公开/公告号CN102533952A
专利类型发明专利
公开/公告日2012-07-04
原文格式PDF
申请/专利权人 广州益善生物技术有限公司;
申请/专利号CN201010590999.1
申请日2010-12-16
分类号C12Q1/68;
代理机构广州华进联合专利商标代理有限公司;
代理人万志香
地址 510663 广东省广州市广州科学城揽月路80号广州科技创新基地B、C区五层
入库时间 2023-12-18 05:38:43
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-08-01
专利权的转移 IPC(主分类):C12Q 1/68 专利号:ZL2010105909991 登记生效日:20230720 变更事项:专利权人 变更前权利人:益善生物技术股份有限公司 变更后权利人:广州益善医学检验所有限公司 变更事项:地址 变更前权利人:510663 广东省广州市广州科学城揽月路80号广州科技创新基地B、C区五层 变更后权利人:510700 广东省广州市黄埔区广州国际生物岛螺旋三路29号第八层
专利申请权、专利权的转移
2014-01-01
授权
授权
2013-11-06
著录事项变更 IPC(主分类):C12Q1/68 变更前: 变更后: 申请日:20101216
著录事项变更
2012-09-05
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20101216
实质审查的生效
2012-07-04
公开
公开
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及一种 MTHFR与FGF5基因SNP检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR) 是叶酸代谢过程的关键酶,也是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)重新甲基化 为蛋氨酸所需要的关键酶。主要生化功能是催化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸(NADPH)介导的从5,10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应,生 成体内最主要的甲基供体,5-甲基四氢叶酸是组织和血清叶酸的主要形式,参与 体内多种重要的生化反应(如嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成等)。MTHFR定位于染 色体lp36.3,基因包括11个外显子和10个内含子,外显子的长度分别为99-252bp, 内含子的长度分别为192-981bp。
MTHFR基因突变可直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性,表现为 不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐热性降低,继而导致同型半胱氨酸(Hcy)向蛋 氨酸的转化发生障碍,使Hcy在血液中堆积,促进氧自由基的生成,引起血管内 皮细胞的损伤。目前研究认为,血浆高Hcy是心脑血管疾病的独立危险因素。
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)是一组强大的促细胞 分裂物,其靶细胞包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞等,因此它 对于血管壁细胞的作用是非特异的。FGFs通过刺激血管内皮细胞迁移、促进细胞 基质降解和平滑肌细胞增殖等功能参与血管新生的过程。FGF5是FGF中的一员, 位于人类基因组4q21。在基因治疗方面,FGF5基因首先被应用于心肌缺血治疗 的研究。Giordano等在猪慢性心肌缺血模型中予冠脉内注射携带FGF5基因的重 组腺病毒,在心肌内成功地检测到FGF5mRNA和蛋白的表达;组织学检查发现 FGF5组心肌内毛细血管数多于对照组,缺血区心肌收缩功能改善更为明显。当 FGF5基因出现突变则会改变心血管的正常状态,引起心血管疾病的发生。 本发明目标检测的MTHFR和FGF5基因突变位点,如表所示:
目前,对MTHFR和FGF5基因多态性进行检测、分析的方法主要有: PCR-RFLP分析法和传统固相芯片等方法,其中最常用的方法有PCR-RFLP分析 法,PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变,如位点丢 失或产生新位点,通过PCR扩增某一特定片段,再用限制性内切酶酶切扩增产物, 电泳观察片段的大小,这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变,可直接判断 基因型,但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测,再次,基于PCR 技术的检测方法(PCR-RFLP)存在着检测通量的局限性,一次只能进行一种突变 的检测,不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片。该液相 芯片可用于检测MTHFR基因两种常见基因型G121A、A105G和G111A的野生型和 突变型以及FGF5基因常见基因型T196A的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下:
一种MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
(A).针对每种SNP分别设计的野生型和突变型的ASPE引物:每种ASPE引物 由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物组成,所述野生型和 突变型的特异性引物分别为:针对MTHFR基因的G121A SNP位点的SEQ ID NO.9 及SEQ ID NO.10、针对A105G SNP位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对 G111A SNP位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对FGF5基因的T196A SNP位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16;所述tag序列选自SEQ ID NO.1-8;
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列与微 球连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17~SEQ ID NO.24中的序列,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应SNP位点的目标序列的引物。
优选地,所述扩增引物为:针对MTHFR基因的G121A SNP位点的SEQ ID NO.25 及SEQ ID NO.26、针对A105G SNP位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对 G111A SNP位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、和/或针对FGF5基因的T196A SNP位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32。
优选地,所述ASPE引物为:针对MTHFR基因的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列、由SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序 列、和/或针对FGF5基因的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列。
本发明的另一目的是提供一种MTHFR与FGF5基因SNP检测特异性引物。
具体技术方案如下:
一种MTHFR与FGF5基因SNP检测特异性引物,主要包括有如下: 针对MTHFR基因的G121A SNP位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对A105G SNP位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对G111A SNP位点的SEQ ID NO.13 及SEQ ID NO.14、和/或针对FGF5基因的T196A SNP位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16
本发明的主要优点在于:
1.本发明所提供的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法 的吻合率高达100%,且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术,特别符合实 际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中,经过大量试验,反应验证,得到 最优组合的液相芯片系统,所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比,并且所 设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应,tag标签序列、anti-tag 标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合,能够避免交叉反应, 实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位 点,准确区分各种型别的基因型;在同一个反应体系中,不同的特异性引物之间、 特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应,检测特异 性好,交叉反应率低于3%;除了能够检测单个SNP突变情况,也能够同时并行检 测多个突变位点的SNP情况,检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单,四种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成四 个含有SNP位点的目标序列的扩增,避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在 的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量 分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高,检测结果的可重复性差的缺陷, 同时对现有的液相芯片技术进行改进,使得所制备微球能适用于不同的检测项 目,具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高,从而使得检测的灵敏度进 一步得到提高,信噪比增强,检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1 MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
