抗乳房炎转基因小鼠模型的构建方法及其专用载体

摘要

本发明公开了一种抗乳房炎转基因小鼠模型的构建方法及其专用载体。本发明提供的一种与抗乳房炎相关的蛋白组合物，包括溶葡萄球菌素和肽聚糖內溶素；所述肽聚糖內溶素来源于无乳链球菌噬菌体B30，其氨基酸序列为序列表中的序列2；所述溶葡萄球菌素的氨基酸序列为序列表中的序列3。本发明的实验证明，本发明利用乳腺特异性表达载体构建了乳腺特异表达溶葡萄球菌素(Lysostaphin)和肽聚糖内溶素(Peptidoglycan endolysin B30)的转基因质粒；通过显微注射法构建抗乳房炎转基因小鼠模型，获得了带有抗牛乳房炎基因的转基因小鼠，为进一步生产抗乳房炎转基因牛提供了技术模型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗乳房炎转基因小鼠模型的构建方法及 其专用载体。

背景技术

奶牛乳房炎做为奶牛一种复杂的、危害严重的常见病，其发病率非常高，控制难 度也随之加大。尽管全世界已有多年的研究，但到目前为止在奶牛饲养中仍然是花费 最高的疾病之一，严重阻碍了奶牛业发展。乳房炎造成的经济损失是由于患牛产奶能 力比正常奶牛降低了很多；患牛牛奶因成分的改变使奶质下降从而导致奶的丢弃；患 牛的妊娠时间和发情周期延长；牛的淘汰率增加以及对患牛的治疗产生的费用等等， 而产奶能力的下降是引起奶牛业巨大经济损失的最为主要原因。每年因奶牛乳房炎影 响奶牛产奶能力而造成全世界损失大约400万吨的牛奶。由此可见，奶牛乳房炎对全 世界奶牛养殖业和乳业的经济影响是非常巨大的，其严重阻碍奶牛业的发展。而对于 我们国家奶牛乳房炎发病率普遍高于国外的的情况下，有效的预防和治疗该病是我们 当前搞好奶牛发展的关键。

在自然界中，几乎所有的细菌都有相应的噬菌体，噬菌体的总量约为1031，因而水 解酶资源相当丰富。虽然，早在1959年Freimer EH等已发现噬菌体水解酶能杀死细菌。 但因抗生素的广泛使用使得人们对噬菌体水解酶的抗菌效果及其应用前景关注度不够 高，直到21世纪人们注意到抗生素耐药性的严重性后才逐渐对重组水解酶的研究产生 兴趣。Schuch等首次报道了在治疗细菌感染方面噬菌体水解酶的应用；已发现噬菌体K 的水解酶LysK可抑制葡萄球菌活性，对大范围的葡萄球菌有效，研究表明LysK可以杀 死9种葡萄球菌，其中包括耐药甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。David G等研究报道 了关于无乳链球菌噬菌体B30肽聚糖內溶素(Peptidoglycan endolysin B30)的诸多 性质。因此近年来利用基因工程手段有目的的改造水解酶(内溶素)的研究以及利用 噬菌体水解酶进行细菌性感染治疗的研究越来越多。

溶金黄葡球菌素(溶葡萄球菌素，lysostaphin)来源于葡萄球菌分泌于胞外的蛋 白质产物，是一种抗菌酶，该酶于1964年由Schindler等从一株编号为NRRL B22628的 模仿葡萄球菌(S.simulan)的培养物中发现并分离，是一种含锌的金属蛋白酶，可水 解葡萄球菌细胞壁肽聚糖甘氨酸五肽键(5个甘氨酸相连)从而溶解细菌细胞壁，达到 杀菌目的。溶金黄葡球菌素主要对葡萄球菌具有溶菌杀菌作用，不同的葡萄球菌对其 敏感性差异较大，其中以金葡菌敏感性最高。

