一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法

摘要

本发明涉及药物化合物检测领域，特别涉及一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法。在该方法提供的高效液相色谱条件下，分别检测不同浓度的对照品溶液和待测品溶液的峰面积，以对照品溶液的浓度和峰面积制作标准曲线，用待测品溶液的峰面积与标准曲线比较，获得待测品溶液中生物碱的浓度。该检测方法精密度高，稳定性、重复性、准确度较好，避免了毒性试剂的使用。

说明书

技术领域

本发明涉及药物化合物检测领域，特别涉及一种检测克泻灵片中生物碱 含量的方法。

背景技术

克泻灵片由苦豆草为原料，按中成药片剂的常规工艺制成的能够清热解 毒，祛风燥湿的中药制剂，临床用于治疗湿热泄泻，痢疾。

苦豆草为豆科植物苦豆子Sophora alopecuroides L.的干燥地上部分， 又称苦甘草、苦豆根，其化学成分主要有喹诺里西啶类生物碱和黄酮两 大类，其生物碱主要包括槐定碱、苦参碱、槐果碱、苦豆碱、槐胺碱、 金雀花碱、氧化苦参碱及N-甲基金雀花碱等。目前，生物碱的含量测定 有重量法、酸碱滴定法、酸性染料分光光度法等，卫生部药品标准中药成 分制剂》第十八册WS3-B-3408-98记载的克泻灵片的质量标准中，生物碱的 测定方法为重量法，该方法专属性较差，所用试剂毒性大，准确性和重复性 差，且操作繁琐。因此，提供一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法，具有 现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法。在该方 法提供的高效液相色谱条件下，分别检测不同浓度的对照品溶液和待测品溶 液的峰面积，以对照品溶液的浓度和峰面积制作标准曲线，用待测品溶液的 峰面积与标准曲线比较，获得待测品溶液中生物碱的浓度。该检测方法精密 度高，稳定性、重复性、准确度较好，避免了毒性试剂的使用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法，包括如下步骤：

取生物碱对照品制备对照品溶液；

取克泻灵片制备供试品溶液；

取不同浓度的对照品溶液经高效液相色谱法获得对照品峰面积，以所述 对照品溶液的浓度和所述对照品峰面积制作标准曲线；

取供试品溶液，经高效液相色谱法获得供试品峰面积，与所述标准曲线 比较，获得供试品溶液中生物碱含量；

所述高效液相色谱法的流动相包括酸的水溶液、乙腈、无水乙醇，所述 酸的水溶液、所述乙腈、所述无水乙醇的体积比为90～98∶1～5∶1～5；所述 酸选自磷酸、醋酸、甲酸。

外标法是仪器分析常用的方法之一，比较法的一种。外标法在与被 测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的 色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种 物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接 近，以利于定量分析的准确性。

外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正因子求算法。校 正曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信 号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。定量分析样品时，在测校 正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面 积，在从校正曲线查出样品的含量。

作为优选，所述酸的水溶液中酸与水的体积比为1～3∶100。

作为优选，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述无水乙醇的体积比为90～ 96∶2～5∶2～5。

作为优选，所述高效液相色谱法的检测波长为205～280nm。

作为优选，所述高效液相色谱法的柱温为25～35℃。

作为优选，所述高效液相色谱法的色谱柱为普通C18柱。

作为优选，所述对照品溶液的制备方法为称取槐定碱、苦参碱、氧化苦 参碱，加甲醇制得浓度为13～142μg/mL的对照品溶液。

作为优选，所述供试品溶液的制备方法为取克泻灵片，加入甲醇后超声 提取，制得供试品溶液，以mg/mL计，所述克泻灵片与所述甲醇的质量体积 比为100∶40～50。

作为优选，所述超声提取时间为20～40min。

作为优选，所述生物碱包括槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱。

本发明提供一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法，在该方法提供的高 效液相色谱条件下，分别检测不同浓度的对照品溶液和待测品溶液的峰面积， 以对照品溶液的浓度和峰面积制作标准曲线，用待测品溶液的峰面积与标准 曲线比较，获得待测品溶液中生物碱的浓度。该检测方法精密度高，稳定性、 重复性、准确度较好，避免了毒性试剂的使用。

附图说明

图1示实施例1中1号量瓶中对照品溶液的高效液相色谱图；横坐标为 保留时间，纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.050min的峰为苦参碱，保 留时间为9.166min的峰为槐定碱，保留时间为13.374min的峰为氧化苦参碱；

图2示实施例1中2号量瓶中对照品溶液的高效液相色谱图；横坐标为 保留时间，纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.074min的峰为苦参碱，保 留时间为9.209min的峰为槐定碱，保留时间为13.381min的峰为氧化苦参碱；

