使 用Ru化合物作为上述电子传递物质。

作为细胞色素C来说，优选使用由属于伯克霍尔德氏属的微生物所产生的细胞 色素C。作为细胞色素C来说，可以使用在还原条件化的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳中分子量约为43kDa的细胞色素C。

在本发明的第2方面中，提供一种利用包含酶及电子传递物质的反应体系而测定 葡萄糖浓度的使用了葡萄糖脱氢酶的葡萄糖浓度测定方法，其中，使用源自伯克霍尔 德氏属的葡萄糖脱氢酶作为上述酶，使用Ru化合物作为上述电子传递物质。

在本发明的葡萄糖浓度测定方法中，例如一方面对反应体系给予刺激，另一方面 检测针对该刺激的响应，根据该响应的检测量计算葡萄糖浓度。在这种情况下，例如 以电压的方式给予刺激，以电流或光学特性得到响应。

在本发明的第3方面中，提供一种葡萄糖传感器，其具有第1及第2电极、包含 酶及电子传递物质的试药层，在向上述试药层供给葡萄糖溶液而构筑反应体系的同 时，利用上述第1及第2电极给予该反应体系以刺激，其特征在于：使用结合有细胞 色素C的葡萄糖脱氢酶作为上述酶，使用Ru化合物作为上述电子传递物质。

作为细胞色素C来说，优选使用由属于伯克霍尔德氏属的微生物所产生的细胞 色素C。作为细胞色素C来说，可以使用在还原条件化的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳中分子量约为43kDa的细胞色素C。

在本发明的第4方面中，提供一种葡萄糖传感器，其具有第1及第2电极、包含 酶及电子传递物质的试药层，在向上述试药层供给葡萄糖溶液而构筑反应体系的同 时，利用上述第1及第2电极给予该反应体系以刺激，其特征在于：使用源自伯克霍 尔德氏属的葡萄糖脱氢酶作为上述酶，使用Ru化合物作为上述电子传递物质。

在本发明中，可以使用具有葡萄糖脱氢酶活性并且在还原条件化的SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳中分子量约为60kDa的具有α亚单位的酶作为葡萄糖脱氢酶。葡萄糖 脱氢酶也可以是在还原条件化的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中分子量约为14kDa的γ 亚单位的酶。

在本发明中，例如可以使用下述化学式所示的配位化合物作为Ru化合物。

[Ru(NH₃)₅X]ⁿ⁺

作为上述化学式中的X来说，可以举出NH₃、卤素离子、CN、吡啶、烟酰胺、 或H₂O。在例示的物质之中，优选使用X是NH₃或卤素离子的Ru配位化合物。另一 方面，在化学式中的n+表示由X的种类所决定的Ru配位化合物的价数。

由于还原型(II)不稳定，所以Ru配位化合物通常作为氧化型(III)而存在。 所以，即使在葡萄糖传感器的试药层中混入了氧化型Ru配位化合物的状态下并且曝 露在光或水中，也不容易被还原。另外，Ru配位化合物具有难以结晶化、可以适当 地维持微粉末状态的特性。从这点来看，可以说Ru配位化合物的溶解性高。因此， 在考虑耐曝露性或保存稳定性等的情况下，对于试药层而言，优选以氧化型含有Ru 配位化合物。

本发明的葡萄糖传感器的结构是，例如设置有试药层，而且还具备用于保持试料 液的液保持空间。在这种情况下，就试药层来说，以固体层的方式构成的同时，在液 保持空间保持试料液的状态下，氧化还原酶及电子传递物质的至少一部分溶解于试料 液中。即，葡萄糖传感器的结构优选是，在试料供给后，在液保持空间内，由葡萄糖、 氧化还原酶及电子传递物质以液相构筑反应体系。

就液保持空间的容量来说，为了可以测定微量试料液，例如设定为0.1～0.5μL。 在这种情况下，试药层中的氧化还原酶的含量，例如设为相当于葡萄糖脱氢酶活性 1.0～10.0U的量。将一个酶单位(U)定义为，在标准检定条件(pH6.0、37℃)下， 在作为DCIP的吸收波长的600nm处，随着时间变化测量基于DCIP(2，6-二氯酚靛 酚)还原的退色时，每分钟氧化1μM葡萄糖的量(摩尔吸光系数为4.76×1000μM/ cm)。另一方面，试药层中的电子传递物质的含量是换算为例如液保持空间被试料液 充满时的电子传递物质的浓度后、相当于1.0～5.0wt％的量。