金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳腺炎最主要的致病菌，其中以金黄色葡萄球菌 最具感染性。目前国内外对于乳房炎的治疗仍以抗生素为主，但长期使用抗生素后会 导致细菌耐药性，抗生素残留等许多不利因素。噬菌体水解酶对细菌具有作用速度快， 专一性高，不易产生抗性等特点，另外溶金黄葡球菌素在乳中极低的浓度即具有抗葡 萄球菌的活性，溶菌作用非常强大，并且杀菌作用迅速，也不产生耐药性，将重组溶 金黄葡球菌素与抗生素、内溶素等联合使用是今后临床治疗奶牛乳腺炎的新思路。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与抗乳房炎相关的蛋白组合物。

本发明提供蛋白组合物，包括溶葡萄球菌素和肽聚糖內溶素；所述肽聚糖內溶素 来源于无乳链球菌噬菌体B30，其氨基酸序列为序列表中的序列2；所述溶葡萄球菌素 的氨基酸序列为序列表中的序列3。

溶葡萄球菌素和肽聚糖內溶素均是通过遗传修饰，在真核细胞内不能够被糖基化。

编码上述的蛋白组合物的基因也是本发明保护的范围。

上述基因包括所述溶葡萄球菌素的编码基因和所述肽聚糖內溶素的编码基因；上 述基因具体由所述溶葡萄球菌素编码基因、所述肽聚糖內溶素编码基因和连接二者的 内部核糖体进入位点组成。

上述基因由所述溶葡萄球菌素的编码基因、所述内部核糖体进入位点和所述肽聚 糖內溶素的编码基因依次连接组成。

上述基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。

上述序列1由2065个核苷酸组成，自5’末端第1-799位核苷酸为溶葡萄球菌素 (lysostaphin)的编码基因，自5’末端第800-1469位核苷酸为内部核糖体进入位点 (Internal ribosome entry site，IRES)，自5’末端第1470-2065位核苷酸为肽聚糖 内溶素(Peptidoglycan endolysin B30)的编码基因。

含有上述基因的重组载体、重组菌、转基因细胞或表达盒也是本发明保护的范围。

上述重组载体为将上述基因插入pBC1+adapter载体的Sac1和Apa1间，得到表达溶 葡萄球菌素和肽聚糖內溶素的重组载体。

上述pBC1+adapter载体按照如下方法制备：

1)将接头的正向序列(adapter-seq2+3-F，为tcgatagggcccaataccggtattctcgagattgagc tcta)和接头的反向序列(adapter-seq2+3-R，为tcgatagagctcaatctcgagaataccggtattgggccc ta)退火后得到退火后接头；

