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2014-11-12
著录事项变更 IPC(主分类):C12N1/20 变更前: 变更后: 申请日:20111220
著录事项变更
2014-11-12
专利权的转移 IPC(主分类):C12N1/20 变更前: 变更后: 登记生效日:20141022 申请日:20111220
专利申请权、专利权的转移
2013-04-17
授权
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2012-07-18
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/20 申请日:20111220
实质审查的生效
2012-06-13
公开
公开
技术领域
本发明涉及一株兼具硝化功能的反硝化菌株枯草芽孢杆菌、包含该菌株的多种微生物共同组成的适合不同养殖水体的水体改良剂的配方及制备方法。该水体改良剂可以用于水产养殖、水质净化、废物处理、环境保护等领域，主要属于水产养殖和水体改良领域。
背景技术
水产养殖业中，养殖水域底部会积累大量的残余饵料、排泄物等，从而会引起水体败坏、病原菌大量繁殖而导致水产养殖过程中鱼虾等的大量死亡。
目前市场上有许多建立在微生物作用基础之上的微生态水体改良剂，但是目前该些水体改良剂存在活菌存活率低、不同微生物在水体中不能良好共生、对败坏水体水质的适应性较弱等问题。
尽管配制了多种微生物，但是仍然存在微生物作用相对单一，各种效果不能协同展现，不同水体条件下效果差异较大。
发明内容
本发明目的涉及一株兼具硝化功能的反硝化菌株枯草芽孢杆菌，属于生物高新技术领域，并发明了包含有该微生态菌株在内的具有多种协同微生物作用的微生物水体改良剂以及制作方法。
本发明的技术方案：一株兼具硝化功能的反硝化菌株，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)n-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011443；该菌株的发酵培养条件为：温度30-40℃，通气量1:0.3-2 vvm，搅拌速度200-1000 rpm，DO>30%；该菌株的固体菌粉制备是将发酵液经过离心或者板框过滤固液分离，再添加抗热保护剂，进行闪蒸干燥或者喷雾干燥，得到固体菌粉，含水量2%-10%，活菌数2×1011-2×1012 cfu/g。
包含CCTCC NO：M 2011443菌株的多种活性微生物的水体改良剂，配方中包含有：
（1）含有兼具硝化及反硝化功能的枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011443菌株；
和（2）包含由以下两种或两种以上不同种类微生物：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、沼泽红假单胞菌、球形节杆菌、深红酵母、植物乳杆菌；
所述水体改良剂配方中的活菌数水平为：
所述水体改良剂的制备方法，制备步骤为：
（1）菌株的发酵培养：采用液体深层发酵的方式在机械搅拌式发酵罐中进行各个菌株的纯培养，各个菌株在其特定需求温度25-45℃下进行纯培养达到12-48小时后，得到高浓度的纯培养发酵菌液，菌液的单菌落活菌计数结果在1×108-5×1010 cfu/mL或者cfu/g，发酵终点的pH为4.0-9.0；
（2）固体菌粉的制备：各个单菌落发酵结束后，离心去除发酵液，得到湿菌泥；其中各类芽孢杆菌，添加抗热保护剂以后，采用喷雾干燥方法，得到各自芽孢杆菌的孢子体产品，产品活菌数达到1×1011-2×1012 cfu/g；除芽孢杆菌以外的其它菌种，离心得到湿菌泥后，添加冻干保护剂，采用低温真空干燥方法，得到各个菌种的活菌体产品，产品活菌数达到1×1010-2×1012 cfu/g；最终固体菌粉产品中，保护剂所占质量比例为30%-90%；
所述固态微生态水体改良剂的抗热保护剂、冻干保护剂选用脱脂奶粉、半胱氨酸盐酸盐、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、葡萄糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、异抗坏血酸钠、抗坏血酸钠、谷氨酸单钠、硫酸锰、硫酸镁、酵母粉、大豆蛋白胨、牛肉浸粉中的一种或者几种：
（3）固态微生态水体改良剂的制备：将按照上述固体菌粉制备方法得到的固体菌粉，按照配方中的活菌数水平称量完成，再兑以稀释剂，混合均匀后，即得到要求的固体水体改良剂产品；最终固体水体改良剂产品中，稀释剂所占质量比例为90%-99%；