液保持空间的结构是由毛细管力而使试料液移动的结构。

在本发明中所说的属于伯克霍尔德氏属的微生物，只要是可以产生具有葡萄糖脱 氢酶活性的α亚单位、或包含细胞色素C(β亚单位)的酶(以下，有时简称为“GDH”) 的微生物，则不作特别限定，但是，在其中，优选为洋葱伯克霍尔德氏菌，特别优选 是洋葱伯克霍尔德氏菌KS1(以下，有时简称为“KS1株”)。KS1株是从温泉附近的 土壤中分离的新菌株，但从其菌学的性质来看，确定为洋葱伯克霍尔德氏菌，于平成 12年9月25日以微生物委托号第FERM BP-7306号寄存于独立行政法人产业技术综 合研究所专利生物寄托中心(305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中 央第6)。KS1株可以产出包含α亚单位(分子量约为60kDa)、β亚单位(相当于细 胞色素C)(分子量约为43kDa)、γ亚单位(分子量约为14kDa)的GDH。但是，分 子量是在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的。

细胞色素C(包含β亚单位)是电子传递蛋白质，从提高电子传递速度的观点来 看，对于具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位(包含α亚单位)，以结合细胞色素C的形 态，作为GDH(以下，有时简称为“CyGDH”)使用是优选的。就细胞色素C来说， 不限于源自属于伯克霍尔德氏属的微生物的细胞色素C(β亚单位)，只要是与具有 葡萄糖脱氢酶活性的亚单位结合可以发挥电子传递功能，也可以是源自其它的微生物 或活体细胞的细胞色素C。

α亚单位是如已经叙述那样具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位。由α亚单位和γ亚 单位构成的GDH(以下有时简称为“αGDH”)，与没有γ亚单位的GDH相比，与葡萄 糖的反应速度大(Vmax/Km值大)。对于这一点，由本发明者们确认了。因此，从 提高与葡萄糖的反应速度的观点来看，在使用α亚单位的情况下，以使γ亚单位与α 亚单位结合的形态，作为GDH使用是优选的。

另外，在本专利申请的范围，有时根据来源菌种限定α亚单位、细胞色素C(包 含β亚单位)或γ亚单位，但这只不过是用于限定各亚单位的简便方法而已。即，即 使在将包含作为目的的亚单位的表达编码的载体转入宿主，将从该宿主产出的GDH 作为葡萄糖脱氢酶使用的情况下，在不同点仅仅是GDH(亚单位)的起源时，为了 慎重起见，在此再确认一下，这种情况属于本发明的技术范围。

附图说明

图1是表示在浓度测定装置上安装了本发明的葡萄糖传感器的状态的图，对于浓 度测定装置来说，用框图来表示，而对于葡萄糖传感器来说，用平面图来表示。

图2是表示葡萄糖传感器的一个例子的全体立体图。

图3是图2的葡萄糖传感器的分解立体图。

图4是表示在葡萄糖浓度的测定中、施加于第1及第2电极之间的电压值及响应 电流值的随时间变化的一个例子的图。

图5是表示在葡萄糖浓度的测定中、施加于第1及第2电极之间的电压值及响应 电流值的随时间变化的其它例子的图。

图6A～图6D是表示在使用Ru配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度 与反应开始5秒钟后的响应电流值之间关系的图。

图7A～图7D是表示在使用铁配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度 与反应开始5秒钟后的响应电流值之间关系的图。

图8A～图8D是表示在使用Ru配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度 与反应开始10秒钟后的响应电流值之间关系的图。

图9A～图9D是表示在使用铁配位化合物构成了试药层的情况下、葡萄糖浓度 与反应开始10秒钟后的响应电流值之间关系的图。

图10A～图10D是将血细胞比容(Hct)的影响作为从反应开始经过特定时间后 的Bias(Hct42％基准)而进行了评价的图。

具体实施方式

以下，参照附图对用于实施本发明的优选方式进行说明。

图1所示的浓度测定装置1是使用本发明的葡萄糖传感器2来测定血液等包含葡 萄糖的试料液中的葡萄糖浓度的装置。这种浓度测定装置1是大致具有电压施加部3、 电流值测定部4、检测部5、控制部6、运算部7及显示部8而构成的。