2)将步骤1)得到的退火后接头插入到pBC1载体的XhoI位点，得到pBC1+ adapter。

上述蛋白组合物、上述DNA分子、上述的重组载体、重组菌、转基因细胞或表达盒 在构建与抗乳房炎相关的动物模型中的应用也是本发明保护的范围；

上述蛋白组合物、上述DNA分子、上述的重组载体、重组菌、转基因细胞或表达盒 在筛选动物抗乳房炎产品中的应用也是本发明保护的范围；

在上述应用中，所述动物具体为小鼠或者牛；上述抗乳房炎产品为抗金黄色葡萄 球菌药物。

本发明的另一个目的是提供一种构建与抗乳房炎相关的动物模型的方法。

本发明提供的方法，为将上述DNA分子导入动物中，得到转基因动物，即得到与抗 乳房炎相关的动物模型。

上述方法中，所述DNA分子导入动物的方法包括如下步骤：

1)将上述的重组载体用AatII和NarI酶切，回收18.5kb的片段；

2)将步骤1)得到的18.5kb的片段导入动物中，得到转基因动物，即得到与抗乳 房炎相关的动物模型；

所述动物具体为小鼠或者牛。

本发明的第三个目的是提供一种蛋白B。

本发明提供的蛋白B，其氨基酸序列为序列表中的序列3。

上述蛋白B在构建与抗乳房炎相关的动物模型或筛选动物抗乳房炎产品中的应用 也是本发明保护的范围。上述抗乳房炎产品为抗金黄色葡萄球菌药物。

本发明的实验证明，本发明利用乳腺特异性表达载体构建了乳腺特异表达溶葡萄 球菌素(Lysostaphin)和肽聚糖内溶素(Peptidoglycan endolysin B30)的转基因 质粒；通过显微注射法构建抗乳房炎转基因小鼠模型，获得了带有抗牛乳房炎基因的 转基因小鼠，为进一步生产抗乳房炎转基因牛提供了技术模型，也为通过转基因技术 治疗乳房炎的研究奠定了坚实的工作基础。

附图说明

图1为双酶切结果

图2为F0代小鼠PCR鉴定结果

图3为转基因小鼠乳汁的SDS-PAGE电泳

图4为RT-PCR检测转基因转录产物

图5为Spot on lawn分析小鼠乳汁

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、转基因重组载体构建

转基因重组载体pBC1+adapter+seq2+IRES-seq3为将序列表中的序列1插入 pBC1+adapter的Sac1和Apa1间得到的载体，也可命名为质粒pBC1-Lysotaphin- peptidoglycan endolysin B30。

其中，序列1由2065个核苷酸组成，自5’末端第1-799位核苷酸为溶葡萄球菌素 (lysostaphin)，自5’末端第800-1469位核苷酸为内部核糖体进入位点(Internal  ribosome entry site，IRES)，自5’末端第1470-2065位核苷酸为肽聚糖内溶素 (Peptidoglycan endolysin B30)。

pBCl载体利用山羊β-casnein启动子来指导重组蛋白在乳腺组织高效特异性表 达，购自Invitrogen公司，货号K27001。

内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site，IRES)，IRES连接两个开 放阅读框，其转录产物在翻译时，核糖体能同时进入并开始翻译IRES上游及下游的两 个转录子。鉴于由IRES连接的两个不同的基因可以共同转录并且可以各自翻译，该 元件已在转基因生产中得到了广泛应用。

因此利用IRES将溶葡萄球菌素(lysostaphin)和肽聚糖内溶素(Peptidoglycan  endolysin B30)连接，可以使两种抗奶牛乳房炎基因连接并且都获得表达，具体步骤 如下：

1、表达载体pBC1+adapter的构建

pBC1载体只含有XhoI单个克隆酶切位点，为了方便克隆的进行，在pBC1的 Xho1克隆位点插入了含有Apa1、Age1、Xho1、Sac1酶切位点的接头，同时设计接头 两端的序列为TCGAT使之与Xho1酶切出的粘性末端连接后去掉了原本会出现的两个 Xho1酶切位点。

接头的正向序列(adapter-seq2+3-F)为tcgatagggcccaataccggtattctcgagattgagctcta； 接头的反向序列(adapter-seq2+3-R)为tcgatagagctcaatctcgagaataccggtattgggcccta，将接 头的正向序列和接头的反向序列进行退火连接，得到退火后接头，具体如下：退火连 接的反应体系中，正向序列和反向序列终浓度都为100nM，添加10×退火缓冲液 (100mM Tris pH 7.5，1M NaCl，10mM EDTA)，用DEPC水补足余下体积，65℃水浴 温育10分钟后，室温(25℃)冷却1至2小时，得到退火后接头。

将上述得到的退火后接头经XhoI酶切后与经过同样酶切的pBC1载体连接，得到 pBC1+adapter，即为将退火后接头插入到的XhoI位点。

2、重组载体的构建

1)pBC1+adapter+seq2的获得

将修饰后的lysostaphin基因(序列表中序列1自5’末端第1-799位核苷酸， 氨基酸为序列表中的序列2。)插入pBC1+adapter的Apa1和Xho1酶切位点间，得 到载体pBC1+adapter+seq2，具体如下：

