对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌特异的抗体及将其用于甲氧西林抗性葡萄球菌的检测方法和试剂盒

摘要

本发明涉及抗在金黄色葡萄球菌甲氧西林抗性菌株(MRSA)中特异性表达的蛋白的抗体，以及用于检测MRSA的方法和试剂盒。通过使用用于检测PBP2a的PBP2a特异性抗体和用于检测蛋白质A的蛋白质A特异性抗体，本发明能够快速且准确地检测MRSA。

说明书

技术领域

本发明提供了针对在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的甲 氧西林抗性株(MRSA)中特异性表达的蛋白质的抗体，和用于检测MRSA 的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包括所述抗体，从而可从其他金黄 色葡萄球菌株中快速且准确地选择性区分并检测MRSA。

背景技术

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是医院感染和非医院感染的最常见病原 体之一。金黄色葡萄球菌S.aureus的代表类型包括：甲氧西林抗性金黄 色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林抗性凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)、甲 氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌 (MS-CNS)。在这些细菌中，MRSA是最常见医院细菌之一，感染免疫力 弱的患者。然而，仅很少的抗菌药物被开发，因此由该细菌引起的患者 感染率非常高。

目前，MRSA感染可通过以下方法诊断：(1)在培养的细菌上进行抗 生素敏感性测试，(2)从培养细菌菌落检测MRSA特异的基因，和(3)从培 养的细菌菌落中检测MRSA特异的蛋白。虽然大部分医院使用方法(1)， 但是获得测试结果至少需要2-3天。特别是对于小型医院，通过观察培养 细菌中MRSA特异的蛋白检测感染的方法很难进行，因为该方法可能再 需要另外一天或两天。因此，经常不进行诊断测试就使用抗生素。在实 践中，方法(2)和(3)对于普通诊所太复杂而难以进行，使得仅为研究目的 而进行这些方法。

以这些目前可获得的方法，MRSA感染的检测被延迟，经常的情况 是失去最佳的治疗时间点或者施用了不合适的抗生素。因此，非常需要 开发用于快速且准确检测MRSA的方法和试剂盒。

附图说明

图1a至1c显示了，根据本发明的实施方案，金黄色葡萄球菌的菌 株中青霉素结合蛋白2a(下文称作PBP2a)氨基酸序列的种间同源性。

图2显示了，根据本发明的实施方案，含PBP2a的细菌中多个PBP2a 蛋白的氨基酸同源性，目的是选择金黄色葡萄球菌特异的序列。

图3显示了，根据本发明实施方案，细菌表达的多肽的电泳结果， 其中所述多肽通过使用PBP2a特异性引物获得。在所述凝胶上，M列分 别显示175kDa、83kDa、62kDa、47.5kDa、32.5kDa和26kDa的分子量 标志。1列是前蛋白质表达物，2列是37kDa His-PBP2a表达，3列是纯 化后获得的蛋白。

图4显示了，根据本发明的实施方案，其中显示His-PBP2a特异性 抗体形成的ELISA分析结果，与His-凝固酶(阴性对照抗原)比较。

图5a和5b显示本发明的单克隆抗体展示的对His-PBP2a的亲和度。 具体地，图5a是His-PBP2a被稀释并通过ELISA测定的曲线图，而图 5b是本发明的单克隆抗体被稀释并通过ELISA测定的曲线图。

图6的曲线图显示了，根据本发明的实施方案，测定本发明的单克 隆抗体展示的对蛋白质A的亲和性的ELISA结果。

图7a和7b显示使用本发明的单克隆抗体在MRSA、MSSA和 MS-CNS中检查的PBP2a的存在情况。具体地，图7a是免疫印迹测定 的结果，而图7b是ELISA的结果。

图8a是夹心ELISA的简单操作思路。图8b是(快速)侧流免疫谱 测定(lateral flow immunographic assay)的简单操作思路。

图9a至9c显示了，PBP2a抗原可以通过以下方式检测：从本发明 的单克隆抗体制备包被抗体和检测抗体对，并且使用这样的抗体对。具 体地，图9a显示了夹心ELISA的结果，其中与生物素结合的本发明的 单克隆抗体被用作检测抗体。图9b显示了夹心ELISA的结果，其中本 发明的6G10单克隆抗体被用作检测抗体，并且本发明的′9C6′单克隆抗 体作为包被抗体。图9c显示了夹心ELISA结果，其中His-PBP2a被连 续稀释。

图10a和10b显示了，MRSA可以通过使用本发明的单克隆抗体从 其他金黄色葡萄球菌选择性检测。图10a是这样的测试结果，即其中使 用从本发明的单克隆抗体构建的抗体对通过夹心ELISA测定从5株 MRSA和1株MSSA收集的裂解物。图10b显示了这样的测试结果，即 其中使用从本发明的单克隆抗体构建的抗体对通过夹心ELISA检查多个 菌株中PBP2a的存在情况。

图11显示了使用从本发明的单克隆抗体构建的抗体对的侧流免疫测 定的结果。

图12显示了其中抗-蛋白质A多克隆抗体被用于检测蛋白质A存在 情况的夹心ELISA结果。

图13显示了其中使用了抗-蛋白质A多克隆抗体的侧流免疫测定的 结果。

图14a至14e显示了使用本发明的单克隆抗体和抗-蛋白质A多克隆 抗体的MRSA的检测结果。图14a是夹心ELISA的结果，而图14b至 14e是侧流免疫测定的结果。