葡萄糖传感器2是按照一次性使用而构成的，如图2及图3中清楚表示的那样， 具有盖板20、隔板21及基板22。

在盖板20上设置孔部23，在隔板21上设置与连通23的同时设置前端部24a开 放的宽度窄的狭缝24。在盖板20及隔板21层叠在基板22的上面22a的状态下，由 狭缝24规定了毛细管25。该毛细管25的容量例如设定为0.1～0.5μL，而通过狭缝 24的前端开口部24a及孔部23与外部相连通。前端开口部24a构成试料液导入口25a， 由该试料液导入口25a供给的试料液，通过毛细管现象在毛细管25内向孔部23移动。

在基板22的上面22a上，设置第1电极26、第2电极27及试药层28。

第1及第2电极26、27作为整体沿基板22的长方向延伸，它们的端部26a、27a 在基板22的短方向延伸。基板22的上面22a按照第1及第2电极26、27的端部26a、 26b、27a、27b露出那样地被绝缘膜29所覆盖。

试药层28例如为固体状，横跨在第1及第2电极26、27的端部26a、27a间地 来设置。该试药层28例如含有相对多量的氧化型Ru化合物(电子传递物质)及相 对少量的GDH(葡萄糖脱氢酶)。试药层中的GDH的含量，例如设定为相当于葡萄 糖脱氢酶活性1.0～10.0U的量，试药层中的Ru化合物的含量，例如设定为换算成毛 细管25被试料液充满时的Ru化合物的浓度而相当于1.0～5.0wt％的量。

氧化型Ru化合物，只要作为电子传递体而起作用即可，但使用下述化学式所示 的Ru化合物是优选的。

[Ru(NH₃)₅X]ⁿ⁺

作为上述化学式中的X来说，可以举出NH₃、卤素离子、CN、吡啶、烟酰胺、 或H₂O。在例示的物质中，优选使用X为NH₃或卤素离子的Ru配位化合物。另一方 面，化学式中的n+表示由X的种类所决定的Ru配位化合物的价数。

在试药层28中，Ru化合物相对于GDH的比率被设定得较大，Ru化合物给予试 药层28的溶解性的影响较大。另一方面，作为Ru化合物，用化学式表示的Ru配位 化合物难以结晶化，可以适当地维持微粉末的状态，而溶解性高。因此，试药层28 全体的溶解性较高，通过血液的供给可以很容易地溶解。所以，在葡萄糖传感器2 中，即使如上述范围那样将毛细管25的容积设定得较小，在供给血液时，在毛细管 25内也可以适当地构筑近乎均匀的液相的反应体系。

另一方面，作为GDH来说，优选使用将作为电子传递蛋白质的细胞色素C与具 有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位结合的物质。具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位和细胞色 素C，优选使用源自例如属于伯克霍尔德氏属的微生物、例如洋葱伯克霍尔德氏菌 KS1株的物质。当然，具有葡萄糖脱氢酶活性的亚单位和细胞色素C，不限于属于伯 克霍尔德氏属的微生物，而既可以是在可以发挥所要求的功能的范围内而源自其它的 微生物或活体细胞的物质，也可是从属于伯克霍尔德氏属的微生物中取得作为目的的 亚单位的表达编码的同时、将包含该表达编码的载体转入宿主、而从宿主中产出的物 质。

在使用属于伯克霍尔德氏属的KS1株作为微生物的情况下，具有葡萄糖脱氢酶 活性的亚单位，作为分子量约为60kDa的α亚单位而得到，细胞色素C，作为分子量 约为43kDa的β亚单位而得到。利用该KS1株，可以产出在α亚单位和β亚单位上 结合了作为分子量约为14kDa的γ亚单位的GDH。但是，分子量是在还原条件下在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的值。在这种情况下，从提高与葡萄糖的反应速度 的观点来看，优选使用在α亚单位上结合了γ亚单位的αGDH。另一方面，从提高电 子传递速度的观点来看，优选使用在αGDH结合了β亚单位(细胞色素C)的CyGDH。

图1所示的电压施加部3是在第1电极26的端部26b和第2电极27的端部27b 之间施加电压的部分。电压施加部3，通过将葡萄糖传感器2安装在设置于葡萄糖浓 度测定装置1上的安装部(省略了图示)上，借助第1及第2接触件3a、3b，与葡 萄糖传感器2的端部26b、27b导通。作为电压施加部3来说，例如可以使用干电池 或充电池等的直流电源。