人工合成lysostaphin基因(序列表中序列1自5’末端第1-799，且上游携带 Apa1识别序列下游带有Xho1识别序列，命名为seq2，用Apa1和Xho1酶切seq2，得 到的酶切产物与经过同样酶切得到的pBC1+adapter连接，得到pBC1+adapter+seq2。

2)pIRES-seq3的获得

将肽聚糖内溶素(Peptidoglycan endolysin B30)插入pT2KXIG-IRES-EGFP的 Nco1和Sac1酶切酶切位点间，得到载体pIRES-seq3，具体如下：

人工合成肽聚糖内溶素(Peptidoglycan endolysin B30)(序列表中序列1自5’ 末端第1470-2065，且上游携带Nco1识别序列下游带有Sac1识别序列，命名为seq3， 用Nco1和Sac1酶切seq3，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的pT2KXIG-IRES-EGFP (记载在Genes Dev.1998Jul 1；12(13)：2048-60.Niwa H，Burdon T，Chambers I， Smith A中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。)连接，得到重组质 粒pIRES-seq3，经过测序，该质粒为将序列表中序列1自5’末端第1470-2065位核 苷酸插入pT2KXIG-IRES-EGFP中IRES的下游，构成pIRES-seq3。

3)pIRES-seq3的获得

Xho1和Sac1酶切上述2)得到的pIRES-seq3，回收1266bp的酶切片段，与经过 同样酶切的上述1)得到的pBC1+adapter+seq2连接，得到连接产物，将上述连接产 物转入大肠杆菌DH5α菌株中，得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，结果为该 质粒为将序列表中的序列1插入pBC1+adapter的Sac1和Apa1间得到的载体，将该 质粒命名为pBC1+adapter+seq2+IRES-seq3，即为质粒pBC1-Lysotaphin- peptidoglycan endolysin B30。

实施例2、抗乳房炎转基因小鼠模型的构建

一、显微注射DNA片段的获得

取由实施例1得到的质粒pBC1+adapter+seq2+IRES-seq3约2μL，加入的限制 性内切酶AatII和NarI、限制性内切酶反应缓冲液，加水定容至40μL，轻弹管壁混 匀，置37℃恒温箱1h，然后取3μL反应液1％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

转基因载体酶切的反应体系如表1：

表1转基因载体酶切的反应体系

DNA琼脂糖凝胶电泳的结果如图1所示，1：AatII和NarI酶切片段；M：1000bp DNA ladder，回收18.5kb的酶切片段，得到显微注射DNA片段，经过测序，该显微注射 DNA片段片段包括序列表中的序列1，还有部分为乳腺特异表达的启动子以及poly A 的尾部。

回收后的显微注射DNA片段紫外分光光度计测定浓度，稀释至浓度为2ng/μL， 10μL/管分装，-80℃保存备用。注射前将注射用DNA片段12000rpm离心5min，取中 间部分溶液用于注射。

二、抗乳房炎转基因小鼠模型的获得

将由实施例1得到的显微注射DNA片段进行显微注射入小鼠雄原核内，得到转基 因小鼠，即为抗乳房炎转基因小鼠模型，具体如下：

1、实验材料

1)实验动物

SPF级ICR封闭群小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可 证号：SCXK-(军)2007-004，以下也称为野生型小鼠。所有实验用鼠均在SPF级屏障 设施的软塑隔离包饲养和繁殖，温度控制在23℃±1℃，湿度(55±5)％。光照时间 (12h明/12h暗)，自由采食和饮水，使用北京科奥协力饲料有限公司经Co60辐照灭 菌饲料。

2)主要试剂

孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)(宁波三生药业公司)； M2(sigma，M7167)；M16(sigma，M4287)；透明质酸酶(sigma，H3506)及石蜡油(sigma， M8410)。