具体实施方式

【技术问题】

认识到以上所述的问题，本发明人研究了用于MRSA感染的检测方 法并提供了本发明，本发明通过使用PBP2a特异性单克隆抗体和蛋白质 A特异性抗体能够以快速且准确的方式检测MRSA。

因此，本发明的一个目的是提供一种与包含青霉素结合蛋白 2a(PBP2a)片段的多肽特异性结合的单克隆抗体，其中所述PBP2a片段具 有SEQ ID NO：1的氨基酸。

本发明的另一个目的是提供一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤细 胞，其中所述杂交瘤细胞的登记号为KCLRF-BP-00202、 KCLRF-BP-00203或KCLRF-BP-00204。

本发明的又另一个目的是提供一种用于MRSA检测的方法，包括以 下步骤：使测试样本与PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体接触； 检测抗原-抗体复合物的形成。

本发明的再另一个目的是提供一种用于MRSA检测的试剂盒，所述 试剂盒包含PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体。

本发明的再另一个目的是提供一种用于MRSA检测的组合物，所述 组合物包含PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体。

【技术方案】

为了实现上述目的，本发明提供了一种与包含PBP2a片段的多肽特 异性结合的单克隆抗体。所述PBP2a片段优选具有SEQ ID NO：1的氨 基酸序列。

本发明还提供了一种产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。所述杂交 瘤细胞的登记号为KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203或 KCLRF-BP-00204。

本发明还提供一种用于MRSA检测的方法，包括以下步骤：使测试 样本与PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体接触；检测抗原-抗体复 合物的形成。

本发明还提供一种用于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)检测 的试剂盒，所述试剂盒包含PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体。

本发明还提供一种用于甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)检测 的组合物，所述组合物包含PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体。

以下是本发明的更详细描述。

对于本发明，术语“单克隆抗体”是指本发明所属领域广泛为人所 知的单克隆抗体。单克隆抗体显示高特异性，即对单个抗原位点特异(单 一特异性的)。与包括不同抗体(每个抗体识别每个不同的表位)的多克 隆抗体不同，单克隆抗体识别每个抗原的单个表位。本发明的单克隆抗 体能够通过常规克隆和细胞融合技术制备。例如，可通过将目标免疫原 (抗原)注射进入野生小鼠或养殖小鼠(即BALB/c)制备天然单克隆抗 体或人单克隆抗体。

这样的抗体可以被单独注射或与佐剂结合注射，可以通过载体表达， 或者可以以DNA或融合蛋白的形式诱导免疫应答。融合蛋白可以是由免 疫应答诱导的肽偶联的载体蛋白质。这样的载体蛋白质的实例包括但不 限于β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽S-转移酶、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血 清白蛋白。在该情况下，肽作为运载蛋白质的半抗原发挥作用。

下文简单地提供了单克隆抗体的制备方法。将选出的动物加强免疫 之后，取出脾脏收集脾细胞。然后使用本发明所属技术领域已知的技术 将脾细胞与骨髓瘤细胞融合[Kohler and Milstein，Nature 256：495-497 (1975)；and Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)]。获得杂交瘤细胞后，通过 常规技术(例如，通过有限稀释)进行克隆，然后培养产生所需单克隆 抗体的克隆。单克隆抗体提供以下益处：提高利用抗原-抗体复合物的诊 断和分析技术的选择性和特异性。另一个益处是，这样的单克隆抗体无 污染，因为它们是通过杂交瘤培养生产的。

对于本发明，术语“杂交瘤”为本领域技术人员广泛所知，是指由 抗体产生细胞和无限增殖细胞融合产生的细胞。例如，杂交瘤可以是与 骨髓瘤细胞融合产生的细胞。杂交瘤能够持续提供抗体。

对于本发明，术语“检测标签”是指用于检测免疫复合体的标签。 这样的检测标签的实例包括但不限于：放射性同位素、酶、化学发光化 合物、荧光物质(如荧光素)、藻胆蛋白、镧系元素螯合物、罗丹明、酶 辅因子和生物素。

对于本发明，术语“测试样本”是指任何生物材料，包括细胞、组 织和生物流体(biofluid)。

对于本发明，术语“抗原-抗体复合物”是指PBP2a(或蛋白质A)和 识别所述PBP2a(或蛋白质A)的相应抗原的复合物，因此所述复合物可 以用于确定PBP2a(或蛋白质A)在所给样本中存在与否。

本发明的PBP2a特异性抗体可以是与包含具有SEQ ID NO：1的氨 基酸的PBP2a片段的多肽特异性结合的抗体，该片段在PBP2a序列中 显示低程度的种间同源。所述PBP2a特异性抗体优选可以是单克隆抗体。

此外，所述具有SEQ ID NO：1的氨基酸的PBP2a片段可以纯化自 所述MRSA株，或者可以通过使用载体以重组蛋白的形式制备。所述 PBP2a片段优选可以通过使用EcoR I和Xho I作为限制性内切酶进行载 体克隆而获得。