针对MTHFR基因三种常见基因型G121A、A105G和G111A的野生型和突变型 以及FGF5基因常见基因型T196A的野生型和突变型,分别设计特异性引物序列。 ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
表1 MTHFR与FGF5基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分,5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag 序列,3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段,选择tag序列,最大限度地减少各微球 的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构,选择的8 种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示:
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的6种微球购自美国Luminex公司,将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag 序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列,即在每个anti-tag序列前加上一段 5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂为用于将 anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在 anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反 应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT), 寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外, 如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选 为5-10个T,微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/mL)。配 制10ng/ml的EDC[1-Ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide](购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟, 再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20 洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬 于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)],1mmol/L EDTA中,2-8℃避光 保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对4种常见SNP位点MTHFR基因的G121A、A105G和G111A,FGF5基因的 T196A分别设计扩增引物对(见表3),分别扩增出4条含有SNP位点的目标序列。
表3 扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2 运用MTHFR与FGF5基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
2×Tm杂交缓冲液:
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计两对引物,多重PCR一步扩增出分别含有MTHFR基因的三种常见基因型 G121A、A105G与G111A,FGF5基因的常见基因型T196A共四条的目标序列,序列 大小分别为326bp、352bp、249bp和366bp。引物序列(SEQ ID NO.25-32)见上述 表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ ID NO.25-32的引物贮存液100ul 于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃ 3min;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 40s,30个循环;72℃ 10min; 4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物,加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶;
2.37℃孵育15min,80℃孵育15min,灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于 后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记 的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别取待检测MTHFR基因以及FGF5基因相 应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中,加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为:96℃ 2min;94℃ 30s,54℃ 1min,72℃ 2min,30个循环;4℃保存 备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,每组选择相应的8种微球(每种微球浓度均为2.5×105个/ml);
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃ 60s,37℃ 15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲 和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求:
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,按下列公式计算突变比值:
突变比值=突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值),以划分野生型纯 合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的MTHFR与FGF5基因SNP位点,实验数据符合上述 要求,因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下:突变比值 范围在0%-20%视为野生型纯合子;30%-70%视为杂合子;80%-100%视为变异型 纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的分型方法检 测结果的吻合率。本方法检测20份样本的MTHFR与FGF5基因型检测结果与测序 结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯 片能够准确地检测出MTHFR与FGF5的SNP类型,且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本MTHFR与FGF5基因突变比值(%)
表6 样本MTHFR与FGF5基因突变类型分析结果
实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对MTHFR与FGF5基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(tag序列及anti-tag序列的选择)
以MTHFR基因G121A位点和FGF5的T196A突变检测液相芯片为例,分别针对 G121A和T196A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,而ASPE 引物5’端的tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8,相应的,包被于微球上的 与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.24。具体设 计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检 测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40 进行检测,检测结果如下:
表8 样本MTHFR检测结果与基因多态性分析
表9 样本FGF5检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片,ASPE引物运用不同的Tag序列,其 结果依然稳定可靠,具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特 异性引物序列搭配时,效果更佳(信噪比更好),参见本实施例试验组1和试验 组5。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配,与实施例2和本实施例的结果相 同,具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发 明的专利范围,凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更,均应包含于本 发明的专利范围中。
机译: 用于检测核酸突变的方法,以检测对食管胆囊炎类似物的真菌和真菌抗性,真菌DNA序列编码全部或部分细胞色素b蛋白,细胞色素b蛋白真菌,等位基因特异性寡核苷酸能够连接到真菌核酸序列的诊断或诊断寡核苷酸的启动子,能够连接到模板。一个或多个诊断引物,探查等位基因特异性寡核苷酸,诊断试剂盒以检测真菌病原体抗性,加工厂要检测和量化突变的频率,选择一种活性杀菌剂及其最佳实施方案,控制一个集合体的真菌感染以及计算机支路,
机译: 玉米基因的用途,转基因玉米的制备方法,生物材料的使用,突变基因,由突变基因编码的蛋白质,突变基因的使用,幼穗的特异性启动子,特异性启动子的使用,分子dna标记,引物,试剂或检测试剂盒,以及DNA分子标记,引物或试剂或检测试剂盒的使用
机译: 用于特异性地检测一种或多种hiv-1基因或蛋白质中一种或多种单核苷酸突变的存在或不存在的方法,用于检测突变的存在或不存在的方法,选择性寡核苷酸引物,寡核苷酸,用于检测突变的试剂盒,寡核苷酸掺合用于选择性突变检测并同时检测一种或多种hiv-1蛋白中的两个或多个突变