3)主要仪器

恒温孵箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；CO₂培养箱(美国Forma)；倒置显微镜 (日本NIKON TE2000)；显微操作系统(德国Eppendorf)；显微注射系统(德国 Eppendorf Femtojet)；体式显微镜(日本NIKON SMZ-645)；拉针仪(David Kopf  Instruments，USA)；煅针仪(日本Nari shi ge MF-400)、磨针仪(日本Nari shige EG-400)；超净工作台(上海三发科学仪器有限公司)；毛细玻璃管(美国Harvard  Apparatus)；各种手术器械(北京医药股份有限公司)；注射器(北京科友佳生物技术 有限公司)；各种培养皿(美国Costar)。

4)持卵针和显微注射针的制备

(1)持卵针制备

取直径1mm的玻璃管，在拉针仪上，设定拉针参数为热力15，拉力25，拉好后 再用煅针仪断成直径约为80μm的平口针，再用磨针仪将断口磨平后在断针仪上烤针， 将内径烤至20-30μm，保存备用。

(2)显微注射针制备

取直径1mm的玻璃管，在热力17，拉力35，拉成针尖小于1μm的注射针后直接 保存备用。

(3)毛细玻璃吸管制备

选用外径1.5mm、长度10cm的玻璃细管，左右手分别捏住玻璃管两端，将中间部 位置于火焰上旋转加热至发红变软，双手轻轻向两端拉，在玻璃管中间用砂轮轻划， 掰断成2根细管，其最细处约130至160μm，端口轻轻滑过火焰使其加热变得光滑。 准备一次性输液器，延输液器上滤器前后端约20cm左右分别剪短输液管，其较细一端 连接玻璃管的粗断口，另一端则为口吸端。

2、结扎雄鼠的准备

准备6周龄的ICR雄性小鼠，2％戊巴比妥钠按45mg/kg体重的剂量麻醉小鼠，麻 醉后将其仰卧保定，用弯头手术小剪箭去下腹部鼠毛，75％酒精消毒手术部位，横向切 口两后肢间腹面，皮肤肌肉切口不用太大(约1cm)，找到脂肪垫用钝头镊子轻轻拉出， 睾丸、附睾和输精管会随之拉出，用镊子剥离输精管周围组织，用镊子夹起游离了的 输精管形成一个半圆环，用烧红的眼科小镊子迅速夹断半圆形输精管，用镊子将整个 组织送回腹腔内，同样的方法夹断另一侧输精管。将所有组织恢复原位后，缝合肌肉、 皮肤，消毒切口后将鼠放入鼠笼，2周后即可康复。下午或晚上将雄性小鼠编号后与8 周龄的发情期雌鼠合笼，次日早晨验栓，阳性小鼠处死冲卵，显微镜观察是否有受精 卵，若无受精卵说明结扎成功，该雄鼠可用于生产假孕雌鼠。

3、供体雌鼠的准备

选取6周龄左右的雌性未发情ICR小鼠，当天下午2点左右每只小鼠腹腔注射 PMSG(10IU)，48h后腹腔注射hCG(10IU)，然后与健康的雄性ICR小鼠1∶1合笼，次日 早晨检栓，阳性者作为供体母鼠。