所述多肽被构建为包含对MRSA的PBP2a特异的N末端区，这是 通过在金黄色葡萄球菌多个株中同源分析PBP2a发现的(参见实施例 1-1)。

因此，本发明的抗体可以将所述多肽识别为抗原，从而检测PBP2a 的存在情况。所述抗体优选可以是单克隆抗体。可使用常规抗体制备技 术制备所述单克隆抗体。抗体优选产生自选自杂交瘤KCLRF-BP-00202、 KCLRF-BP-00203和KCLRF-BP-00204(由保藏号表示)的杂交瘤。所 述杂交瘤于2009年2月18日保藏于韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)。

在本发明的一个实施方案中，可以使用PBP2a特异性引物制备大量 抗原(参见实施例1-2)。然后将所述抗原腹膜内注射至小鼠。之后，对 产生多克隆抗体的小鼠进行选择，其中多克隆抗体显示出针对PBP2a的 最高抗体滴度，但对His-凝固酶(用作阴性对照)却显示出低度的亲和 性(参见实施例1-3)。通过融合所述小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞制备 杂交瘤。从所述杂交瘤产生PBP2a特异性单克隆抗体(参见实施例2)。

由于本发明的单克隆抗体表现出PBP2a特异性识别，它们可以检测 MRSA和MR-CNS，已知它们含有PBP2a。

在本发明的一个实施方案中，由ELISA证实了本发明的单克隆抗体 具有PBP2a抗原特异性(参见实施例3)。由免疫印迹测定或ELISA证 实，本发明的单克隆抗体可以用于检测MRSA(参见实施例4)。此外， 在本发明的一个实施方案中，从本发明的单克隆抗体中选择单克隆抗体 对，并且发现使用这样的单克隆抗体对可以通过夹心ELISA或免疫色谱 测定检测MRSA(参见实施例5)。

本发明的单克隆抗体可以，但不限于，是与能够产生可检测信号的 检测标签结合的单克隆抗体。这样的检测标签可以是选自以下的一种或 多种：酶、荧光物质、发光和放射性材料。更详细地，检测标签的实例 包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。

所述检测标签可直接地或通过偶联物(即，本领域已知的连接物) 间接地偶联或结合至本发明的单克隆抗体。合适的酶的实例包括：辣根 过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷 酶、葡糖氧化酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转化酶。合适 的辅基的实例包括：链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适荧光材料 的实例包括：伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基 胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白和藻胆蛋白。合适发光材料的实例包括： 鲁米诺、异氨基苯二酰肼(isoluminol)和光泽精。合适生物发光材料的 实例包括：萤光素酶、萤光素和水母蛋白。合适放射性材料的实例包括： ¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁹Tc、¹⁴C和³H。

待用于本发明的杂交瘤细胞系可以是登记号为KCLRF-BP-00202、 KCLRF-BP-00203或KCLRF-BP-00204的杂交瘤细胞。所述杂交瘤细胞 系于2009年2月18日保藏于韩国细胞系库。

产生这样的杂交瘤的技术为本领域技术人员广泛知晓，优选通过抗 体产生细胞和无限增殖细胞(例如，骨髓瘤细胞)融合制备杂交瘤。

在本发明的一个实施方案中，在杂交瘤中小鼠脾细胞和小鼠杂交瘤 细胞融合，通过其证实可以产生PBP2a特异性单克隆抗体(参见实施例 2)。

可以将本发明的MRSA检测方法用于通过检测抗原-抗体复合物的 存在情况来检测MRSA，在所述方法中使PBP2a特异性抗体和蛋白质A 特异性抗体各自与测试样本接触。

所述PBP2a特异性抗体可以是与包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸 序列的PBP2a片段的多肽特异性结合的抗体。所述与包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸的PBP2a片段的多肽特异性结合的PBP2a特异性抗体是 本发明的单克隆抗体。

蛋白质A是在金黄色葡萄球菌中特异性表达的蛋白，其在MRSA和 MSSA中特异性表达，但不在MR-CNS或MS-CNS中表达。

所述蛋白质A特异性抗体可以，但不必须，是从以蛋白质A免疫的 鸡中获得的多克隆抗体。

本发明的检测方法能够通过使用PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异 性抗体二者检测MRSA。由于蛋白质A存在于MRSA中，但不存在于 MR-CNS中，所述两菌株不能仅通过使用PBP2a特异性抗体来区分，但 可以通过使用PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体二者轻易地区 分。

由于蛋白质A对很多抗体中Fc区的亲和性，通过使用抗体检测蛋白 质A有困难。然而，已知来自鸡的抗-蛋白质A抗体不表现这种对蛋白质 A的结合性质(Larsson A，J.1989；27(12)：2856-7.J Clin Microbiol.)。因此，抗-蛋白质A抗体通过用蛋白质A免疫鸡制备(参见 实施例6-1)。

在本发明的实施方案中，证实了产生蛋白质A的菌株MRSA和 MSSA可以以如上制备的蛋白质A特异性抗体通过夹心ELISA或免疫色 谱测定检测(参见实施例6-2和6-3)。

因此，本发明的MRSA检测方法(1)通过PBP2a特异性抗体检测 PBP2a，(2)通过蛋白质A特异性抗体检测蛋白质A，从而能够特异性检 测MRSA，MRSA含有PBP2a和蛋白质A二者。换言之，可得出这样的 结论，即当在(1)和(2)两项检测中都观察到阳性抗原-抗体反应时，存在 MRSA。