电流值测定部4是在向反应体系施加电压时测定例如与由还原型的Ru化合物放 出的电子量相关的响应电流值的部件。

检测部5是在将葡萄糖传感器2安装在葡萄糖浓度测定装置1上之后、向试药层 28供给试料液、检测能否进行葡萄糖浓度测定的部件。

控制部6是控制电压施加部3、而选择在第1及第2电极26、27之间施加电压 的状态(闭回路)或不施加电压的状态(开回路)的部件。

运算部7是根据由电流值测定部4测定的响应电流值、进行试料液中的葡萄糖浓 度的运算的部件。

另外，检测部5、控制部6及运算部7各自由例如CPU及ROM或RAM等的存 储器构成，但通过将多个存储器连接在一个CPU上而构成检测部5、控制部6及运 算部7的整体也可以。另外，由运算部7而得到的计算结果，由显示部8来显示。显 示部8例如可以由LCD等组成。

下面，除了参照图1至图3外、还参照图4及图5来说明试料液中的葡萄糖浓度 测定的步骤。

如图1中所清楚地表示的那样，首先在葡萄糖浓度测定装置1上安装葡萄糖传感 器2。这样的话，葡萄糖传感器2的第1电极26的端部26b与浓度测定装置1的第1 接触件3a相接触，第2电极27的端部27b与第2接触件3b相接触。如先前提到的 那样，在这种状态下，第1及第2电极26、27可以与电压施加部3导通。在实际的 测定中，在向葡萄糖传感器2供给试料液之前起，基于控制部6的控制，由电压施加 部3在第1及第2电极26、27间施加电压。将施加电压值例如设定在100～500mV 的范围内。

接着，通过葡萄糖传感器2的试料液导入口25a，供给血液等试料液。试料液由 于毛细管现象而在葡萄糖传感器2的毛细管25内移动。在该过程中，试药层28被试 料液所溶解，构筑成液相反应体系。在反应体系中，例如葡萄糖被GDH氧化的同时， Ru化合物成为还原型。

在通过2个端部26b、27b在第1及第2电极26、27间施加定电压的状态下，试 药层28中所存在的还原型的Ru化合物向第1电极26的端部26a侧移动，在该端部 26a放出电子成为氧化型的Ru化合物。因此，在由电压施加部3在第1及第2电极 26、27间供给定电压的状态下，由还原型Ru化合物赋予的电子量通过第1电极26 及第1接触件3a在电流值测定部4作为响应电流而被测定。

另一方面，在电流值测定部4所测定的响应电流值，在检测部5被监控，如图4 所示，当响应电流值超过阈值I₁(例如为0.1～3.0μA)的时刻t₀，检测部5检测到试 料液被供给到试药层28、试药层28溶解了。

在检测部5检测到试料液被供给的情况下，电流值测定部4测定从该检测开始经 过一定时间(例如t₂-t₀优选为10秒以下，更优选为5秒以下)的时刻t₂时的运算用 的响应电流值I₂。

另外，如图5所示，可以在检测部5检测到试料液被供给了这种情况之后经过一 定时间(例如t₁-t₀优选为10秒以下，更优选为3秒以下)的时刻t₁为止，暂时停止 施加电压。在此之后，可以将从时刻t₁开始再施加电压，另一方面，从再施加电压之 后经过一定时间(例如t₂-t₁优选为3秒以上，更优选为3秒～5秒)的时刻t₂时的响 应电流值作为运算用的响应电流值I₂而采用。

另一方面，在运算部7，根据运算用的响应电流值I₂，计算试料液中的葡萄糖浓 度。葡萄糖浓度的运算，是通过将响应电流值换算为电压之后、通过将该电压值代入 事先作好的表示电压值和葡萄糖浓度之间关系的校对曲线上来进行运算的。校对曲线 在例如被数字化后而与实行运算的程序一起存储在ROM中。