所述固态微生态水体改良剂涉及的稀释剂选用葡萄糖、麸皮、米糠、豆粕粉、玉米粉、麦芽糊精、玉米粉、硅藻土、凹凸棒粉、石粉、绢云母粉、沸石粉、碳酸钙中的一种或者几种；
或（4）液态微生态水体改良剂的制备方法：各个单菌落的发酵液中添加常温菌种保护剂，进行各个菌株的活菌计数，将各个菌株按照配方中的活菌数进行称量配制，再兑以常温菌种保护剂，得到既定浓度的液态水体改良剂；最终液态微生态水体改良剂产品中，保护剂中固体成分占总产品重量比例为1%-3%；
所述液态微生态水体改良剂涉及的常温菌种保护剂选用甘蔗糖蜜、麦芽糊精、麸皮、豆粕粉、玉米粉、米糠粉、葡萄糖、硫酸锰、硫酸镁、氯化钙、硫酸铵、磷酸二氢钾、甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、丙三醇、焦糖色素及水中的一种或几种。
提供的一株兼具硝化功能的反硝化菌株，该菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)n-1，于2011年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2011443。主要生物学特征为：革兰氏阳性细菌，杆状，大小0.7-0.8μm×2-3μm，无荚膜，有鞭毛，能运动。
上述菌株的扩大培养方法为：
种子培养基配方：蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，酵母粉5 g/L，用自来水配制，全部溶解后调节pH 7.5-7.6，固体培养基在调节pH后再往培养基中添加15 g/L琼脂粉，上述配制好的溶液在121℃下灭菌20min。
将上述接种好的菌株在95-100℃水浴中热处理5-10 min，取出迅速冷却至室温，接种于装有50mL液体培养基的500 mL三角瓶中，在37℃下摇床150 rpm培养18-24 h，得到的菌液中活菌数为1×107-3×1010个/mL。
该菌株能在以硝酸盐或亚硝酸盐为单一氮源的培养基中良好生长，单一硝化培养基为：葡萄糖20 g/L，硝酸钠2 g/L (或者亚硝酸钠2 g/L)，磷酸二氢钾2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，用自来水配制，pH 6.0-6.2。
扩大培养基配方：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，硫酸镁 1 g/L，用自来水配制，pH 7.0。
扩大培养方法：在液体发酵罐中进行液体发酵，过程维持通气量1:2 vvm，搅拌200 rpm，压力1 kg/m2，用NaOH或者HCl溶液控制过程pH 6.0。
在上述条件下培养24-48 h后，得到菌种的芽孢体，芽孢占活菌总数的95%以上，发酵液中的总芽孢数可以达到1×109-5×1010 cfu/mL。发酵液经过离心、板框过滤等手段收集菌体，再将菌体经过喷雾干燥即可获得所需的芽孢。芽孢可以用来配制本发明中所述的水体改良剂。
本发明的技术方案还提供了包含上述枯草芽孢杆菌在内的几种活性微生物水体改良剂的配方及制备方法，包含有多种不同的光合细菌、酵母、芽孢杆菌等在内的复合微生态菌剂，主要由以下原料配制而成(为每克产品中包含对应菌株的活菌数)：
在上述复合微生态菌剂中除了枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2011443以外，其他微生物菌种均为微生态菌剂领域常用菌种。
本发明的有益效果：以上述配方制成的活性微生物水体改良剂，可以分为液体制剂和固体制剂两种类型，对上述表格中的微生物，发明人都进行了严格的有针对性的菌株性能筛选研究，使得该改良剂在常温下能稳定存活，保证了产品的性能在较长时间内的有效性；在多种不同的自然水体，都进行了菌株的生存性实验，结果表明菌株的生存性能十分优秀。
在利用该种液体或者固体制剂对养殖水域进行试验的结果说明，使用该种制剂可以有效降低水域中的氨氮、硝基氮以及亚硝基氮，分解水中以及底泥中的有机质，有效降低养殖水的COD和BOD5，抑制藻类及腐生生物的生长，澄清水质。
生物材料样品保藏：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)n-1，已保藏于中国 武汉 武汉大学 中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2011443。保藏日期2011年12月4日。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌扩培方法流程图。
具体实施方式
实施例1具硝化功能的高活性蛋白酶产生菌株的筛选：
从水产养殖池塘的底泥及水体中分离得到适合水质改良的微生物菌株，通过对菌株进行形态学观察、生理生化实验、16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种。