在本发明的一个实施方案中，通过如上所述的(1)和(2)的抗原-抗体反 应检测MRSA的存在情况。参见实施例7。

检测所述抗原-抗体复合物存在情况的方法包括但不限于：放射性免 疫分析、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹心免疫分析和侧流免疫谱测定。 抗原-抗体复合物的检测涉及使用直接或间接标记的抗体。上文描述了可 用的检测标签。所述方法是本领域技术人员广泛知晓的。例如，在ELISA 的情况下，将测试样本与本发明的单克隆抗体或蛋白质A特异性抗体接 触，所述抗体包被在微量滴定板、膜、测试条等之上。在一个实施方案 中，可用本发明的单克隆抗体或用蛋白质A特异性抗体包被微量滴定板 孔，并且用BSA封闭未占据的结合位点。用测试样本孵育所述包被的孔， 并对其检查以确定抗原-抗体复合物的存在情况。可如上所述将所述抗体 标记，用于检测。

具体地，如果使用夹心免疫分析和侧流免疫谱测定，可以使用从本 发明的单克隆抗体制备的抗体对进行MRSA检测。参见图8。这样的抗 体对可以是利用本发明的单克隆抗体之一的任何抗体。优选将从 KCLRF-BP-00202杂交瘤产生的单克隆抗体用作检测抗体，将从 KCLRF-BP-00203或KCLRF-BP-00204杂交瘤产生的单克隆抗体用作包 被抗体。

在本发明的一个实施方案中，通过选择单克隆抗体对并利用所述单 克隆抗体对，可以通过夹心免疫分析和侧流免疫谱测定实现MRSA检测。 具体地，进行了MRSA的有效检测，其中从KCLRF-BP-00202杂交瘤产 生的单克隆抗体被用作检测抗体，从KCLRF-BP-00203或 KCLRF-BP-00204杂交瘤产生的单克隆抗体被用作包被抗体。参见实施 例5。

本发明的MRSA检测试剂盒包含PBP2a特异性抗体和蛋白质A特 异性抗体。

所述PBP2a特异性抗体可以是与包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸 的PBP2a片段的多肽特异性结合的抗体。所述PBP2a特异性抗体优选是 本发明的单克隆抗体。

可用于本发明的所述试剂盒系统可包含但不限于：ELISA板、深插 入装置(deep-stick device)、免疫色谱测定、径向分隔免疫测定装置、流 过装置(flow-through device)等。优选可以使用以免疫色谱条或装置形 式提供的诊断试剂盒。在免疫色谱诊断中，测试血清中包含的抗原与结 合至胶体金颗粒的微量抗体反应。然后，当通过毛细作用迁移通过硝酸 纤维膜上的微孔时，所述抗原结合至捕获抗体从而在所述条上出现颜色， 使得通过肉眼可观察到阳性和阴性信号。

这样的试剂盒优选使用ELISA或侧流免疫谱测定。如前所述，当使 用夹心免疫测定和侧流免疫谱测定时，使用本发明的单克隆抗体制备的 抗体对可用于MRSA检测。

可用于本发明的试剂盒可以是但不限于包含以下组分的试剂盒：固 相支持物；本发明的单克隆抗体和蛋白质A特异性抗体；和ELISA反应 流体，其含有用于与抗原反应的酶标抗体溶液和用于发出酶反应信号的 染料试剂。更具体地，所述酶标抗体溶液可以是山羊抗小鼠Ig-HRP(合 适浓度下每孔50-150μl)。所述染料试剂可选自四甲基联苯胺(TMB)。终 止溶液可选自1N HCl和1N H₂SO₄。

本发明的用于MRSA检测的组合物包含PBP2a特异性抗体和蛋白质 A特异性抗体。

所述PBP2a特异性抗体可以是与包含具有SEQ ID NO：1的氨基酸 的PBP2a片段的多肽特异性结合的抗体。所述PBP2a特异性抗体优选可 以是本发明的单克隆抗体。

除了所述PBP2a特异性抗体和蛋白质A特异性抗体外，所述组合物 还可以包含用于免疫测定的载体、能够产生可检测信号的检测标签、溶 剂(resolvent)和清洗剂。此外，在标记物质是酶的情况下，所述组合物 还可包含底物和反应终止剂。合适载体的实例包括但不限于，可溶载体， 例如本领域已知的生理可接受的缓冲溶液(例如，PBS)；不可溶载体， 例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联葡聚 糖、多糖、大分子(包括铺在乳胶、纸、玻璃、金属、琼脂糖及其结合 物上的金属磁性微粒)。

如上所述，通过使用用于检测PBP2a的PBP2a特异性抗体和使用用 于检测蛋白质A的蛋白质A特异性抗体，本发明能够快速且准确地检测 含有PBP2a和蛋白质A二者的MRSA。

参考以下实施例进一步解释本发明。但是，这些实施例不应以任意 方式解释为限制本发明的范围。

<实施例1>

制备对MRSA中PBP2a特异的多克隆抗体

<1-1>确定PBP2a中的特异性位点

使用SIB BLAST NetworkService(ExPASy Proteomics Server， http://au.expasy.org/tools/blast/)来测量金黄色葡萄球菌PBP2a的种间同 源性。结果显示在图1中。

在图1a至1c中，绿色表示高同源性，所有显示绿色的部分都来自 具有PBP2a的细菌。对于具有PBP2a的细菌，使用SIB BLAST NetworkService(ExPASy Proteomics Server， http://au.expasy.org/tools/blast/)来确定显示低同源性的序列组。