图3示实施例1中3号量瓶中对照品溶液的高效液相色谱图；横坐标为 保留时间，纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.084min的峰为苦参碱，保 留时间为9.229min的峰为槐定碱，保留时间为13.394min的峰为氧化苦参碱；

图4示实施例1中4号量瓶中对照品溶液的高效液相色谱图；横坐标为 保留时间，纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.090min的峰为苦参碱，保 留时间为9.251min的峰为槐定碱，保留时间为13.370min的峰为氧化苦参碱；

图5示实施例1中5号量瓶中对照品溶液的高效液相色谱图；横坐标为 保留时间，纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.076min的峰为苦参碱，保 留时间为9.191min的峰为槐定碱，保留时间为13.332min的峰为氧化苦参碱；

图6示实施例1中6号量瓶中对照品溶液的高效液相色谱图；横坐标为 保留时间，纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.051min的峰为苦参碱，保 留时间为9.174min的峰为槐定碱，保留时间为13.276min的峰为氧化苦参碱；

图7示实施例1中苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图8示实施例1中槐定碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图9示实施例1中氧化苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为 加样量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图10示实施例2中苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图11示实施例2中槐定碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图12示实施例2中氧化苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为 加样量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图13示实施例3中苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图14示实施例3中槐定碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图15示实施例3中氧化苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为 加样量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图16示实施例4中苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图17示实施例4中槐定碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为加样 量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图18示实施例4中氧化苦参碱的对照品溶液标准曲线，其中，横坐标为 加样量(μg)，纵坐标为峰面积(mAU)；

图19示实施例1中供试品溶液的高效液相色谱图；横坐标为保留时间， 纵坐标为峰面积；其中，保留时间为8.170min的峰为苦参碱，保留时间为 9.266min的峰为槐定碱，保留时间为13.561min的峰为氧化苦参碱。

具体实施方式

本发明公开了一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法，本领域技术人员 可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似 的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本 发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显 能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或 适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法，包括如下步骤：

取生物碱对照品制备对照品溶液；

取克泻灵片制备供试品溶液；

取不同浓度的对照品溶液经高效液相色谱法获得对照品峰面积，以所述 对照品溶液的浓度和所述对照品峰面积制作标准曲线；

取供试品溶液，经高效液相色谱法获得供试品峰面积，与所述标准曲线 比较，获得供试品溶液中生物碱含量；

所述高效液相色谱法的流动相包括酸的水溶液、乙腈、无水乙醇，所述 酸的水溶液、所述乙腈、所述无水乙醇的体积比为90～98∶1～5∶1～5；所述 酸选自磷酸、醋酸、甲酸。

作为优选，所述酸的水溶液中酸与水的体积比为1～3∶100。

作为优选，所述酸的水溶液、所述乙腈、所述无水乙醇的体积比为90～ 96∶2～5∶2～5。

作为优选，所述高效液相色谱法的检测波长为205～280nm。

作为优选，所述高效液相色谱法的柱温为25～35℃。

作为优选，所述高效液相色谱法的色谱柱为普通C18柱。

作为优选，所述对照品溶液的制备方法为称取槐定碱、苦参碱、氧化苦 参碱，加甲醇制得浓度为13～142μg/mL的对照品溶液。

作为优选，所述供试品溶液的制备方法为取克泻灵片，加入甲醇后超声 提取，制得供试品溶液，以mg/mL计，所述克泻灵片与所述甲醇的质量体积 比为100∶40～50。

作为优选，所述超声提取时间为20～40min。

作为优选，所述生物碱包括槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱。

本发明提供一种检测克泻灵片中生物碱含量的方法。在该方法提供的高 效液相色谱条件下，分别检测不同浓度的对照品溶液和待测品溶液的峰面积， 以对照品溶液的浓度和峰面积制作标准曲线，用待测品溶液的峰面积与标准 曲线比较，获得待测品溶液中生物碱的浓度。该检测方法精密度高，稳定性、 重复性、准确度较好，避免了毒性试剂的使用。

本发明提供的检测方法中所用试剂均可由市场购得。其中，克泻灵片购 自广州白云山和记黄埔中药有限公司，槐定碱购自中国药品生物制品检定所 (批号为110784-200303)，苦参碱购自中国药品生物制品检定所(批号为 110805-200508)，氧化苦参碱购自中国药品生物制品检定所(批号为 110780-200506)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

对照品溶液的制备：精密称取槐定碱10.60mg，苦参碱8.46mg，氧化苦 参碱9.13mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得到混合对照品 母液，精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL混合对照品母液分别置于25mL 的1至5号量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度梯度的混和对照品 溶液；精密吸取2mL混合对照品母液置于6号量瓶中；1，2，3，4，5，6 号量瓶中苦参碱浓度分别是13.536μg/mL，27.072μg/mL，40.608μg/mL， 54.144μg/mL，67.68μg/mL，112.8μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中槐定 碱浓度分别是16.96μg/mL，33.92μg/mL，50.88μg/mL，67.84μg/mL，84.8μg/mL， 141.333μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中氧化苦参碱浓度分别是14.608μg/mL， 29.216μg/mL，43.824μg/mL，58.432μg/mL，73.04μg/mL，121.733μg/mL。