在本实施方式中，使Ru化合物与特定的GDH(αGDH或CyGDH等)相组合， 构成试药层28。在这种试药层28中，供给试料液时的反应速度(包含酶反应速度及 电子传递速度(Vmax/Km)的两者)较大，例如在CyGDH时Vmax/Km约为 2100mM。所以，即使在葡萄糖浓度小的情况下，葡萄糖反应也以最大速度进行，在 单位时间内生成的反应生成物的量与葡萄糖浓度的大小无关而是相同的。另外，即使 葡萄糖浓度为1000mg/dL左右，由于不足1秒与全部的葡萄糖反应就结束了，即使 试样量很少，也可以得到多的反应生成物，所以与葡萄糖浓度的大小无关，可以在短 时间内到达终点。其结果是，由后述的实施例可以清楚，可以既减少作为测定对象的 试料液(例如血液)的量，又可以将测定时间(图4及图5的t₂-t₀)设定得较短。此 外，即使在测定葡萄糖浓度大的微量试样的情况下，多次测定同一浓度的葡萄糖浓度 时的响应电流值的偏差小，也可以确保测定范围大。

如上所述，由于试药层28的溶解性高，所以即使在为了测定微量试料而减小毛 细管的尺寸的情况下，在供给试料液时，在毛细管25中，可以构筑近乎均匀的液相 反应体系。所以，即使在使用作为试料液的血液(试样)的情况下，也不太受血球成 分的影响，可以以良好的再现性测定响应电流值。

Ru配位化合物等的Ru化合物，由于氧化型稳定而难以向还原型变化，所以使用 Ru化合物的生物传感器的保存稳定性高，背景小。所以，即使在使用葡萄糖浓度小 的试料或微量试料测定葡萄糖浓度的情况下，测定精度也不会恶化。

在本实施方式中，在葡萄糖传感器与浓度测定装置的组合中，说明了葡萄糖浓度 的测定方法，但本发明的葡萄糖浓度的测定方法也可以使用具备了酶固定化电极的测 量器来实现。

实施例

以下，在利用酶反应的葡萄糖浓度的测定中，将Ru配位化合物与αGDH或 CyGDH组合而构成了试药层的葡萄糖传感器，即使是对于微量试样，也实际证实了 反应速度大(测定时间短)、测定范围宽、而再现性优异、不容易受血细胞比容(Hct) 的影响。

(葡萄糖传感器的制作)

作为葡萄糖传感器来说，使用了在基板上形成有第1电极、第2电极、试药层及 毛细管的葡萄糖传感器(参照图2及图3)。通过丝网印刷将碳墨印到基板上后使其 干燥而形成了第1及第2电极。毛细管的容量基本上设定为0.3μL。但是，对于试样 中的Hct的影响，如后述那样，对于将毛细管的容量设定为0.4μL及0.5μL的情况也 进行了研究。试药层采用由电子传递层及含酶层构成的2层构造。电子传递层是通过 将0.4μL的包含电子传递物质的第1材料液涂敷在基板上后对第1材料液进行送风干 燥(30℃、10％Rh)而形成的。含酶层是通过将0.3μL的包含氧化还原酶的第2材料 液涂敷在电子传递层上后对第2材料液进行送风干燥(30℃、10％Rh)而形成的。

第1材料液是通过将下述表1中的①～④按照序号的顺序混合了的混合液放置 1～3日后、向该混合液中添加电子传递物质来调制的。第2材料液是通过将氧化还 原酶溶解于0.1％CHAPS中来调制的。

作为电子传递物质来说，使用[Ru(NH₃)₆]Cl₃(Aldrich公司制造)(以下简 称为“Ru”或“Ru配位化合物”)或K₃[Fe(III)(CN)₆](ナカライテスク(株)制 “28637-75”)(以下简称为“Ferri”)，作为氧化还原酶来说，使用CyGDH、αGDH或 PQQGDH。如上所述，CyGDH由α亚单位、β亚单位及γ亚单位春成，αGDH由α 亚单位及γ亚单位构成。PQQGDH以PQQ(吡咯喹啉醌)为辅酶。

表1：第一材料液的组成(除了电子传递物质)

在表1等中，SWN是产品“ル一セントタイトSWN”的缩写，CHAPS是(3-[(3- 胆氨基丙基)二甲氨]丙磺酸)(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acid)的缩写，ACES是(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)(N- (2-acetamido)-2-aminoetanesulfonic acid)的缩写。作为SWN来说，使用了コ一プ ケミカル(株)制“3150”，作为CHAPS来说，使用了同仁化学研究所制“KC062”，作 为ACES来说，使用了同仁化学研究所制“ED067”。而将ACES溶液调制成pH为7.5。