如图2中所示，N末端显示低同源性，而C末端显示相对高同源性。 此外，在与转肽酶功能有关的C末端部分，观察到了相似PBP2a中的高 度同源性。因此，N末端部分(SEQ ID No：1)被选作PBP2a蛋白质中的 MRSA特异性位点。PBP2a的整个氨基酸序列在SEQ ID No：2中提供。

<1-2>PBP2抗原

在表1所示的条件下，对从MRSA菌落提取的基因DNA进行PCR。 使用如下表2中的PBP2a特异性引物。

表1：PCR条件

表2：PBP2a特异性引物

  正义   SEQ ID NO.3  5′-GGAATTCGGTATATATTTTTATGCTTC-3′   反义   SEQ ID NO.4  5′-TCTCGAGAGTACCTGAGCCATAATC-3′

使用限制性酶EcoR I和Xho I将988bp碱基的所得PCR产物克隆至 pET载体，然后表达PBP2a蛋白。电泳观察PBP2a蛋白，其结果显示在 图3中。图3显示了使用所述PBP2a特异性引物产生了约37kDA的蛋白。

<1-3>制备抗PBP2a的多克隆抗体

将来自实施例1-1的所述PBP2a重组蛋白腹膜内注射给6周的雌性 BALB/c小鼠(每只鼠注射50μg)。使用弗氏佐剂，将小鼠以1个月的间隔 免疫3次。然后，从尾收集血液，在14000rpm下离心2-3分钟以获得血 清上清液。从所述血清中获得包括PBP2a抗体的多克隆抗体。

通过其中孔被所述重组抗原包被的间接ELISA测量所述多克隆抗体 的抗体滴度。结果显示在表3和4以及图4中。His-凝固酶被用作对照， 目的是更好地确定抗PBP2a、不抗His的抗体滴度。

表3：多克隆抗体中抗His-PBP2a的抗体滴度

表4：抗His-凝固酶的多克隆抗体的抗体滴度

如表3和4以及图4中所示，最高抗体滴度来自于所述五只小鼠中 的#3小鼠。结合His-PBP2a的抗体显示了对His-PBP2a的高亲和性，但 显示了对His-凝固酶(阴性对照抗原)的低亲和性。

<实施例2>

制备对MRSA的PBP2特异的单克隆抗体

<2-1>制备杂交瘤

产生单克隆抗体的杂交瘤细胞产生自实施例1-3中的#3小鼠，所述 #3小鼠显示最高的抗PBP2a的多克隆抗体滴度。具体地，采集脾脏以得 到单细胞悬液。用RPMI 1640(Hyclone)洗涤所述悬液两次，使用台盼 蓝染色进行细胞计数。

至于待与所述脾细胞融合的细胞，使用了SP2/0或X63小鼠骨髓瘤 细胞系(ATCC CRL-1581，ATCC CRL-1580)。如对所述脾细胞进行的一 样，对所述骨髓瘤细胞进行洗涤和细胞计数。在将所述脾细胞和所述骨 髓瘤细胞的混合物(所述脾细胞与所述骨髓瘤细胞的比例为1∶5)离心之 后，去除上清液。在1分钟内逐渐加入1500ml预热的(37℃)50％聚乙二 醇。将样本静置1分钟。然后加入RPMI-1640(Hyclone)进行系列稀释。 随后将所述样本离心并用含有1×HAT的RPMI 1640(20％FBS，次黄嘌 呤-氨蝶呤-胸苷)悬浮。将所述溶液放在96孔板中(每孔100μl)，然后在 37℃在5％CO₂的培养箱中培养。

<2-2>分离和选择杂交瘤

在对所述杂交瘤(来自实施例2-1，骨髓瘤细胞与脾细胞融合)进行 HAT饲喂后，一旦在孔中出现菌落，收集200ul上清液。通过ELISA选 择单克隆抗体。

具体地，为了选择单克隆抗体，以重组PBP2a蛋白(每孔100ng) 包被ELISA板，然后向其中加入100ul上述上清液。用山羊抗小鼠 Ig-HRP进行ELISA。

通过ELISA筛选抗体阳性杂交瘤后，将这些杂交瘤移入含有HFCS (杂交瘤融合和克隆添加剂，Roche)的24孔板并在其中培养。一旦菌落占 据约所述的板50-70％，再次筛选抗体阳性杂交瘤，通过有限稀释克隆所 选的杂交瘤(单细胞克隆)。将所述杂交瘤扩展至显示产生抗体的最后克 隆，这样制备了如表5中所示的产生抗PBP2a抗原的单克隆抗体的三个 杂交瘤。

表5：产生抗PBP2a抗原的单克隆抗体的杂交瘤

  克隆#   1   6G10-46-63   2   9C6-52-40   3   17A10-2-2

所述杂交瘤于2009年2月18日保藏于韩国细胞系库，收到对于克 隆6G10-46-63的登记号为KCLRF-BP-00202；对于克隆9C6-52-40的登 记号为KCLRF-BP-00203；对于克隆17A10-2-2的登记号为 KCLRF-BP-00204。