将从江苏某水产养殖池塘中取得的底泥样品称取2 g，加入98 mL无菌生理盐水，在37℃摇床上120 rpm条件下振荡20 min，吸取上清液1 mL加入以硝酸盐为唯一氮源培养基中，振荡6 h，将富集液稀释10000倍后，用涂布棒分别涂布到以硝酸钠、亚硝酸钠以及硫酸铵为唯一氮源培养基中，在37℃恒温培养箱中培养40-48 h，得到一株能较好利用硝酸钠及亚硝酸钠的菌株，编号为n-1，并挑取单菌落进行扩陪，后利用扩陪得到的菌体进行硝酸盐、亚硝酸盐以及硫铵盐的降解性能试验，得到一株能同时降解上述三种盐类的菌株，经过16S rDNA及生理生化性能的鉴定和测试，该菌种属于枯草芽孢杆菌。
n-1的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2011年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2011443。
该枯草芽孢杆菌降解硝酸盐、亚硝酸盐及铵盐的效果如下：
实施例2：菌株扩大培养及产品收集
按照前面所述的菌株扩大培养方法，将斜面的枯草芽孢杆菌按照下述（图1所示）扩培方法，得到一定浓度的枯草芽孢杆菌的孢子液，再将其经过离心和喷雾干燥等手段，得到芽孢粉剂产品。
经过上述培养及后续操作，得到的最终芽孢粉的芽孢数量可以达到1×1011~2×1012 cfu/g。
实施例3：微生态水体改良剂（固体）的制作方法
将筛选到的枯草芽孢杆菌以及其它有效菌株按照各自固体菌粉的活菌数配比比例混合，其中各个有效菌株固体菌粉的活菌添加比例（按照占产品的总活菌数计算）如下：
枯草芽孢杆菌2×108 cfu，地衣芽孢杆菌1×108 cfu，短小芽孢杆菌1×108 cfu，蜡状芽孢杆菌3×108 cfu，巨大芽孢杆菌3×107 cfu，沼泽红假单胞菌1×107 cfu，深红酵母1×107 cfu，球形节杆菌5×107 cfu，植物乳杆菌1×107 cfu。
上述各菌粉按照既定比例混合均匀后，添加麸皮粉、葡萄糖、玉米粉、米糠粉，沸石粉、硅藻土，绢云母粉中的一种或者几种补充到总重量的100%。
各个有效单菌粉按照上述方法严格配制，即可得到本产品所述的微生物水体改良剂，该产品主要用于水产养殖产业中，用于净水及改底。
上述整个加工过程应保证操作环境的清洁，避免污染。控制环境湿度在70%以下，各原料水分含量低于15%，该产品制成后常温下保存6个月，-18℃下保存期限可以达到24个月，保质期内活菌数稳定。
实施例4：微生态水体改良剂（液体）的制作方法
首先将所需要的各个菌株在发酵罐中进行菌体纯培养，得到高活菌浓度的菌体发酵液（109-1010 cfu/mL）。之后将发酵液按照下面的比例，混合均匀，枯草芽孢杆菌2×108 cfu，地衣芽孢杆菌1×108 cfu，短小芽孢杆菌1×108 cfu，蜡状芽孢杆菌3×108 cfu，巨大芽孢杆菌3×107 cfu，沼泽红假单胞菌1×107 cfu，深红酵母1×107 cfu，球形节杆菌5×107 cfu，植物乳杆菌1×107 cfu，营养液（或称常温菌种保护剂）补足到产品重量的100%。
其中营养液（或称常温菌种保护剂）的组成为：七水硫酸镁2 g/L，一水硫酸锰0.5 g/L，氯化钙3 g/L，硫酸铵5 g/L，磷酸二氢钾2/gL，焦糖色素0.1 g/L。
将各个有效单菌粉按照上述方法严格配制，即可得到本产品所述的微生物水体改良剂，该产品主要用于水产养殖产业中，用于净水及改底。产品生产过程中需保证环境清洁，产品制成后常温保质期6个月，4℃冷藏保质期可以达到12个月，期间活菌数保持稳定。
实施例5：微生物水体改良剂（液态）用于水产养殖产业中净水的应用
在使用微生态水体改良剂（液态）对养殖水体进行净化实验过程中，按照0.5kg/亩水塘/米水深进行水面泼洒，泼洒时温度高于25℃，进行了鳙鱼、鲫鱼以及对虾养殖水体的净化实验。该产品可以有效减少养殖水体中的氨氮浓度，并且维持亚硝基氮和硝基氮在低水平维持稳定。
在本实施例中，鳙鱼养殖水体净化效果如下：
在本实施例中，鲫鱼养殖水体净化效果如下：
在本实施例中，对虾养殖水体净化效果如下：
实施例6：微生态水体改良剂（固态）处理环境及养殖有机污水应用实例
将该微生态水体改良剂（固态）进行环境及养殖业造成的有机污水，按照每百吨废水投入100 g固态微生态水体改良剂，定期测定污水的COD，得到如下结果：
机译： 一株链霉菌SP，具有抗植物病原微生物的抗微生物活性，包含其的组合物及其用途。
机译： 重组质粒DNA pSC13D6，包含一链到T虫性脑炎病毒的抗体，以及一株细菌大肠杆菌BL21（DE3）/ pSC13D6-菌株，具有单抗性，可抵抗PRESS虫病。
机译： 具有抗菌活性的循环多肽，其制备方法和纯培养一株鞘膜动菌的方法。