4、受体雌鼠的准备

当供体雌鼠与雄鼠合笼的同时，挑选8周龄左右的发情期健康雌性ICR小鼠与结 扎成功的雄性ICR小鼠2∶1合笼，次日早晨检栓，阳性者挑出作为当日的受体小鼠。

5、冲卵回收胚胎

注射hCG 28h检栓阳性的雌性ICR小鼠，脱颈椎法处死小鼠，仰卧于手术板，75％ 酒精消毒皮肤，在腹部中间位置用眼科剪将皮肤剪一小口，双手捏住皮肤沿鼠头尾方 向轻拉，撕开皮肤，用消毒的剪刀镊子打开腹腔，可看到脂肪垫旁的输卵管及卵巢， 游离输卵管，将其剪下放入盛有在37℃预热过的M2培养滴中，在解剖显微镜下撕开 输卵管壶腹部，可看到卵丘细胞团漏出(或用配钝头的4号针头1mL注射器吸取M2 插入输卵管伞部冲洗整个输卵管，液体由管另一开口流出)，加入500IU/mL的透明质 酸酶处理约0.5min后可得到受精卵，立即用玻璃吸管将排出第二极体并有两个原核、 胞质均匀、无异常卵裂、细胞饱满、透明带清晰的优质受精胚胎移入另一M2培养皿中， 用M2洗2-3次，转入矿物油覆盖并37℃预热的M16培养滴中，放入37℃的5％CO₂培 养箱培养。

6、显微注射

在载玻片上做一个直径约2.5mm的M2液滴，液滴用石蜡油覆盖，再做一个浓度 约2ng/μL的DNA液滴并以石蜡油覆盖以防蒸发，将挑选好的优质单细胞原核期胚胎 由M16转入M2液滴中，载玻片移到显微镜的载物台上，将持卵针和注射针固定在操作 臂上，调整好角度方向，吸吹液体确认注射针开口，并用玻璃针排列整齐受精卵，然 后开始显微注射，用固定管吸住一个卵子，压力不要太大，用注射管调整其位置，使 受精卵的原核清晰可见，并使针尖与原核清晰位于同一焦平面将注射管刺入原核，注 射实施例1得到的显微注射DNA片段，当看到原核明显胀大后快速退针。用持卵针将 受精卵推向下方，再次吸住一个新的受精卵进行同样注射操作，如此重复直到全部受 精卵注射完毕。注射后将受精卵转入矿物油覆盖37℃预热的M16培养滴中，在37℃的 5％二氧化碳培养箱中培养约60min。恢复培养后倒置在显微镜下观察胚胎并记录。 以具有完整卵胞质膜、正常卵周隙判断为存活胚胎，可用于胚胎移植；胞质扩散，卵 周隙消失的则为死亡胚胎，弃掉。

7、胚胎移植

按受精卵存活数目，2％戊巴比妥钠按45mg/kg体重的剂量腹腔注射麻醉受体鼠， 将小鼠仰卧于手术板，剪去背部俩后肢背面中线两侧鼠毛，75％酒精消毒，在背中线最 后肋骨水平上，纵向切开1cm左右小口，将小鼠移到体视显微镜下找到脂肪体用钝头 镊子夹出，随之卵巢、输卵管等组织也被拉出，用小夹子夹住连着卵巢的脂肪体，固 定。用毛细玻璃移植管先间隔3mm吸入空气泡和培养基，在前端吸入12个左右胚胎， 将移植管放在安全的地方。撕开囊膜找到输卵管喇叭口和壶腹部，由喇叭口插入移植 管，吹入胚胎，仔细观察直到里面的空气泡进入膨大部。抽出移植管，然后将卵巢等 组织复原到腹腔内，缝合肌肉和皮肤，用75％酒精消毒手术口，在37℃环境下保温观 察待其苏醒。

用由实施例1得到的显微注射DNA片段进行显微注射入小鼠雄原核内，一共注射 了320枚受精卵，其中存活205枚，移植到10只受体鼠，5只怀孕，共出生了29只 F0代转基因小鼠。