<2-3>分离和纯化单克隆抗体

进行操作用于大量纯化从实施例2-2得到的杂交瘤克隆。腹膜内注射 0.5ml弗氏不完全佐剂，10天之后，将悬浮于0.5ml的PBS的5×10⁶个 杂交瘤细胞注射至腹膜腔内。

在注射杂交瘤后10至14天之间从腹膜腔内收集腹水并离心。加入 0.02％叠氮化钠作为防腐剂。根据单克隆抗体的同种型，使用蛋白质A 或G琼脂糖珠纯化所述抗体。将获得的所述三个不同克隆的单克隆抗体 分别标记为：′6G10′、′9C6′和′17A10′。

<实施例3>

ELISA确证所述单克隆抗体的抗原特异性

<3-1>ELISA确定所述单克隆抗体的PBP2a抗原特异性

将ELISA板(Maxisorp，Nunc)在每个稀释之后于37℃孵育一小时， 用于His-PBP2a包被，所加入的His-PBP2a以PBS系列稀释(初始为10ng/ 孔)。将所述板在37℃在3％BSA/PBS中继续孵育另外1小时，进行封 闭。

在用PBS稀释后，将实施例2-3的单克隆抗体加入所述孔中(每孔1ug) 并孵育一小时以使抗原抗体反应进行。然后，将所述孔洗涤3次。在以 Ig-HRP(辣根过氧化物酶，Dinona)处理结合的抗体后，将所述孔在37℃ 孵育30分钟。

在孵育之后，将所述孔再次洗涤3次。用TMB溶液作为颜色反应的 底物处理所述孔(每孔50ul)，然后使颜色反应进行10分钟。加入终止溶 液(每孔50ul)停止所述反应。对于根据本发明的实施方案制备的单克隆抗 体，在450nm测量显色强度。结果显示在图5a中。图5b显示这样的结 果，即其中所述孔被His-PBP2a(每孔10ng)包被，加入系列稀释的抗体(初 始为500ng/ml)。

如图5a和5b中所示，各个单克隆抗体显示出对抗原不同程度的结 合。

<3-2>ELISA确定所述单克隆抗体的蛋白质A抗原特异性

蛋白质A——一种金黄色葡萄球菌特异性蛋白——已知与抗体的Fc 区结合(Larsson A，1989；27(12)：2856-7.J Clin Microbiol./Lindmark R，1983；62：1-13.J.Immunol.Methods)。因 此，使用对蛋白质A低亲和性的抗体可以增加所述抗体的PBP2a特异性。 在这一点上，本发明人通过ELISA检查了实施例2-3中制备的单克隆抗 体与蛋白质A结合的程度。

将来自金黄色葡萄球菌的蛋白质A(Fluka Inc.)以PBS系列稀释(初 始为100ng/孔)加入至Maxisorp板(Nunc.)中，然后将其在每个稀释后在 37℃孵育1小时，进行包被。然后，在37℃在3％BSA/PBS中孵育另外 1小时，进行封闭。将从实施例2-3获得的单克隆抗体稀释后以1ug/孔加 入上述制备的孔。将所述孔孵育1小时，使得抗原-抗体反应被诱导，然 后洗涤三次。在以Ig-HRP(辣根过氧化物酶，Dinona)处理结合的抗体后， 将所述孔在37℃孵育30分钟。然后用TMB溶液(每孔50ul)作为底物 处理所述孔进行颜色反应，使反应进行10分钟。通过加入终止溶液(每 孔50ul)来终止所述反应。对于根据本发明的实施方案制备的单克隆抗 体，在450nm下测量显色强度。结果显示在图6中。

图6显示，各个单克隆抗体显示出不同程度的对蛋白质A的特异性， 表明使用本发明实施方案的单克隆抗体的免疫测定的能够不受蛋白质A 影响地进行。

<实施例4>

MRSA检测

<4-1>从MRSA类细菌分离细胞裂解物

对于本实施例，提供了由Chungbuk National University Hospital分 离/鉴定的细菌株。用PBS将所述细菌洗涤2次，然后悬浮在细菌裂解缓 冲液(B-PER buffer，Pierce)中孵育30分钟。然后，在-70℃进行2次冻融 步骤。然后将所述细胞在14,000rpm下离心25分钟。从离心后收集的上 清液中获得每个细菌株的裂解液。进行Bradford测定以定量蛋白水平， 其结果显示在下表6中。

表6：细菌裂解物的吸光度和浓度

<4-2>以免疫印迹测定进行MRSA检测

进行免疫印迹测定以测试从实施例2-3得到的单克隆抗体是否可以 用于检测MRSA、MSSA和MS-CNS中的PBP2a。

详细说明如下。在10％SDS-PAGE(1ug/泳道)上电泳金黄色葡萄球 菌的裂解蛋白，将其电转移至硝酸纤维素膜上。然后，在室温下在5％ BSA/PBS中孵育1小时，以停止不存在蛋白质区域的反应。加入以PBS 稀释的实施例2-3的单克隆抗体(1ug/ml)，将所述膜继续孵育1小时以诱 导抗原-抗体反应，然后洗涤3次。在以Ig-HRP(辣根过氧化物酶，Dinona) 处理所结合的抗体后，将所述膜在37℃孵育30分钟，洗涤3次。用针对 反应酶的ECL(增强的化学发光，PIERCE)处理后，将所述膜曝光至X- 射线胶片。结果显示在图7a中。