(葡萄糖溶液的调制)

作为葡萄糖溶液来说，使用了将葡萄糖浓度及Hct调制为目的浓度的全血(试 样)。Hct值，只要不作特别的限定的话，调整为42％。葡萄糖浓度，根据试验目的， 调整为0、101、412、624、820或1034mg/dL。

(响应电流值的测定)

在葡萄糖传感器的第1及第2电极间施加定电压(200mV)的状态下，向试药层 供给与毛细管的容积相对应的量(0.3μL、0.4μL、0.5μL)的试样，从供给该试样开 始经过特定时间(5秒或10秒)后测定了响应电流值。

(测定范围的评价)

在使用各种的葡萄糖浓度的试样测定响应电流值的基础上，通过将葡萄糖浓度设 定为横轴、将响应电流值设定为纵轴时的标绘点的直线性，评价了测定范围。将与从 供给试样起的5秒后的响应电流值相关的结果在图6A～图6D及图7A～图7D中表 示，将与从供给试样起的10秒后的响应电流值相关的结果在图8A～图8D及图9A～ 图9D中表示。在这些图中，各标绘点在对于同一构成的10个葡萄糖传感器测定响 应电流值的基础上，以其平均值来表示。在本评价中使用的葡萄糖传感器中，关于氧 化还原酶及电子传递物质，如下述表2所示。在表2中，传感器号A-1～3、B-1～3 是本发明的葡萄糖传感器，其它是用于比较的葡萄糖传感器。表2中的氧化还原酶的 活性表示向毛细管供给试样从而构成液相反应体系时的该液相反应体系的活性，电子 传递物质的含量表示上述液相反应体系中的电子传递物质的重量比率。

表2：传感器的构成

(再现性的评价)

再现性通过在同一条件下(葡萄糖传感器的构成及试样的浓度相同)的测定值的 偏差而进行评价。偏差通过相对标准偏差(C.V.)进行评价。C.V.是基于作为计算图 6～图9中的各个标绘点时的基础的10个测定数据而计算的。分别将对于5秒值的结 果示于表3～表5中，而将对于10秒值的结果示于表6～表8中。

表3

[再现性]C.V.(％)：(电子传递物质8wt％、响应电流5秒值)

表4

[再现性]C.V.(％)：(电子传递物质4wt％、响应电流5秒值)

表5

[再现性]C.V.(％)：(电子传递物质2wt％、响应电流5秒值)

表6

[再现性]C.V.(％)：(电子传递物质8wt％、响应电流10秒值)

表7

[再现性]C.V.(％)：(电子传递物质4wt％、响应电流10秒值)

表8

[再现性]C.V.(％)：(电子传递物质2wt％、响应电流10秒值)

(关于试样中的Hct影响的研究)

通过对于试药层的组成相同的多个葡萄糖，使用葡萄糖浓度相同而Hct值不同的 多个试样，测定从开始供给试样起经过了一定时间后的响应电流值而对Hct的影响进 行研究。作为葡萄糖传感器来说，使用了本发明传感器1～3及比较传感器。在本发 明传感器1中，将隔板的厚度设定为58μm，而将毛细管容积(试样的量)设定为0.5μL， 在本发明传感器2中，将隔板的厚度设定为44μm，而将毛细管容积(试样的量)设 定为0.4μL，在本发明传感器3中，将隔板的厚度设定为33μm，而将毛细管容积(试 样的量)设定为0.3μL。在本发明传感器1～3中，使试药层中的CyGDH含量为相当 于2.0U的量，使[Ru(NH₃)₆]Cl₃的含量为4wt％(换算为电子传递物质的浓度)。 另一方面，作为比较传感器来说，使用了爱科来株式会社(ア一クレイ(株))制造 的简易血糖值测定机葡糖卡(グルコカ一ド)专用传感器。该传感器使用GOD作为 氧化还原酶、使用Ferri作为电子传递物质。

将使用了本发明传感器1～3时的结果在图10A～图10C中表示，将使用了比较 传感器时的结果在图10D中表示。在图10A～图10D中，以Hct值为42％时的响应 电流值作为基准，将相对于该测定值的偏移量(Bias)作为纵轴表示。在图10A～图 10C中，将横轴作为时间来表示，在图10D中，将横轴作为Hct值来表示。另外，各 图中的各个标绘点作为5测定的平均值来表示，图10D中的标绘点是基于从供给试 样起30秒后的值来计算出的。