三、转基因小鼠的鉴定和传代

1、转基因小鼠的鉴定

pEASY-T1载体来自全式金公司。

提取出生2周F0代转基因小鼠的尾尖约0.5cm的基因组DNA，分别用两对PCR筛 选用特异性引物进行PCR扩增，以野生型小鼠为对照。引物序列如下表2所示：

表2Seq2，Seq3和对照引物序列

表3PCR扩增反应体系

PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s， 72℃延伸15min，35个循环，4℃保存。

结果如图2所示，为F0代转基因小鼠PCR鉴定结果，图2A为使用seq2引物扩 增的结果；图2B为使用seq3引物扩增的结果；图2C为使用对照引物Gapdh扩增的结 果，C1：野生型ICR小鼠PCR产物；C1-1x：野生型ICR小鼠基因组DNA加阳性对照质 粒(阳性对照质粒为pBC1+adapter+seq2+IRES-seq3)0.3pg的PCR产物；C1-5x：野 生型ICR小鼠基因组DNA加阳性对照质粒1.5pg的PCR产物，C1-50x：野生型ICR小 鼠基因组DNA加阳性对照质粒15pg的PCR产物；-：阴性对照；F21-F38：F0代转基 因小鼠PCR产物；M：100bp DNA ladder，可以看出，Seq2引物对得到437bp大小扩 增条带，且Seq3引物对得到409bp大小扩增条带的为阳性F0代转基因小鼠，表明有 3只小鼠为阳性F0代转基因小鼠，阳性率为10.3％(3/29)，编号分别为F32，F35，F38。

回收阳性F0代小鼠的Seq2引物对扩增得到的437bp大小PCR扩增产物，与pEASY- T1克隆载体连接，得到连接产物，得到转化子，提取转化子的质粒，进行HindIII和 Xho1双酶切，得到437bp的为阳性质粒，将该阳性质粒送去测序，该质粒含有PCR产 物具有序列表中序列1自5’末端第75-511位核苷酸，即lysostaphin基因，进一步 证明为编号分别为F32，F35，F38为阳性F0代小鼠。

说明得到的编号分别为F32，F35，F38为阳性F0代小鼠为抗乳房炎转基因小鼠模 型。

2、转基因小鼠的传代

编号分别为F32，F35，F38的阳性F0代转基因小鼠(原代即F0代)3周左右离 乳，雌雄分笼饲养，待生长至8周左右，分别与正常ICR小鼠合笼传代保种，得到F1 代转基因小鼠(如32#系F1代转基因小鼠)，用于后续实验。再将F1代转基因小鼠 与正常ICR小鼠合笼传代保种，得到F2代小鼠。其中F38在4周龄时由于不明原因死 亡。F32和F35状态良好，待其长至6周龄后，与野生型ICR雄鼠合笼。

结果见表4和表5，将35-9#雄性F1小鼠(编号F35的阳性F0代转基因小鼠的子 一代)与野生型ICR雌性小鼠交配所得的小鼠为F2代，共获得F2代小鼠32只。其中， 雌性12只，雄性20只。将founder35#小鼠所获得的F2代小鼠与野生型小鼠交配， 共获得F3代小鼠35只。到目前为止，所获得的两个转基因系(32#和35#)都可以传 代至F4代。说明两个转基因系都可以稳定地遗传。

founder32#小鼠与founder35#小鼠的F1代小鼠检测结果如下：

表4founder 32#与野生型交配后所获得子代小鼠

表5founder 35#与野生型交配后所获得子代小鼠

四、转基因小鼠中目的基因的表达

1、乳汁中目的基因表达

将PCR检测32#系F1代转基因小鼠和野生型小鼠的乳汁用乳样缓冲液(乳样缓 冲液：125mM/L NaCl，25mM/L Tris pH7.4，5mM/L KCl，2mM/L PMSF。)1∶4稀释 后，在4℃低温离心机12000rpm离心15min，轻轻去除上层的脂肪，取中间层乳清液 于另一离心管-20℃保存备用，得到乳清液。