如图7a中所示，约70kDa PBP2a仅在MRSA中出现，这表明MRSA 可使用本发明实施方案制备的单克隆抗体有效地检测。

<4-3>以ELISA测定进行MRSA检测

将ELISA板(Maxisorp，Nunc)在每个稀释之后于37℃孵育1小时， 用于MRSA裂解物包被，所加入的MRSA裂解物以PBS系列稀释(初 始为10ng/孔)。将所述板在3％BSA/PBS中在37℃继续孵育1小时，进 行封闭。在以PBS稀释后，将实施例2-3的单克隆抗体加入所述孔中(每 孔1ug)并孵育1小时，以使抗原-抗体反应进行。

然后，将所述孔洗涤3次。在以Ig-HRP(辣根过氧化物酶，Dinona) 处理所结合的抗体后，将所述孔在37℃孵育30分钟。在孵育后，将所述 孔再洗涤3次。以TMB溶液(每孔50ul)作为底物处理所述孔进行颜色 反应，使反应进行10分钟。通过加入终止溶液(每孔50ul)停止所述反 应。在450nm下测量所述颜色反应的强度。结果显示在图7b中。

图7b显示，尽管所述单克隆抗体之间存在差异，但是由实施例2-3 得到的单克隆抗体表现出对MRSA的亲和性高于对MSSA的亲和性。

<实施例5>

使用抗体对进行MRSA检测

<5-1>选择单克隆抗体对

为了将抗体应用于免疫测定，例如夹心ELISA和快速试剂盒，抗体 必须成对地(不是由单个抗体)识别所给的抗原(After R.A.Goldsby，T.J. Kindt，B.A.Osborne，Kuby Immunology，4th ed.(W.H.Freeman and Company，2000)，p.162)(参见图8a和8b)。

为了确定最合适的识别PBP2a抗原的抗体对，将实施例2-3中得到 的单克隆抗体以PBS稀释作为捕获抗体(每孔100ng)，在37℃孵育1 小时并包被在Maxisorp板上。然后，将所述孔在3％BSA/PBS中孵育 1小时并封闭。将以PBS系列稀释的His-PBP2a以10ng/孔的量加入所述 孔中，在37℃孵育1小时，然后结合至所述包被的抗体。

将所述孔洗涤3次后，将与生物素结合的单克隆抗体以PBS 1∶1000 稀释，以100ul/孔的量加入所述孔中，孵育1小时以使与所述抗原结合。

在将所述板洗涤3次后，将所述抗原-抗体复合物在37℃孵育30分 钟，同时用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)处理。再次洗涤3次后， 以TMB溶液(每孔50ul)作为反应酶的底物处理所述孔，使底物-酶反应进 行10分钟。加入终止溶液(每孔50ul)终止所述反应。在450nm测量 所述颜色反应的强度。结果显示在图9a中。

图9a显示，来自从实施例2-3得到的单克隆抗体的抗体对可以有效 地识别PBP2a抗原。具体地，当6G10单克隆抗体被用于检测并且9C6 单克隆抗体用于包被时，对于所给相同浓度的His-PBP2a的检测效率最 高。

图9b显示，当6G10单克隆抗体没有结合至生物素而直接与HRP结 合用于检测目的时，对His-PBP2a的亲和性随用于包被的抗体类型而异。

图9b表明，抗体对表现出对所给(相同)浓度的His-PBP2a的亲和 性差异，但本发明的单克隆抗体能够有效地识别PBP2a抗原。

图9c显示在His-PBP2a的每个系列稀释后所述抗体对结合亲和性的 变化。

图9c表明，在系列稀释后观察到了抗体对的结合亲和性的差异，但 本发明的单克隆抗体能够有效地识别PBP2a抗原。

<5-2>使用抗体对以夹心ELISA进行MRSA检测

将Maxisorp板(Nunc.)在每个稀释之后于37℃孵育1小时，用于作为 捕获抗体的单克隆抗体包被，所述单克隆抗体用PBS系列稀释(初始为 100ng/孔)。将所述板在3％BSA/PBS中于37℃继续孵育1小时，进行封 闭。将在PBS中系列稀释的实施例4-1的MRSA和MSSA的裂解物加入 所述孔中(初始为100ng/孔)，并且在每个稀释后在37℃孵育1小时以使 它们与所述包被抗体结合。

在3次洗涤后，将实施例2-3得到的′6G10′单克隆抗体结合至HRP (辣根过氧化物酶)。然后，将所述抗体以PBS 1∶1000稀释加入所述孔中 (100ul/孔)，将所述孔孵育1小时进行抗体-抗原结合。

再次洗涤3次后，以TMB溶液(每孔50ul)作为颜色反应的底物处理 所述孔10分钟。然后，使底物-酶反应进行10分钟。加入终止溶液(每 孔50ul)终止所述反应。在450nm测量所述颜色反应的强度。结果显示 在图10a中。

图10a表明，从实施例2-3得到的抗体可有效地将MRSA与MSSA 区分开，从而有效地检测MRSA。具体地，如果‘6G10’单克隆抗体被用 作检测抗体且‘17A10’单克隆抗体被用作包被抗体，那么检测效率最高。

图10b显示的结果为，通过使用‘6G10’单克隆抗体作为检测抗体且 ‘17A10’单克隆抗体作为包被抗体，对4株MRSA、1株MR-CNS、2株 MSSA和2株MS-CNS检测的PBP2a存在情况。