供试品溶液的制备：精密称取克泻灵片10片，除去薄膜衣，研细、混匀， 取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超声提取30分钟， 放冷，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。

色谱柱选用普通C18柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为 3％磷酸、甲酸、醋酸水溶液-乙腈-无水乙醇(94∶3∶3；)为流动相；检测波长 为205nm；柱温：30℃。

将对照品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，如图1至图6所示， 以对照品溶液的浓度和对照品峰面积制作标准曲线。苦参碱、槐定碱、氧化 苦参碱的进样量、峰面积见表1，标准曲线如图7至图9所示。

表1苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积

苦参碱的标准曲线为：y＝1716.9x-26.815(R²＝0.9996)；

槐定碱的标准曲线为：y＝2005.4x-64.665(R²＝0.9994)；

氧化苦参碱的标准曲线为：y＝2212.6x-33.885(R²＝0.9992)。

将供试品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，如图19所示，与标 准曲线对比，获得供试品溶液中生物碱的浓度。

供试品溶液中，苦参碱含量为8.46mg/g，槐定碱含量为27.82mg/g，氧 化苦参碱含量为7.46mg/g，生物碱总含量为43.73mg/g，每片克泻灵片中总 生物碱含量为17.93mg/片。

实施例2

对照品溶液的制备：精密称取槐定碱8.34mg，苦参碱8.25mg，氧化苦 参碱8.08mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得到混合对照品 母液，精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL混合对照品母液分别置于25mL 的1至5号量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度梯度的混和对照品 溶液；精密吸取2mL混合对照品母液置于6号量瓶中；1，2，3，4，5，6 号量瓶中苦参碱浓度分别是13.344μg/mL，26.688μg/mL，40.032μg/mL， 53.376μg/mL，66.72μg/mL，111.2μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中槐定 碱浓度分别是13.2μg/mL，26.4μg/mL，39.6μg/mL，52.8μg/mL，66μg/mL， 110μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中氧化苦参碱浓度分别是12.928μg/mL， 25.856μg/mL，38.784μg/mL，51.712μg/mL，64.64μg/mL，107.733μg/mL。

供试品溶液的制备：精密称取克泻灵片10片，除去薄膜衣，研细、混匀， 取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超声提取25分钟， 放冷，加甲醇至40mL，摇匀，过滤，即得。

色谱柱选用普通C18柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为 2％磷酸、甲酸、醋酸水溶液-乙腈-无水乙醇(90∶5∶5；)为流动相；检测波长 为280nm；柱温：25℃。

将对照品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，以对照品溶液的浓 度和对照品峰面积制作标准曲线。

苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积见表2，标准曲线如图 10至图12所示。

表2苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积

苦参碱的标准曲线为：y＝1717.9x-23.758(R²＝0.9998)；

槐定碱的标准曲线为：y＝1960.9x-40.288(R²＝0.9996)；

氧化苦参碱的标准曲线为：y＝2197.5x-26.662(R²＝0.9995)。

将供试品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，以标准曲线对比， 获得供试品溶液中生物碱的浓度。

供试品溶液中，苦参碱含量为8.80mg/g，槐定碱含量为29.22mg/g，氧 化苦参碱含量为6.01mg/g，生物碱总含量为44.03mg/g，每片克泻灵片中总 生物碱含量为18.05mg/片。

实施例3

对照品溶液的制备：精密称取槐定碱7.85mg，苦参碱8.66mg，氧化苦 参碱7.98mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得到混合对照品 母液，精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL混合对照品母液分别置于25mL 的1至5号量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度梯度的混和对照品 溶液；精密吸取2mL混合对照品母液置于6号量瓶中；1，2，3，4，5，6 号量瓶中苦参碱浓度分别是12.56μg/mL，25.12μg/mL，37.68μg/mL， 50.24μg/mL，62.8μg/mL，104.67μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中槐定碱 浓度分别是13.856μg/mL，27.712μg/mL，41.568μg/mL，55.424μg/mL， 69.28μg/mL，115.4667μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中氧化苦参碱浓度 分别是12.768μg/mL，25.536μg/mL，38.304μg/mL，51.072μg/mL，63.84μg/mL， 106.4μg/mL。

供试品溶液的制备：精密称取克泻灵片10片，除去薄膜衣，研细、混匀， 取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超声提取20分钟， 放冷，加甲醇至45mL，摇匀，过滤，即得。