将乳清液进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，1：野生型小鼠乳汁，上样量为 2.5μL；2：32#系F1代小鼠乳汁，上样量为2.5μL；3：野生型小鼠乳汁，上样量为5μL； 4：32#系F1代小鼠乳汁，上样量为5μL；5：野生型小鼠乳汁，上样量为10μL；6：32 #系F1代小鼠乳汁，上样量为10μL；7：野生型小鼠乳汁，上样量为15μL；8：32# 系F1代小鼠乳汁，上样量为15μL；M：蛋白marker；可以看出，相对于野生型小鼠， 在转基因小鼠乳汁中出现了一条明显的蛋白条带，大小约为20KD(黑色箭头所示)， 与插入的转基因蛋白lysostaphin和endolysin大小一致(大小也为20KD左右)。

2、目的基因在小鼠组织中表达情况

剪取阳性的32#系F1代小鼠的肝脏、乳腺各200μg分别放于不同编号的匀浆器 中，用Triozl提取RNA，反转录得到cDNA，以seq3引物PCR扩增，以Gapdh引物对 作为阴性对照，结果如图4所示，RT-PCR检测转基因转录产物，1：野生型小鼠乳腺 组织，2：野生型小鼠脾脏组织，3：32#系F1代小鼠脾脏组织，4：32#系F1代小鼠 乳腺组织，5：32#系F1代小鼠乳腺组织，从图中可以看出，在32#系F1代小鼠乳 腺组织中有409bp的片段，在32#系小鼠中，转基因在乳腺组织中特异性地表达，而 不在其它组织表达。

3、转基因小鼠乳汁的功能学分析-spot on lawn分析

1)分别挑取金黄色葡萄球菌单克隆1和2(均购于中国科学院微生物研究所，1 的菌种编号为1.2386，2的菌种编号为1.2419)接种于2ml培养基中，220转/分钟， 37℃摇床振荡培养至对数生长期。

2)准备含琼脂浓度分别为1.5％和0.7％的培养基，高压灭菌。

3)在100mm细菌培养皿中倒入冷却至55℃左右的1.5％琼脂培养基10ml，室温 (25℃)冷却后备用。

4)将对数生长期细菌按1∶200比例加入冷却至55℃的含0.7％琼脂的培养基中， 混合均匀后，倒入凝固的含1.5％琼脂培养基皿中，得到A和B两个培养皿，其中，A 为金黄色葡萄球菌CGMCC1.2386，B为金黄色葡萄球菌CGMCC1.2419；按照每个100mm 培养皿倒入7ml液体，在超净工作台中自然冷却30分钟后，在每个培养皿上画线。

5)取脱脂的32#系F1代小鼠的乳汁15μL滴在培养皿凝固的培养基上。

6)加同体积的液体培养基作为阴性对照，浓度为100μg/mL的溶葡萄球菌素 (lysostaphin)作为阳性对照。

7)滴上乳汁的培养皿放在超净台中静置30分钟后转入37℃培养箱过夜培养后观 察，拍照。

结果如图5所示，Spot on lawn分析小鼠乳汁，，A中的金黄色葡萄球菌为 CGMCC1.2386，B中的金黄色葡萄球菌为CGMCC1.2419；A和B图中1均为野生型小鼠 乳汁；2和3均为32#系F1代小鼠乳汁；4均为培养液，作为负对照；5均为溶葡球 菌酶，作为阳性对照。可以看出，野生型小鼠没有产生抑菌圈，而32#系F1代小鼠 产生明显的抑菌圈，说明转基因小鼠乳汁中的蛋白抗菌性明显高于野生型小鼠，说明 转基因小鼠乳汁中可能特异性表达有溶葡萄球菌素(Lysostaphin)，并且其具有抗菌 功能。

以上实验说明了，本发明获得了带有抗牛乳房炎基因的转基因小鼠，从而可以迅速 检验抗菌蛋白基因以及转基因调控元件在乳腺中的表达调控情况，为体细胞转基因牛 提供基础和依据；同时可以系统检测转基因小鼠表达的各种单价抗菌蛋白以及多价抗 菌蛋白质对抗人工接种乳房炎致病菌的效价和整体动物的抗病效率。