图10b显示，对于其中存在PBP2a的MRSA和MR-CNS，得到了大 值。

<5-3>使用抗体对以免疫色谱测定进行MRSA检测

测试了本发明实施方案的单克隆抗体对是否能够以快速试剂盒形式 用于侧流免疫谱测定，所述试剂盒使用金缀合的检测抗体。

步骤详细描述如下。将在从本发明的单克隆抗体中选择的所述捕获 抗体包被在所述膜上，将所述检测抗体与金缀合，干燥并组装至所述装 置。在所述组装的装置中，处理100ul如从实施例4-1所得到的每个细胞 系的裂解物。20分钟后观察到的结果显示在图11中。

如图11所示，使用所述单克隆抗体对，在MRSA和MR-CNS(都 有PBP2a)观察到了所述测试株系(T)的阳性反应。

<实施例6>

使用蛋白质A特异性多克隆抗体进行MRSA检测

<6-1>选择蛋白质A特异性多克隆抗体

由于蛋白质A对很多抗体的Fc区有亲和性，在通过使用抗体检测蛋 白质A可能会出现困难。但是，已知来自鸡的蛋白质A抗体不呈现这种 对蛋白质A的结合。因此，如下的实施例使用来自鸡的抗-蛋白质A抗体 (ABCPA-0500，Arista)进行(Larsson A，1989；27(12)：2856-7.J Clin Microbiol./Lindmark R，J.1983；62：1-13.J.Immunol.)。

<6-2>以夹心ELISA进行MRSA检测

将Maxisorp板(Nunc.)在每个稀释后于37℃孵育一个小时，用于作为 捕获抗体的单克隆抗体包被，所述单克隆抗体以PBS系列稀释(初始为 100ng/孔)。将所述板在3％BSA/PBS中在37℃继续孵育1小时，进行 封闭。将在PBS中系列稀释的来自实施例4-1的裂解物(初始为100ng/ 孔)加至所述孔中，在每个稀释后在37℃孵育1小时，以与所述包被的 抗体结合。

在3次洗涤后，将兔抗-蛋白质A-HRP抗体(Sigma)以PBS 1∶1000 稀释加入所述孔中(100ul/孔)并孵育1小时，进行抗原-抗体结合。

再次洗涤3次后，以TMB溶液(每孔50ul)作为颜色反应的底物处理 所述孔10分钟。然后，使底物-酶反应进行10分钟。加入终止溶液(每 孔50ul)终止所述反应。在450nm测量所述颜色反应的强度。结果显示 在图12中。

如图12所示，在MRSA和MR-MSSA(两个菌株都存在蛋白质A) 中观察到了高水平的蛋白质A。

<6-3>免疫色谱测定

测试了在实施例6-1中举例说明的抗鸡蛋白质A的多克隆抗体对是 否可以以快速试剂盒形式用于侧流免疫谱测定，所述试剂盒使用金缀合 的检测抗体。

步骤详细描述如下。将在从本发明的单克隆抗体中选择的所述捕获 抗体包被在所述膜上，将述检测抗体与金缀合，干燥并组装至所述装置。 在所述组装的装置中，处理100ul如从实施例4-1所得到的每个细胞系的 裂解物。20分钟后观察到的结果显示在图13中。

如图13所示，仅在MRSA和MSSA(都有蛋白质A)观察到了所述 测试株系(T)的阳性反应。

<实施例7>

通过使用所述单克隆抗体和蛋白质A特异性多克隆抗体进行MRSA 检测

在成对的孔系统中，将抗-PBP2a单克隆抗体(以PBS系列稀释，初 始为100ng/孔)加至一组孔中，而将抗-蛋白质A多克隆抗体(以PBS系列 稀释，初始为100ng/孔)加至另一组孔中。对于抗原包被，将Maxisorp 板(Nunc.)以所述抗体在每个稀释后在37℃孵育1小时。将所述板在3％ BSA/PBS中在37℃继续孵育1小时，进行封闭。将用PBS系列稀释的来 自实施例4-1的裂解物(初始为100ng/孔)加至所述孔中，并在每个稀释 后在37℃孵育1小时以使与所述包被抗体结合。

在3次洗涤后，将用PBS以1∶10,000稀释的′6G10′抗-PBP2a单克隆 -HRP抗体加至所述PBP2a孔中(每孔100ul)。同时，将用PBS以1∶10,000 稀释的兔抗-蛋白质A-HRP抗体加至所述蛋白质A孔中(每孔100ul)。再 次洗涤3次后，以TMB溶液(每孔50ul)作为颜色反应的底物处理所述孔， 使反应进行10分钟。加入终止溶液(每孔50ul)终止所述反应。在450nm 测量所述颜色反应的强度。结果显示在图14a中。

如图14a所示，MRSA显示出高程度的对PBP2a和蛋白质A抗原二 者的反应。

此外，建立了用于进行侧流免疫谱测定的装置，其中包被抗体和金 缀合物中的每一个均被组装为适于PBP2a和蛋白质A。在所述装置中， 处理100ul如从实施例4-1所得到的每个细胞系的裂解物。20分钟后观察 到的结果显示在图14b至14e中。

如图14b至14e所示，MRSA显示出高程度的对PBP2a和蛋白质A 抗原二者的反应。