色谱柱选用普通C18柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为 1％磷酸、甲酸、醋酸水溶液-乙腈-无水乙醇(98∶1∶1)为流动相；检测波长 为245nm；柱温：35℃。

将对照品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，以对照品溶液的浓 度和对照品峰面积制作标准曲线。

苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积见表3，标准曲线如图 13至图15所示。

表3苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积

苦参碱的标准曲线为：y＝1726.2x-21.085(R²＝0.9997)；

槐定碱的标准曲线为：y＝2004.8x-55.019(R²＝0.9994)；

氧化苦参碱的标准曲线为：y＝2197.7x-30.592(R²＝0.9993)。

将供试品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，以标准曲线对比， 获得供试品溶液中生物碱的浓度。

供试品溶液中，苦参碱含量为4.38mg/g，槐定碱含量为32.91mg/g，氧 化苦参碱含量为6.92mg/g，生物碱总含量为44.21mg/g，每片克泻灵片中总 生物碱含量为18.13mg/片。

实施例4

对照品溶液的制备：精密称取槐定碱8.37mg，苦参碱8.21mg，氧化苦 参碱8.60mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得到混合对照品 母液，精密吸取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL混合对照品母液分别置于25mL 的1至5号量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度梯度的混和对照品 溶液；精密吸取2mL混合对照品母液置于6号量瓶中；1，2，3，4，5，6 号量瓶中苦参碱浓度分别是13.392μg/mL，26.784μg/mL，40.176μg/mL， 53.568μg/mL，66.96μg/mL，111.6μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中槐定 碱浓度分别是13.136μg/mL，26.272μg/mL，39.408μg/mL，52.544μg/mL， 65.680μg/mL，109.467μg/mL；1，2，3，4，5，6号量瓶中氧化苦参碱浓度 分别是13.760μg/mL，27.520μg/mL，41.280μg/mL，55.040μg/mL，68.800μg/mL， 82.560μg/mL。

供试品溶液的制备：精密称取克泻灵片10片，除去薄膜衣，研细、混匀， 取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超声提取40分钟， 放冷，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。

色谱柱选用普通C18柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为 3％磷酸、甲酸、醋酸水溶液-乙腈-无水乙醇(96∶2∶2)为流动相；检测波长 为260nm；柱温：28℃。

将对照品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，以对照品溶液的浓 度和对照品峰面积制作标准曲线。

苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积见表4，标准曲线如图 16至图18所示。

表4苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的进样量、峰面积

苦参碱的标准曲线为：y＝1720.5x-24.562(R²＝0.9996)；

槐定碱的标准曲线为：y＝1999.2x-52.9(R²＝0.9993)；

氧化苦参碱的标准曲线为：y＝2149.3x-24.967(R²＝0.9992)。

将供试品溶液经高效液相色谱法检测，获得峰面积，以标准曲线对比， 获得供试品溶液中生物碱的浓度。

供试品溶液中，苦参碱含量为4.62mg/g，槐定碱含量为33.29mg/g，氧 化苦参碱含量为7.12mg/g，生物碱总含量为45.02mg/g，每片克泻灵片中总 生物碱含量为18.46mg/片。

实施例5本发明提供的检测方法的方法学考察

对照品溶液的制备：精密称取槐定碱8.25mg，苦参碱8.34mg，氧化苦 参碱8.08mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得到混合对照品 母液。

供试品溶液的制备：精密称取克泻灵片10片，除去薄膜衣，研细、混匀， 取约0.1g，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇近刻度，超声提取40分钟， 放冷，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，即得。

色谱柱选用普通C18柱，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为 3％磷酸、甲酸、醋酸水溶液-乙腈-无水乙醇(96∶2∶2)为流动相；检测波长 为260nm；柱温：28℃。

精密度试验：取对照品溶液于同一天连续进样5次，结果见表5。

表5精密度试验结果

由表5可见苦参碱，槐定碱，氧化苦参碱的RSD值均＜3％，说明仪器 精密度良好。

稳定性试验：取克泻灵片分别在0，2，4，6，8，12小时进样，结果见 表6。

表6稳定性试验结果

由表6可见苦参碱，槐定碱，氧化苦参碱在12小时内测得的RSD值均 ＜3％，说明制得的供试品溶液在12小时内稳定。

重复性试验：取克泻灵片6份进行测定，结果见表7。

表7重复性试验结果

由表7可见平行测得6份供试品溶液中苦参碱，槐定碱，氧化苦参碱的 RSD值均＜3％，说明该方法重复性良好。

准确度试验：取克泻灵片6份进行准确度试验，结果见表8。

表8准确度试验结果

由表8可见，按样品项下制备供试品溶液，按色谱条件项条件测定，计 算得苦参碱，槐定碱，氧化苦参碱回收率的RSD值均＜3％，说明该方法的 准确性较好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。