(评价结果的考察)

使用CyGDH作为酶而使用Ru配位化合物作为电子传递物质的葡萄糖传感器 (A-1～3)，由图6A及图8A可知，即使减小Ru配位化合物的含量，也可以得到高 的直线性。由于不论是5秒还是10秒，并且即使是在葡萄糖浓度高的浓度区域(600～ 1000mg/dl)，也可以得到这样的结果，故可以说组合CyGDH和Ru配位化合物的体 系，反应速度高(Km小)。由表3～表8可知，组合CyGDH和Ru配位化合物的体 系，C.V.值小，再现性优异。若对以上的结果进行总结，则将CyGDH和Ru配位化 合物进行了组合的体系，在5秒值和10秒值的两者中，即使改变Ru的浓度，在直 线性和再现性上也没有大的变化，可以说用5秒可以充分地结束反应，进行葡萄糖的 定量。

在将αGDH和Ru配位化合物进行了组合的葡萄糖传感器(B-1～3)上，由图 6B及图8B可知，在减小Ru配位化合物的含量(2wt％)的情况下，尽管在葡萄糖浓 度高的浓度区域(600～1000mg/dl)直线性有些乱，但是基本上可以得到与将CyGDH 和Ru配位化合物进行了组合的体系相同的结果。所以，即使对于将αGDH和Ru配 位化合物进行了组合的体系也可以说反应速度高，由表3～表8可知，基本上可以说 再现性优异。所以，对于将αGDH和Ru进行了化合物进行了组合的体系也可以说用 5秒可以充分地结束反应，进行葡萄糖的定量。

与此相对，在将Ru和PQQGDH进行了组合的葡萄糖传感器(C-1～3、D-1～3) 上，由图6C、图6D及图8C、图8D可知，为了确保直线性，需要加大Ru配位化合 物和氧化还原酶的含量。在这种情况下，由于试药层的总量变大，所以在为了测定微 量试样(0.3μL)而减小毛细管尺寸的方向性上不适应，不实用。

在使用Ferri作为电子传递物质的葡萄糖传感器(E-1～3、F-1～3、G-1～3、H-1～ 3)上，由图7A～图7D及图9A～图9D可知，直线性差。而且，由图7C、图7D及 图9C、图9D可知，在使用PQQGDH作为氧化还原酶的葡萄糖传感器G-1～3、H-1～ 3上，即使增加酶的量(20U)，在将Ru和CyGDH进行了组合的体系中，反应速度 不够，所以不实用。另外，如表3～表8可知，由于Ferri自身的溶解性差、整体的 再现性差，从这点来看，也可以说实用性差。

如图10A～图10C所示，在本发明传感器1～3中，随着加长测定时间，Hct的 影响变小，在开始供给试样的10秒后几乎不受Hct的影响。另一方面，毛细管的容 积小、隔板厚度小的本发明传感器，Hct的影响变小。因此可以说，为了抑制Hct的 影响，减小隔板的厚度，对于使葡萄糖在传感器的电极表面的反应迅速地发生是有用 的。

与此相对，在比较传感器中，即使在开始供给试样的30秒后，在Hct值大的情 况下，受Hct的影响大，其Bias值与本发明传感器的5秒值程度相同。所以，将Ru 配位化合物和CyGDH进行了组合的本发明传感器1～3，即使试样的数量小，也可以 在短时间内测定，而且不容易受Hct的影响。所以，在将Ru配位化合物和CyGDH 进行了组合的情况下，可以减少试样的数量及缩短测定时间，可以构筑不容易受Hct 的影响的葡萄糖传感器。

由以上可知。用微量试样(例如0.3μL)在短时间内测定血糖的情况下，将Ru 与CyGDH组合，在测定范围、再现性、测定时间、避免Hct的影响的方面上，是优 异的组合。

在本发明中，通过构筑将Ru配位化合物和特定的葡萄糖脱氢酶(结合了细胞色 素C的葡萄糖脱氢酶、或源自伯克霍尔德氏属的微生物的葡萄糖脱氢酶)进行了组 合的反应体系，既可以确保测定范围大、可以时间短而且精度高、几乎不受到Hct 的影响地测定微量葡萄糖溶液。